Summary
FRET kantitatif analizi (Förster rezonans enerji transferi) sinyalleri içeren bir roman yöntemini enzim kinetiği çalışmaları için tanımlanmıştır.
Abstract
Ubikitin veya ubikitin-benzeri proteinler (Ubls) ile proteinlerin tersinir posttranslasyonel değişiklikler yaygın olarak dinamik bir protein aktivitesini düzenleyen ve çok biyolojik olarak farklı roller için kullanılır. Örneğin, SUMO kovalent hücre siklusunun regülasyonunda, hücre yaşam ve ölümü, DNA hasar cevabı ve stres yanıtın 1-5 gibi birçok hücresel süreçlerin önemli rolü olan bir büyük numarası veya proteinleri değiştirir. SENP, SUMO-spesifik proteaz olarak, SUMO öncüllerinin olgunlaşmasının endopeptidazla olarak veya isopeptidase gibi fonksiyonları hedef proteinleri SUMO kaldırmak ve sumoilasyon döngüsü 1,3,6,7 yenilemek için.
Bir enzimin katalitik etkinliği ya da en iyi seçicilik kinetik sabitler, k kedi / K M oranı ile karakterize edilir. Çeşitli çalışmalarda, SUMO-SENP çiftleri kinetik parametreleri rad, poliakrilamid jel tabanlı western-blot dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerle tespit edilmiştirioactive-etiketli substrat, floresan bileşik ya da protein alt tabaka 8-13 etiketli. Ancak, "yerli" proteinleri kullanılır ama poliakrilamid-jel tabanlı teknikler, zahmetli ve teknik olarak zor olan, kolayca ayrıntılı nicel analiz için kendilerini borç yoktur. ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) ya da AMC (7-amino-4-methylcoumarin) florofor ile tetrapeptides ya da proteinlerin kullanıldığı çalışmalar k kedi / K M edilen doğal substratlar göre büyüklük daha düşük en fazla iki sipariş ya idi veya açıkça SENPs ve iso-ve endopeptidazla faaliyetleri ayırt edemez.
Son zamanlarda, FRET tabanlı bir proteaz deneyleri mavi floresan protein FRET çifti (CFP) ve sarı floresan protein (YFP) 9,10,14,15 ile deubiquitinating enzimler (Dubs) ya da SENPs incelemek için kullanılmıştır. Proteaz ac için sinyal monitör FRET için donör emisyonu alıcı emisyon oranı ölçülebilir bir parametre olarak kullanılmıştırbilirlik belirlenmesi. Bununla birlikte, bu yöntem alıcı ve verici kendi flüoresans ile alıcı ve verici emisyon dalga boyunda çalışan sinyal çapraz bulaşma göz ardı edilir ve böylece doğru değildir.
Bu SENP1 ön-SUMO1 olgunlaşma kinetik parametrelerinin belirlenmesi için bir yeni ve son derece hassas kantitatif FRET bazlı Proteaz analiz geliştirilmiştir. Bir tasarlanmış, önemli ölçüde geliştirilmiş FRET verim ve floresan kuantum verimi ile çift CyPet ve YPet FRET CyPet-(pre-SUMO1)-YPet alt tabaka 16 oluşturmak için kullanılmıştır. Biz farklılaşmış ve verici ve alıcı tarafından katkı ve sırasıyla alıcı ve emisyon dalga boylarında FRET mutlak floresans sinyalleri sayılabilir. K kedi / K M değeri SENP1 x10 7 M -1 s -1 genel enzim kinetik parametreler ile uyum içindedir ön SUMO1, karşı (3.2 ± 0.55) olarak elde edildi. Bu nedenle, bu yöntem geçerlidir ve bir de kullanılabilirsa genel hem de diğer proteazlar karakterize yaklaşım.
Protocol
1. Plazmid Oluşumlar
- PCR ile genlerin açık okuma çerçeveleri Kuvvetlendirme ve PCRII TOPO-vektörüne klonlanması PCR ürünlerinin.
- Dizilenerek teyit ürünleri, ve klon kodlayan cDNA CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet ve bir N-terminal hexahistidine etiket ile pET28 (b) vektörü içine SENP1 katalitik etki.
2. Protein Ekspresyonu ve Saflaştırılması
- PET28 ile suşu BL21 (DE3) ve Escherichia coli hücreleri Transform (b) CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet ve SENP1 bir katalitik etki kodlayan vektörler.
- 600 nm'de 0.5 bir optik yoğunluğa ulaşmak üzere 37 ° C (250 rpm'de sallama), 3 saat boyunca 2xYT ortamı içinde yeniden izlenmesiyle dönüştürülmüş bakteriler yetiştirilir.
- Izopropil-β-D-thiogalactoside (IPTG) (nihai konsantrasyon) proteini ifade etme indüklemek ve 25 saat için sallayın 16 ° C ile 200 rpm ile 100 uM ekleyin.
- Centrifug bakterilerin hasat4 10.000 rpm'de 5 dk tirme ° ve 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 50 mM NaCl, 5 mM imidazol ve bir tampon içinde tekrar süspansiyon için onları C.
- MiSonics 4.000 sonikatör kullanılarak 25 W bir güç ayarında 5 saniye aralıklarla 10 dakika için hücreler sonikasyon ve 4 35,000 x g'de santrifüj ile bunları toplamaya ° C'de 30 dakika süre ile.
- 1 L kültür için 500 ml Ni-NTA boncuklar ile sütun ayarlama ve sütuna süpernatant aktarmak.
- 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 500 mM NaCl, ve iki defa 10 mM imidazol tampon ile reçine yıkanır.
- 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 500 mM NaCl, 500 mM imidazol ile ve 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 50 mM NaCl ve 1 mM ditiotreitol (DTT) de bir tampon içine diyaliz tamponu ile elute protein 4 ° C gecede.
- Bradford tahlili ile saflaştırılmış protein konsantrasyonu belirlenir. Protein konsantrasyonu ölçümleri için alternatif yöntem SDS-PAGE jel elektroforezi olmak ve sonra Coomassie mavisi ile boyandı olacak görüntüleme ile takipniceliksel.
3. Kantitatif Spektrum Analizi FRET
- Tahlil için genel strateji (Şekil 1) sinyalizasyon Fret dayanmaktadır. FRET çifti, CyPet ve YPet, ön-SUMO1, sırasıyla N-ve C-termini ile etiketlendi. SENP1 keser füzyon SUMO1 en C-terminusunda Gly-Gly yerinde protein CyPet-(pre-SUMO1)-YPet ve, böylece, YPet ile SUMO kuyruk serbest bırakır. Sinyal CyPet gelen emisyon artış ve CyPet dalgaboyu az YPet emisyon dramatik bir azalma ile sonuçlanan, bozulur FRET.
- Mutlak FRET indüklenen YPet emisyon, CyPet doğrudan emisyon ve YPet doğrudan emisyon (Şekil: 530 nm dalga boyunda ışık ile 414 nm, toplam floresans emisyon CyPet-(pre-SUMO1)-YPet heyecanlı zaman üç kaynaktan elde edilebilir 2).
nerede FL 530/414 </ Sub> 414 nm'de uyarıldığı 530 nm'de toplam floresans emisyonu, FL FRET mutlak sinyal FRET olduğunu, FL CyPet (devam) 414 nm'de heyecanlı CyPet doğrudan emisyon ve FL YPet (devam) YPet olduğunu 414 nm'de uyarıldığı zaman emisyon yönlendirebilirsiniz. Ve simge (devam) katkı anlamına gelir.
- Α sabit bir oran ile 414 nm'de uyarıldığı zaman 530 nm CyPet arasında doğrudan emisyonu 475 nm'de emisyon orantılı idi. CyPet-SUMO1 50 konsantrasyonları, 100, 200, 500, ve 750 nM hazırlanan ve 1 mM edildi ve 475 ve 530 nm emisyon α (Şekil 3-1) belirlemek için 414 nm'de uyarılma sonrasında ölçüldü.
- Β sabit bir oran ile 475 nm'de uyarıldığı zaman 414 nm uyarma altında 530 nm'de YPet arasında doğrudan emisyonu 530 nm'de emisyon orantılı idi. YPet 50 konsantrasyonları, 100, 200, 500, 750 hazırlandıörnekleri β (Şekil 3-2) belirlemek için 414 dalga boylarında ve 475 nm ile heyecanlı iken nd 1.000 nM ve 530 nm'de emisyon ölçüldü.
- CyPet-(pre-SUMO1)-YPet SENP1 tarafından sindirilir zaman, dilinim CyPet-SUMO1 ve YPet ile SUMO1 kuyruk yayımladı. Bileşik 414 nm'de uyarıldığı zaman, 530 nm (FL '530/414) de floresans emisyonu azalmış ama hala gibi üç bölüme ayrılabilir:
FL '414 nm'de uyarıldığı zaman 530/414 sindirim sonra 530 nm'de toplam floresans emisyonu, FL' burada kalan mutlak FRET sinyal FRET, FL 'CyPet (475/414) iken sindirim sonra 475 nm'de CyPet emisyonu 414 nm (burada CyPet emisyon iki bölümden alınmıştır: CyPet-(pre-SUMO1)-YPet sindirilmemiş ve CyPet-SUMO1 sindirilmiş) heyecanlı ve FL YPet(530/475) CyPet-(pre-SUMO1)-YPet sindirilmiş olup olmadığını sabittir 475 nm'de heyecanlı YPet emisyon vardır.
- SENP1 ile sindirim sonra, geri kalan emisyon (FL 'FRET)' dir FRET:
C CyPet-(pre-SUMO1)-YPet ve x 'in toplam konsantrasyonunu sindirilmiş konsantrasyonu CyPet-(pre-SUMO1)-YPet olup.
- Tüm öğeleri birleştirerek, 414 nm (FL '530/414) ve uyarma altında 530 nm'de tespit floresans emisyonu:
4. Enzim Kinetik Çalışması için FRET tabanlı Proteaz Assay
- CyPet-(pre-SUMO1)-YPet (20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 50 mM NaCl,% 0.1 bir tampon içinde 37 ° C 'de SENP1 arasında katalitik alan ile inkübe edildi v /v) Tween-20, 80 ml toplam hacim 1 mM DTT ve 384-plaka içine aktarılır.
- Runs 15 sn aralıklarla 5 dakika süreyle bir floresan multiwell plaka okuyucu içinde 414 nm de bir uyarım sonrası 475 ve 530 nm'de floresans emisyon ölçümü ile yapılmıştır.
- Reaksiyon hızı (v) olarak alt tabaka (S) miktarı değişim ile korelasyon:
- Ürünün konsantrasyonu olarak 0 dan üstel olarak artmaktadır [S] 0 (orijinal substrat konsantrasyonu), t = 0:
- T = 0, orijinal hızı (V 0) olduğunda:
- KonsSENP1 arasında entration tespit edildi, ve CyPet-(pre-SUMO1)-YPet konsantrasyonu Michaelis-Menten denklem için gerekli olan enzim konsantrasyonu, 100 kat daha fazla çıkarılmıştır.
- Floresan okumaların tüm kantitatif FRET analizi yöntemi ile analiz ve Michaelis-Menten eşitliği sığdırmak için GraphPad Prism V Yazılım aktarılmıştır. Doğrusal olmayan regresyon zamanda tablolama programları (Microsoft Excel gibi) gibi daha yaygın yazılım paketleri yardımı ile yapılabilir.
5. Temsilcisi Sonuçlar
SENP1 ön-SUMO1 olgunlaşması süreci sırasında 475 ve 530 nm de floresan sinyalini meydana gelen değişiklikleri takip edilerek tespit edilebilir. Sonuçlar, bir alt tabaka doza bağlı olarak SENP1 tarafından önceden SUMO1 sindirim hızı (Şekil 4). Bu da gösteriyor öncesi SUMO1 en olgunlaşması için SENP1 ve katalitik etki sergiler mükemmel aktivite olduğunu. Başlangıç reaksiyontion hızları farklı substrat konsantrasyonları (Tablo 1) ile ilgili olarak yukarıda analizi ile hesaplanmıştır.
K kedi / K M oranı, genel olarak bir alt tabaka veya başka substratlar ile, belirli bir enzim ile farklı enzim etkinliği karşılaştırmak için kullanılır. K M ve V max karşılık gelen çeşitli ilk hızlar, çizilerek Michaelis-Menten denklemden elde edilebilir . CyPet-(pre-SUMO1)-YPet (Şekil 5) k kedi halinde elde edildi farklı konsantrasyonları için:
Yukarıdaki analize göre, hesaplanan K M 0.21 idi ± 0.04 uM, k kedi ± 0.28 s -1 6.90 idi ve k cat / K M oranı (± 0.55 3.2) idi x10 7 M -1 > S -1.
Şekil 1. SENP öncesi sumos olgunlaşması için FRET tabanlı proteaz tahlil grafiği.
Şekil 2. Donör, alıcı ve FRET tarafından konulan sermaye olarak floresan sinyal kantitatif analizi. CyPet-414 nm uyarma altında (pre-SUMO1)-YPet. FL CyPet (530/414) gelen emisyon spektrumları diseksiyonu 414 nm uyarma altında 530 nm'de CyPet emisyon, FL FRET olduğu FRET indüklenen YPet 414 nm uyarma altında 530 nm'de emisyon ve FL YPet (530/414) 414 nm uyarma altında 530 nm'de YPet emisyon olduğunu.
load/4430/4430fig3.jpg "/>
Şekil 3. Yön emisyon faktörü α ve β hesaplanması.
Şekil 4. SENP1 ve katalitik etki farklı oranlarda tarafından sindirilir CyPet-(pre-SUMO1)-YPet kantitatif analizi. Reaksiyonlar ilk 5 dakika içerisinde izlenmiştir.
Şekil 5. SENP1 tarafından CyPet-(pre-SUMO1)-YPet en sindirim Michaelis-Menten grafik analizi. Veri çizilen ve GraphPad Prism V ve doğrusal olmayan regresyon ile analiz edildi.
| [S] (uM) | V 0 (uM / s) | ||
| 0.115 | 0.0023 ± 0.00005 | 0.214 | 0,0028 ± 0,00004 |
| 0.407 | 0.0033 ± 0.00007 | ||
| 0.594 | 0.0037 ± 0,00013 | ||
| 0.725 | 0.0043 ± 0.00012 | ||
| 1.471 | 0,0051 ± 0,00036 | ||
| 1.899 | 0.0050 ± 0.00031 | ||
| 2.300 | 0.0050 ± 0,00062 |
Tablo 1. SENP1 öncesi SUMO1 olgunlaşan ilk hızlarının belirlenmesi. Her bir alt tabaka konsantrasyonu, dört numune sindirim ölçmek için kullanılmıştır. Standart sapma, bu dört örneklerin varyasyonları geldi.
| K M (uM) | k cat (s-1) | k cat / k M (M -1 • s-1) |
| 0.21 ± 0.04 | 6.90 ± 0.28 | 3.2 ± 0.55 × 10 7 |
Tablo 2. Kantitatif tarafından SENP1 öncesi SUMO1 olgunlaşan Kinetik parametrelerin analiz FRET. Standart sapma, her bir alt tabaka konsantrasyonu olarak dört numune geldi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FRET teknoloji SENP1 9 tarafından önceden SUMO1 olgunlaşan incelemek için kullanılmıştır. CFP-YFP, verici ile alıcı emilim oranı olarak FRET çifti ve rasyometrik analizi kullanılmıştır kinetik özelliklerini karakterize etmek için kullanıldı. Bununla birlikte, geleneksel rasyometrik içinde kendinden flüoresan analiz FRET verici ve alıcı arasında hiç düşünülmemiştir. Oranı doğrudan sindirilmiş substrat miktarı ile korele değildir.
Burada SENP1 öncesi SUMO1 en olgunlaşma kinetik çalışmak için geliştirilmiş son derece hassas FRET tabanlı proteaz tahlil rapor. Önceki rasyometrik yaklaşımın aksine, biz temelde verici ve alıcı kendini-floresans kantitatif katkıları belirlenerek kinetik parametreleri türetmek için kinetik analiz ve deneysel bir işlem için sinyal FRET yeni bir teori ile geliştirilmiş yöntem ve gerçek FRET- indüklenen acceptor emisyon. Rasyometrik analizi bunu yapamaz.verici ve alıcı kendini floresan emisyon cehalet FRET sinyal ve donörün emisyon bir abartılmasını yol açabilir. Abartılar büyük ölçüde nihai k cat / K M oranı (rasyometrik analizi için 3,81 x10 7 M -1 s -1, 3,2 x10 7 M -1 s -1 bizim niceliksel FRET analizleri ile) etkilemez olabilir, ama etkisi daha hız sınırlayıcı adım ve enzim inhibitörü potens belirlenmesinde önemli olan bireysel parametreleri, K M (0.098 vs 0.21 uM) ve k cat (3.43 s -1 vs 6.90 s -1), çalışılırken açıktır.
Burada rapor yöntemi proteaz kinetik parametrelerinin bir adım tahlil ve radyoaktif etiketleme ya da pahalı araçlar olmadan sadece moleküler klonlama ve protein ifade gerektirir. Tek adımlı bir işlemle deneysel prosedür kolaylaştıran, aynı zamanda bir çok sınırlar sadecevaryasyon. Floresan-etiketli proteinler hücrelerin kendi doğal ortamına benzer bir sulu faz içinde bulunmaktadır. Floresan yoğunluğunun yaygın olarak bulunmaktadır genel flüoresans spektroskopisi veya floresan levha okuyucu ile tespit edilebilir. Geleneksel "jel bazlı" yöntemi ile karşılaştırıldığında, bizim FRET tabanlı proteaz tahlil artan hassasiyet, gerçek zamanlı ölçüm ve gerektiğinde daha az zaman ve emek de dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sunmaktadır. Ayrıca, proteaz kinetik parametresi tayin metodoloji ve prosedür gibi radyoizotoplar veya sert kimyasallar gibi çevre dostu ve tehlikeli olmayan maddeler vardır. Buna ek olarak, yüksek derecede hassas FRET tabanlı tahlil bu gibi proteaz inhibitörü taramaları gibi yüksek verimli biyolojik tayinler, de kullanılabilir. Kinetik çalışma ayrıca inhibitörlerinin özellikleri (örneğin, Ki, IC50) karakterize etmek için kullanılabilir.
Bu nedenle, son derece hassas kantitatif FRET-Based proteaz deneyleri genom proteaz-substrat profilleme ve inhibitör gösterimleri geliştirme güçlü bir yaklaşım olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz değerli tavsiyeler için Victor GJ Rodgers için çok müteşekkiriz. Biz çok yakın ortak çalışma ve bu çalışma ile yardım için Liao grubun tüm üyeleri teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (JL Grant AI076504) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR II TOPO Kit | Invitrogen | K466040 | |
| 2xYT | Research Products Internationa.l Corp. | X15600 | |
| Ni-NTA Agrose | Thermo Scientific | 88222 | |
| Coomassie plus (Bradford) Assay Regent | Thermo Scientific | 23238 | |
| 384-well plate (glass bottom) | Greiner | 781892 | |
| FlexStation II 384 plate reader | Molecular Device |
References
- Johnson, E. S. Protein modification By SUMO. Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes & Development. 18, 2046-2059 (2004).
- Hay, R. T. SUMO: a history of modification. Molecular Cell. 18, 1-12 (2005).
- Müller, S., Hoege, C., Pyrowolakis, G., Jentsch, S. SUMO, ubiquitin's mysterious cousin. Nature. , 202-210 (2001).
- Hochstrasser, M. SP-RING for SUMO: new functions bloom for a ubiquitin-like protein. Cell. , 5-8 (2001).
- Drag, M., Salvesen, G. S. DeSUMOylating enzymes-SENPs. IUBMB Life. 60, 734-742 (2008).
- Mukhopadhyay, D., Dasso, M. Modification in reverse: the SUMO proteases. Trends in Biochemical Sciences. 32, 286-295 (2007).
- Reverter, D., Lima, C. D. Structural basis for SENP2 protease interactions with SUMO precursors and conjugated substrates. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1060-1068 (2006).
- Shen, L., et al. SUMO protease SENP1 induces isomerization of the scissile peptide bond. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1069-1077 (2006).
- Horton, R., Strachan, E., Vogel, K., Riddle, S. A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein. Analytical Biochemistry. 360, 138-143 (2007).
- Mikolajczyk, J., et al. Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-specific Proteases: PROFILING THE SPECIFICITIES AND ACTIVITIES OF HUMAN SENPs. Journal of Biological Chemistry. 282, 26217-26224 (2007).
- Kolli, N., Mikolajczyk, J., Drag, M., Mukhopadhyay, D., Moffatt, N., Dasso, M., Salvesen, G., Wilkinson, K. D. Distrubition and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes. Biochem. J. , 335-344 (2010).
- Drag, M., Mikolajczyk, J., Krishnakumar, I. M., Huang, Z., Salvesen, G. S. Activity profiling of human deSUMOylating enzymes (SENPs) with synthetic substrates suggests an unexpected specificity of two newly characterized members of the family. Biochemical Journal. 409, 461 (2008).
- Engels, I. H., et al. A time-resolved fluorescence resonance energy transfer-based assay for DEN1 peptidase activity. Analytical Biochemistry. 390, 85-87 (2009).
- Martin, S., Hattersley, N., Samuel, I., Hay, R., Tatham, M. A fluorescence-resonance-energy-transfer-based protease activity assay and its use to monitor paralog-specific small ubiquitin-like modifier processing. Analytical Biochemistry. 363, 83-90 (2007).
- Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. Nature Biotechnology. 23, 355-360 (2005).
