Summary
걱정의 정량 분석 (포스터 공명 에너지 전송) 신호를 포함하는 새로운 방법을 효소 반응 속도론을 연구에 설명되어 있습니다.
Abstract
ubiquitin 또는 ubiquitin 같은 단백질 (Ubls)과 단백질의 치료 posttranslational 수정은 널리 동적으로 단백질의 활동을 조절하고 다양한 생물학적 과정에서 다양한 역할을 수행하는 데 사용됩니다. 예를 들어, 스모는 covalently 세포주기 조절, 세포 생존과 죽음, DNA 손상 반응 및 스트레스 반응 1-5 등 많은 세포 과정에 중요한 역할을 갖춘 대형 번호 또는 단백질을 수정합니다. SENP는 스모 특정 단백 분해 효소로, 스모 전구체의 성숙에 endopeptidase 또는 isopeptidase의 기능은 대상 단백질에서 스모를 제거하고 SUMOylation주기에게 1,3,6,7를 새로 고칠 수 있습니다.
효소의 촉매 효율이나 특이성은 가장 운동 상수, K 고양이 / K M의 비율이 특징입니다. 여러 연구에서, 스모 - SENP 쌍의 운동 매개 변수가 힘이에요, polyacrylamide 젤 기반 서양 얼룩 등의 다양한 방법에 의해 결정되었습니다ioactive - 라벨 기판, 형광 화합물 또는 단백질이 기판 8-13를 표시. 그러나, "네이티브"단백질을 사용하지만 polyacrylamide - 젤 기반 기술은 힘든 및 기술적 요구이며, 그 즉시 자세한 정량 분석에 자신을 빌려하지 않습니다. ACC (7 - 아미노-4-carbamoylmetylcoumarin) 또는 AMC (7 - 아미노-4-methylcoumarin) 형광과 tetrapeptides 또는 단백질을 사용하여 연구에서 K 고양이 / K M을 획득 자연 기판보다 크기 낮은 최대 두 명령 중 하나였다 또는 명확하게 SENPs의 ISO와 endopeptidase 활동을 차별화 할 수 없습니다.
최근, 아가야 기반의 단백 분해 효소 assays는 시안 형광 단백질의 걱정 쌍 (CFP)와 황색 형광 단백질 (YFP) 9,10,14,15과 deubiquitinating 효소 (DUBs) 또는 SENPs을 연구하는 데 사용되었습니다. 단백 분해 효소 교류를위한 신호 모니터를 안달을 위해 기증 방출에 대한 수용체 방출의 비율은 양적 매개 변수로 사용되었다tivity 결정. 그러나,이 방법은 수용체 및 공여체 자기 형광하여 수용체와 기증자 방출 파장에서 신호 교차 contaminations을 무시하기 때문에 정확한 아니 었습니다.
우리는 SENP1에 의해 사전 SUMO1 성숙의 운동 매개 변수를 결정하는 매우 중요한 소설 및 정량 걱정 기반의 단백 분해 효소 분석을 개발했습니다. 엔지니어링은 크게 향상 걱정 효율성과 형광 양자 수율과 쌍 CyPet 및 YPet을 걱정 CyPet - (사전 SUMO1) YPet 기판 16을 생성하는 데 사용되었습니다. 우리는 차별화와 기증자와 수용체에 의해 공헌 각각의 수용체와 방출 파장에서 걱정 절대 형광 신호를 정량화. K 고양이 / K M의 값은 SENP1의 X10 7 M -1의 -1은 일반적으로 효소 운동 매개 변수 계약에 사전 SUMO1 방면 (3.2 ± 0.55)로 얻은 것입니다. 따라서이 방법은 유효하고 사용할 수 있습니다SA 일반적으로는 다른 프로테아제를 특징 접근한다.
Protocol
1. 플라스미드 구조
- PCR에 의해 유전자의 오픈 읽기 프레임을 증폭하고, PCRII-TOPO 벡터로 PCR 제품을 복제.
- 시퀀싱하여 제품을 확인하고, 복제 cDNA 인코딩 CyPet - (사전 SUMO1) YPet, CyPet - SUMO1, YPet 및 N-터미널 hexahistidine 태그와 pET28 (b)는 벡터에 SENP1의 촉매 도메인입니다.
2. 단백질 표현과 정화
- pET28로 변형 BL21 (DE3)의 대장균 세포를 변환 (B) CyPet - (사전 SUMO1) YPet, CyPet - SUMO1, YPet 및 SENP1의 촉매 도메인을 인코딩 벡터.
- 600 나노 미터에서 0.5의 광학 밀도에 도달 할 37 ° C (250 rpm으로 흔들어)에서 3 시간에 2xYT 매체에 변형 박테리아를 성장.
- 이소 프로필-β-D-thiogalactoside (IPTG) (최종 농도)은 단백질 식을 유도 25 16 시간에 흔들 ° C를 200 rpm으로하여 100 μM을 추가합니다.
- centrifug하여 박테리아를 수확4에 10,000 RPM에서 ation ° 5 분, 20 MM 트리스 - HCL (산도 7.4), 50 MM NaCl, 5 MM 이미 다졸의 버퍼에서 그들을 resuspend을위한 C.
- MiSonics 4000 sonicator를 사용하여 25 W의 전력 설정에서 5 초 간격으로 10 분의 세포를 Sonicate와 4에서 35,000 XG에서 원심 분리하여 수집 ° C를 30 분에.
- 1 L의 문화 500 ML 니켈 NTA 비즈과 열을 설정하고 열에 표면에 뜨는을 전송합니다.
- 20 MM 트리스 - HCL (산도 7.4), 500 MM NaCl, 그리고 두 번 10 MM 이미 다졸의 버퍼로 수지를 씻으십시오.
- 20 MM 트리스 - HCL (산도 7.4), 500 MM NaCl, 500 MM 이미 다졸, 20 MM 트리스 - HCL (산도 7.4), 50 MM NaCl, 1 MM dithiothreitol (DTT)에서의 버퍼로 투석의 버퍼와 Elute 단백질 4 ° C 하룻밤.
- 브래드 포드 분석하여 정화 단백질의 농도를 결정합니다. 단백질 농도 측정을위한 대체 방법은 SDS-PAGE 젤 전기 영동이 될 한 후 Coomassie 파란색으로 물들 예정 영상과 함께 다음양적.
3. 양적는 스펙트럼 분석 안달
- 분석을위한 일반적인 전략은 (그림 1) 신호 걱정을 기반으로했다. 초조 한 쌍은 CyPet 및 YPet은 사전 SUMO1 때문에, 각각 N-및 C-말단에 태그되었습니다. SENP1 cleaves는 퓨전 SUMO1의 C-말단에있는 Gly-Gly 사이트에서 단백질 CyPet - (사전 SUMO1) YPet하고, 따라서 YPet와 스모 꼬리를 출시. 이 신호가 CyPet에서 방출의 증가와 CyPet 여기 파장에서 YPet의 방출의 극적인 감소의 결과로, 중단되어 걱정.
- 절대 걱정 유도 YPet의 방출, CyPet 직접 방출하고 YPet 직접 배출 (그림 : 530 nm의에서 파장의 빛에 의해 414 nm 정도의 총 형광 방출 CyPet - (사전 SUMO1) YPet을 흥분 시절 세 번의 소스에서 파생 될 수 2).
곳 FL 414분의 530 </ 서브> 414 nm의에서 흥분 530 나노 미터의 총 형광 방출는, FL는 걱정은 절대이 신호를 안달이고, FL CyPet (cont)은 414 nm의에서 흥분 CyPet 직접 방출하며, FL YPet (cont)는 YPet입니다 414 nm의에서 흥분 할 때 방출을 지시. 의 첨자 (cont)는 기부금을 의미합니다.
- α의 일정한 비율로 414 nm의에서 흥분 할 때 530 nm의에서 CyPet의 직접 방출 475 nm의에서의 방출에 비례했다. CyPet - SUMO1은 50의 농도, 100, 200, 500, 750 nm의에서 준비 1 ㎜되었습니다 , 그리고 475와 530 nm의에서 배출은 α (그림 3-1) 결정하기 위해 414 나노 미터의 여기 이후에 측정 하였다.
- β의 일정한 비율로 475 nm의에서 흥분 할 때 414 nm의에서 여기에 따라 530 nm의에서 YPet의 직접 배출량은 530 nm의에서의 방출에 비례했다. YPet 50의 농도, 100, 200, 500, 750에 준비되었다샘플 β (그림 3-2)을 결정하기 위해 414의 파장과 475 nm의에 의해 흥분했을 때 차 1,000 NM 및 530 nm의에서 방출이 측정되었다.
- CyPet - (사전 SUMO1) YPet은 SENP1에 의해 소화되었을 때, 절단은 CyPet - SUMO1과 YPet과 SUMO1 꼬리를 발표했다. 화합물은 414 nm의에서 흥분했을 때, 530 nm의 (FL '414분의 530)에서 형광 방출이 감소되었지만 여전히 같은 세 부분으로 나눌 수 있습니다 :
FL '414 nm의에서 흥분하면 414분의 530이 소화 후 530 nm의에서 총 형광 방출이며, FL'어디 남은 절대 걱정 신호 걱정, FL 'CyPet (414분의 475)이 때 소화 후 475 nm의에서 CyPet 방출입니다 414 나노 미터 (여기서 CyPet 방출이 두 부분에서입니다 CyPet - (사전 SUMO1) YPet 소화되지 않은 및 CyPet-SUMO1을 소화)에 흥분하고, FL YPet(475분의 530)는 CyPet - (사전 SUMO1) YPet은 소화 여부를 일정 475 나노 미터에 흥분 YPet 방출입니다.
- SENP1로 소화 한 후, 나머지는 방출 (FL의 '안달가)입니다 초조해 :
C는 CyPet - (사전 SUMO1) YPet하고, x의 총 농도입니다 것은 소화의 농도 CyPet - (사전 SUMO1) YPet입니다.
- 모든 항목을 결합하여, 414 nm의 (FL '414분의 530)의 흥분에 따라 530 나노 미터에서 감지 형광 방출은 다음과 같습니다 :
4. 효소 키네틱 연구에 대한 걱정 기반의 단백 분해 효소 분석
- CyPet - (사전 SUMO1) YPet은 (20 MM 트리스 - HCL (산도 7.4), 50 MM NaCl, 0.1 %의 버퍼에 37 ° C에서 SENP1의 촉매 도메인 incubated되었습니다 V /V) 십대 초반-20 80 ML의 총 양이 1 ㎜의 DTT와 384도 판으로 이동.
- 실행은 15 초 간격으로 5 분을위한 형광 multiwell 판 리더의 414 nm의에서 여기 이후 475과 530 nm의에서 형광 방출을 측정하여 실시되었다.
- 반응 속도 (V)가 같은 기판 (S)의 양의 변화와 상관되었습니다
- 제품의 농도가로 0에서 기하 급수적으로 증가 [S] 0 (원래 기판 농도) 때 t = 0 :
- t = 0은 원래 속도 (V 0) 경우 :
- concSENP1의 entration가 해결되었습니다, 그리고 CyPet - (사전 SUMO1) YPet의 농도는 Michaelis-Menten 방정식에 필요한 효소의 농도보다 100 배 이상에서 증가되었다.
- 형광 판독의 모든 정량 안달 분석 방법으로 분석하고 Michaelis-Menten 방정식에 맞게 GraphPad 프리즘 V 소프트웨어에 역모를했다. 비선형 회귀은 스프레드 시트 프로그램 (Microsoft Excel과 같은)과 같은 일반적인 소프트웨어 패키지의 도움으로 수행 할 수 있습니다.
5. 대표 결과
SENP1의 사전 SUMO1의 성숙이 과정에서 475과 530 nm의에서 형광 신호의 변화를 모니터링하여 결정 할 수 있습니다. 결과는 보여 그 기판 - 복용에 의존 방식으로 SENP1의 사전 SUMO1 소화의 속도 (그림 4). 이 제안 사전 SUMO1의 성숙을위한 SENP1의 촉매 도메인 전시 우수한 활동을 그. 초기 reac기의 속도는 다른 기판 농도 (표 1) 위의 분석에 의해 계산되었다.
K 고양이 / K M 비율은 일반적으로 하나의 기판 또는 다른 기판과 특정 효소와 다른 효소의 효율성을 비교하는 데 사용됩니다. K M과 V 맥스 해당하는 다양한 초기 속도를, 음모에 의해 Michaelis-Menten 방정식에서 구할 수 있습니다 . CyPet - (사전 SUMO1) YPet는 (그림 5) K 고양이가로 얻은의 다른 농도로 :
위의 분석에 따르면, 계산 된 K M은 0.21이었다 ± 0.04 μM, K의 고양이는 ± 0.28 초 -1 6.90이었고, K 고양이 / K M 비율은 (± 0.55 3.2)였습니다 X10 7 M -1 > S -1.
그림 1. SENP의 사전 SUMOs 성숙을위한 걱정 기반의 단백 분해 효소 분석 그래프.
그림 2. 기증자, 수용체와 걱정의 공헌 등의 형광 신호의 정량 분석. CyPet-414 나노 미터에서 여기에 따라 (예정 SUMO1) YPet. FL CyPet (414분의 530)에서 방출 스펙트럼의 해부 414 nm의 여기에 따라 530 nm의에서 CyPet의 방출, FL가 걱정하는 걱정 유발 YPet의 414 nm의 여기에 따라 530 nm의에서 방출, 그리고 FL YPet이 (414분의 530) 414 nm의 여기에 따라 530 nm의에서 YPet의 방출이다입니다.
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그림 3. 방향으로 방출 계수 α와 β의 계산.
그림 4. SENP1의 촉매 도메인의 다른 비율에 의해 소화 CyPet - (사전 SUMO1) YPet의 정량 분석. 반응은 처음 5 분 안에 모니터했다.
그림 5. SENP1로 CyPet - (사전 SUMO1) YPet의 소화 Michaelis-Menten 그래픽 분석. 데이터는 역모와 GraphPad 프리즘 V 및 비선형 회귀하여 분석 하였다.
| [S] (μM) | V 0 (μM / s)의 | ||
| 0.115 | 0.0023 ± 0.00005 | 0.214 | 0.0028 ± 0.00004 |
| 0.407 | 0.0033 ± 0.00007 | ||
| 0.594 | 0.0037 ± 0.00013 | ||
| 0.725 | 0.0043 ± 0.00012 | ||
| 1.471 | 0.0051 ± 0.00036 | ||
| 1.899 | 0.0050 ± 0.00031 | ||
| 2.300 | 0.0050 ± 0.00062 |
표 1. SENP1에서 미리 SUMO1의 성숙의 초기 속도 결정. 각 기판 농도에는, 4 샘플은 소화를 측정하기 위해 사용되었다. 표준 편차는이 네 샘플 변형에서 왔어.
| K M (μM) | K 고양이 (S-1) | K 고양이 / K M (M -1 • S-1) |
| 0.21 ± 0.04 | 6.90 ± 0.28 | 3.2 ± 0.55 × 10 7 |
표 2. 양적으로 SENP1에서 미리 SUMO1의 성숙의 키네틱 매개 변수 분석을 초조해. 표준 편차는 각 기판 농도에 포함 된 네 개의 샘플에서 왔어.
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Discussion
걱정 기술은 SENP1 9 미리 SUMO1의 성숙을 연구하는 데 사용되었습니다. CFP-YFP는 기증자의 배출량에 대한 수용체의 비율입니다 걱정 쌍과 ratiometric 분석으로 사용 된 운동 속성을 특징하는 데 사용되었다. 그러나, 기존의 ratiometric의 자체 형광는 분석을 걱정 기증자와 수용체 전혀 고려가 없습니다. 비율은 직접 소화 기판의 양이 서로 관련이되지 않습니다.
여기 SENP1에 의해 사전 SUMO1의 성숙의 운동을 연구하는 개발 고감도 걱정 기반의 단백 분해 효소 분석을보고합니다. 이전 ratiometric 접근 대조적으로, 우리는 근본적으로 기증자와 수용체에서 자기 형광의 정량적 기여를 결정하여 운동 매개 변수를 도출하기 위해 운동 분석 및 실험 절차에 대한 신호를 걱정의 새로운 이론과 방법을 개선하고, 실제는 초조해 - 유도 수용체의 방출. Ratiometric 분석이 작업을 수행 할 수 없습니다.기증자와 수용체의 자체 형광 방출의 무지는 걱정 신호와 기증자의 방출의 과대 평가 될 수 있습니다. overestimations 크게 최종 K 고양이 / K M 비율 (ratiometric 분석을위한 3.81 X10 7 M -1의 -1, 3.2 X10 7 M -1의 -1의 정량 안달 분석하여)을 영향을 미치지 않을 수도 있지만, 효과는 더 속도 - 제한 단계와 효소의 억제제 효력을 결정하는 중요한 개별 매개 변수, K M (0.098 대 0.21 μM)와 K 고양이 (3.43 초 -1 대 6.90 S -1)를 공부할 때 분명.
우리가보고 방법은 프로테아제 속도론 매개 변수의 1 단계 분석하고 방사선 라벨거나 비용이 많이 드는 악기없이 오직 분자 복제 및 단백질 표현이 필요합니다. 한 단계 절차는 실험 절차를 간소화뿐만 아니라 많은 제한뿐만 아니라대안. 형광 태그 단백질은 일반적으로 세포에서의 자연 환경과 유사 수성 단계에 있습니다. 형광 강도는 널리 사용할 수 있습니다 일반적으로 형광 분광법이나 형광 플레이트 리더에 의해 결정될 수있다. 기존의 '젤 기반 "방법과 비교하여, 우리의 걱정 기반의 단백 분해 효소 분석은 증가 감도, 실시간 측정 및 필요한 적은 시간과 노동 등 여러 장점을 제공합니다. 또한, 단백 분해 효소 반응 속도론 매개 변수 결정의 방법론과 절차는 radioisotopes 또는 거친 화학 물질 등 환경 친화적 및 비 위험 물질입니다. 또한, 매우 민감한 걱정 기반의 분석은 이러한 프로테아제 억제제 검사와 같은 높은 처리량 생물 assays에 사용하실 수 있습니다. 운동 연구는 또한 억제제의 속성 (예를 들면 기가, IC50) 특성을 사용할 수 있습니다.
따라서 매우 민감한 정량은 초조해-BAS에드 단백 분해 효소 assays는 게놈 전체의 단백 분해 효소 - 기판 프로파일 및 억제 검사를 개발하는 강력한 접근 방식이 될 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 귀중한 조언 빅터 GJ 로저스 매우 감사하고 있습니다. 우리는 아주 가까운 공동 작업에이 연구에 도움 리아 그룹의 구성원 모두들 감사합니다. 이 연구는 국립 보건원 (JL에 부여 AI076504)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR II TOPO Kit | Invitrogen | K466040 | |
| 2xYT | Research Products Internationa.l Corp. | X15600 | |
| Ni-NTA Agrose | Thermo Scientific | 88222 | |
| Coomassie plus (Bradford) Assay Regent | Thermo Scientific | 23238 | |
| 384-well plate (glass bottom) | Greiner | 781892 | |
| FlexStation II 384 plate reader | Molecular Device |
References
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