Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Kvantitativ FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Analys för SENP1 Proteas Kinetik Fastställande

Published: February 21, 2013 doi: 10.3791/4430

Summary

Ett nytt förfarande innefattar kvantitativ analys av FRET (Förster resonansenergiöverföring) signaler beskrivs för att studera enzymkinetik.

Abstract

Reversibla posttranslationella modifieringar av proteiner med ubiquitin eller ubikitin-liknande proteiner (Ubls) används ofta för att dynamiskt reglera proteinaktivitet och har olika roller i många biologiska processer. Till exempel, modifierar kovalent SUMO ett stort antal eller proteiner med viktiga roller i många cellulära processer, inklusive cell-cykel reglering, cellöverlevnad och död, DNA-skada respons och stress 1-5. SENP som SUMO-specifikt proteas, till funktioner som en endopeptidas i mognaden av SUMO prekursorer eller som isopeptidase bort SUMO från sina målproteiner och uppdatera SUMOylation cykeln 1,3,6,7.

Den katalytiska effektiviteten eller specificiteten av ett enzym beskrivs bäst av förhållandet mellan kinetiska konstanter, kcat / KM. I flera studier har kinetiska parametrarna för SUMO-SENP par bestämts genom olika metoder, bland annat polyakrylamidgel-baserade western-blot, radIOActive-märkt substrat, fluorescerande förening eller protein märkt substrat 8-13. De polyakrylamid-gel-tekniker, som använde det "ursprungliga" proteiner men är arbetskrävande och tekniskt krävande, inte att inte lätt lämpar sig för detaljerad kvantitativ analys. Den erhållna kcat / K M från studier med tetrapeptider eller proteiner med en ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) eller AMC (7-amino-4-metylkumarin) fluorofor var antingen upp till två storleksordningar lägre än de naturliga substraten eller kan inte klart skilja de iso-och endopeptidas verksamhet SENPs.

Nyligen, FRET-baserade proteas analyser användes för att studera deubiquitinating enzymer (dubs) eller SENPs med FRET-par av cyan fluorescent protein (GFP) och gult fluorescerande protein (YFP) 9,10,14,15. Förhållandet mellan acceptor-utsläpp till donator emission användes som den kvantitativa parametern för FRET signal monitor för proteas acvitet beslutsamhet. Emellertid ignorerade denna metod signal korskontamination på acceptor och donator emissionsvåglängder av acceptor och donator själv fluorescens och därför inte var korrekt.

Vi utvecklade ett nytt mycket känslig och kvantitativ FRET-baserade proteas analys för bestämning av kinetiska parametrarna för pre-SUMO1 mognad med SENP1. Konstruerad FRET par CyPet och YPet med betydligt förbättrad effektivitet FRET och fluorescens kvantutbytet, användes för att alstra CyPet-(före SUMO1)-YPet substratet 16. Vi differentierade och kvantifierade absoluta fluorescenssignaler bidragit med givaren och mottagaren, och FRET på acceptor och emissionsvåglängder, respektive. Värdet av k cat / K M erhölls som (3,2 ± 0,55) mot pre-SUMO1, vilket är i överensstämmelse med de allmänna enzymatiska kinetiska parametrar x10 7 M -1 s -1 av SENP1. Därför är denna metod giltig och kan användas ensa Allmänt förhållningssätt för att karakterisera andra proteaser också.

Protocol

1. Plasmidkonstruktioner

  1. Amplify de öppna läsramarna av generna genom PCR, och klona PCR-produkterna in i pCRII-TOPO-vektorn.
  2. Bekräfta produkterna genom sekvensering, och klona cDNA som kodar CyPet-(före SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet och katalytiska domänerna av SENP1 till pET28 (b) vektorn med en N-terminal hexahistidin-märkningen.

2. Protein Expression and Purification

  1. Transformera Escherichia coli-celler av stam BL21 (DE3) med pET28 (b) vektorer som kodar CyPet-(före SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet och de katalytiska domänerna av SENP1.
  2. Grown de transformerade bakterierna i 2xYT-medium under 3 h vid 37 ° C (skakning vid 250 varv per minut) för att nå en optisk densitet av 0,5 vid 600 nm.
  3. Tillsätt 100 | iM isopropyl-β-D-tiogalaktosid (IPTG) (slutlig koncentration) för att inducera proteinuttryck och skaka i 16 timmar vid 25 ° C vid 200 rpm.
  4. Skörda bakterierna genom centrifugeringseffekttion vid 10.000 rpm vid 4 ° C under 5 min och återsuspendera dem i en buffert av 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl och 5 mM imidazol.
  5. Sonikera cellerna för 10 minuter i 5-sekunders intervall vid en effektinställning av 25 W med MiSonics 4.000 sonikator och samla dem genom centrifugering vid 35.000 x g vid 4 ° C under 30 minuter.
  6. Ställ in kolonnen med 500 ml Ni-NTA-pärlor för 1 L kultur och överföra supernatanten till kolonnen.
  7. Tvätta hartset med buffert av 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 500 mM NaCl och 10 mM imidazol två gånger.
  8. Eluera proteinet med buffert av 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 500 mM NaCl och 500 mM imidazol och dialys i en buffert av 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl och 1 mM ditiotreitol (DTT) vid 4 ° C över natten.
  9. Bestämma koncentrationerna av de renade proteinerna med Bradford-analysen. Alternativ metod för mätning proteinkoncentration blir SDS-PAGE-gelelektrofores och färgades därefter med Coomassie-blått följt av avbildningkvantitativ.

3. Kvantitativ FRET spektrumanalys

  1. Den allmänna strategin för analysen grundades på FRET signalering (fig. 1). FRET par, var och CyPet YPet, taggade till N-och C-terminalerna, respektive, av pre-SUMO1. SENP1 klyver fusionsproteinet CyPet-(före SUMO1)-YPet vid Gly-Gly plats i SUMO1 s C-terminalen och sålunda frigör SUMO svansen med YPet. FRET signalen störs, vilket resulterar i en ökning av utsläppen från CyPet och en dramatisk minskning av YPet emission vid CyPet excitationsvåglängden.
  2. När den exciteras av ljus med våglängden 414 nm, den totala fluorescensemissionen av CyPet-(före SUMO1)-YPet vid 530 nm kan härledas från tre källor: den absoluta FRET-inducerad YPet s utsläpp, CyPet direkta utsläpp och YPet direkta utsläpp (figur 2).

Ekvation 1
där FL 530/414 </ Sub> är den totala fluorescensemissionen vid 530 nm när de exciteras vid 414 nm, FL FRET är den absoluta FRET signalen, FL CyPet (forts) den CyPet direkt utsläpp när de exciteras vid 414 nm, och FL YPet (forts) är YPet direkt utsläpp när de exciteras vid 414 nm. Indexet för (forts) står för bidrag.

  1. Den direkta utsläpp av CyPet vid 530 nm var proportionell mot dess emission vid 475 nm, när den exciteras vid 414 nm med en konstant förhållande α. Var CyPet-SUMO1 utarbetats vid koncentrationer av 50, 100, 200, 500 och 750 nm och 1 mm och utsläppen vid 475 och 530 nm mättes efter excitation vid 414 nm för att bestämma α (Figur 3-1).
  2. Den direkta utsläpp av YPet vid 530 nm under excitation vid 414 nm var proportionell mot dess emission vid 530 nm, när den exciteras vid 475 nm med ett konstant förhållande av β. YPet framställdes vid koncentrationer av 50, 100, 200, 500, 750 and 1.000 nm och emission vid 530 nm mättes när proverna upphetsad av våglängder av 414 och 475 nm för att bestämma β (Figur 3-2).
  3. När CyPet-(före SUMO1)-YPet digererades med SENP1, klyvning frigörs CyPet-SUMO1 och SUMO1 svans med YPet. När föreningen var glada vid 414 nm, den fluorescensemissionen vid 530 nm (FL '530/414) minskade men kan fortfarande delas in i tre delar som:

Ekvation 2
där FL '530/414 är den totala fluorescensemissionen vid 530 nm efter rötning när de exciteras vid 414 nm, FL' FRET är den återstående absolut FRET signal, FL 'CyPet (475/414) av CyPet emissionen vid 475 nm efter rötning vid upphetsad vid 414 nm (här CyPet utsläppet är från två delar: osmält CyPet-(före SUMO1)-YPet och smält CyPet-SUMO1) och FL YPet(530/475) är den YPet emission, när exciteras vid 475 nm, vilket är konstant om CyPet-(före SUMO1)-YPet spjälkas eller inte.

  1. Efter rötning av SENP1, resterande FRET utsläppen (FL 'FRET) är:

Ekvation 3
där C är den totala koncentrationen av CyPet-(pre-SUMO1)-YPet och x är koncentrationen av rötat CyPet-(före SUMO1)-YPet.

  1. Genom att kombinera alla objekt, är det detekterade fluorescensemissionen vid 530 nm under excitation av 414 nm (FL '530/414):

Ekvation 4

4. FRET-baserade proteasanalysen för enzymkinetiska studier

  1. CyPet-(före SUMO1)-YPet inkuberades med den katalytiska domänen av SENP1 vid 37 ° C i en buffert av 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 0,1% (v /v) Tween-20 och 1 mM DTT till en total volym av 80 ml och överfördes till 384-brunnars platta.
  2. Körningar utfördes genom mätning av fluorescensemissionen vid 475 och 530 nm efter en excitation vid 414 nm i en fluorescens flerkällsplatta läsare för 5 minuter med 15-sekunders intervall.
  3. Reaktionshastigheten (v) var korrelerad med förändringen i mängden av substrat (S) enligt:

Ekvation 5

  1. Koncentrationen av produkt ökade exponentiellt från 0 som [S] 0 (ursprunglig substratkoncentration) då t = 0:

Ekvation 6

  1. När t = 0, är den ursprungliga hastigheten (V 0):

Ekvation 7

  1. Den koncentration av SENP1 fastställdes, och koncentrationen av CyPet-(före SUMO1)-YPet ökade från 100 gånger mer än koncentrationen av enzym, som krävs enligt Michaelis-Menten ekvationen.
  2. Samtliga av de fluorescerande avläsningarna analyserades genom kvantitativ FRET analysmetod och avsattes i GraphPad Prism V Programvara för att passa Michaelis-Menten-ekvationen. Den icke-linjär regression kan även utföras med hjälp av mer vanliga programpaket som kalkylprogram (t.ex. Microsoft Excel).

5. Representativa resultat

Mognad av pre-SUMO1 med SENP1 kan bestämmas genom övervakning av förändringar i fluorescenssignalen vid 475 och 530 nm, under processen. Resultatet visade att hastigheten av pre-SUMO1 digerering genom SENP1 i ett substrat-dosberoende sätt (figur 4). Detta tyder på att den katalytiska domänen av SENP1 uppvisar utmärkt aktivitet för pre-SUMO1 s mognad. Den initiala reaktionning hastigheter beräknades genom ovanstående analys med olika substratkoncentrationer (tabell 1).

Den kcat / K M förhållande i allmänhet används för att jämföra effektiviteten hos olika enzymer med ett substrat eller ett särskilt enzym med olika substrat. Kan erhållas från Michaelis-Menten-ekvationen genom att avsätta olika initiala hastigheterna, motsvarande K M och Vmax till de olika koncentrationerna av CyPet-(före SUMO1)-YPet (Figur 5) k katt erhölls som.:

Ekvation 8
Enligt ovanstående analys var beräknade K M 0,21 ± 0,04 M var kcat 6,90 ± 0,28 s -1 och k cat / K M uppgick (3,2 ± 0,55) x10 7 M -1 > S -1.

Figur 1
Figur 1. Diagram FRET-baserade proteasanalysen för SENP pre-SUMOs mognad.

Figur 2
Figur 2. Kvantitativ analys av fluorescerande signal som bidrag från givaren, acceptorn och FRET. Dissektion av emissionsspektra från CyPet-(pre-SUMO1)-YPet enligt excitation vid 414 nm. FL CyPet (530/414) är CyPet emission vid 530 nm under excitation av 414 nm, FL FRET är FRET-inducerad YPet emission vid 530 nm under excitation av 414 nm, och FL YPet (530/414) är YPet emission vid 530 nm under excitation av 414 nm.

load/4430/4430fig3.jpg "/>
Figur 3. Beräkning av riktning emissionsfaktor α och β.

Figur 4
Figur 4. Kvantitativ analys av CyPet-(före SUMO1)-YPet digererad genom olika förhållanden mellan den katalytiska domänen av SENP1. Reaktionerna övervakades inom de första 5 min.

Figur 5
Figur 5. Michaelis-Menten grafisk analys av CyPet-(före SUMO1)-YPet s nedbrytning av SENP1. Data plottades och analyserades av GraphPad Prism V och icke-linjär regression.

[S] (pM) V 0 (iM / s)
0,115 0,0023 ± 0,00005 0,214 0,0028 ± 0,00004
0,407 0,0033 ± 0,00007
0,594 0,0037 ± 0,00013
0,725 0,0043 ± 0,00012
1,471 0,0051 ± 0,00036
1,899 0,0050 ± 0,00031
2,300 0,0050 ± 0,00062

Tabell 1. Inledande hastigheter bestämning av pre-SUMO1 s mognad med SENP1. I varje substratkoncentration, fyra prover användes för att mäta matsmältningen. Standardavvikelsen kom från variationer av dessa fyra prover.

K M (iM) kcat (s-1) k cat / k M (M -1 • s-1)
0,21 ± 0,04 6,90 ± 0,28 3,2 ± 0,55 x 10 7

Tabell 2. Kinetiska parametrar för pre-SUMO1 s mognad med SENP1 av kvantitativ FRET analys. Standardavvikelsen kom från de fyra proven i varje substratkoncentration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

FRET teknik har använts för att studera för-SUMO1 s mognad med SENP1 9. GFP-YFP användes som FRET-par och kvotmetriska analyser, vilket är förhållandet mellan acceptom till donator utsläpp, användes för att karakterisera de kinetiska egenskaper. Det finns dock ingen hänsyn till donator och acceptor själv fluorescens i den traditionella kvotmetriska FRET analys. Förhållandet inte direkt korrelerar med mängden digererad substrat.

Här rapporterar vi en utvecklad högkänslig FRET-baserade proteasanalysen att studera den kinetiska av pre-SUMO1 s mognad med SENP1. I motsats till den föregående kvotmetriska metoden, förbättrade vi grunden metoden med en ny teori om FRET signal för kinetisk analys och ett experimentellt förfarande för att härleda kinetiska parametrar genom att bestämma de kvantitativa bidrag själv-fluorescens från donator och acceptor, och den verkliga FRET- inducerad acceptor emission. Ratiometrisk analys kan inte göra detta. Denokunskap om själv-fluorescerande utsläpp av donator och acceptor kan leda till en överskattning av den FRET signalen och givarens utsläpp. Det överskattningar kanske inte mycket påverkar den slutliga k cat / K M förhållande (3,81 x10 7 M -1 s -1 för kvotmetriska analys 3,2 x10 7 M -1 s -1 av vår kvantitativa FRET analys), men effekten är mer uppenbart när man studerar de enskilda parametrarna, K M (0,098 vs 0,21 M) och k katt (3,43 s -1 vs 6,90 s -1), som är viktiga för att bestämma hastighetsbegränsande steget och hämmar styrkan av enzymer.

Den metod vi rapporterar här är en enstegsanalys av proteas kinetiska parametrar och kräver endast molekylär kloning och proteinexpression utan radioaktiv märkning eller dyra instrument. Det förfarande i ett steg inte bara förenklar den experimentella förfarandet, men också begränsar en mycketav variationer. De fluorescerande märkta proteinerna i den vattenhaltiga fasen, vilket är typiskt liknar deras naturliga miljö i celler. Fluorescensintensitet kan bestämmas genom allmän fluorescensspektroskopi eller fluorescens läsare plåt, som är allmänt tillgängliga. Jämfört med den traditionella "gel-baserade" metoden, erbjuder vår FRET-baserade proteasanalysen flera fördelar, bland annat ökad känslighet i realtid mätning och mindre tid och arbete som behövs. Dessutom metodik och förfarande proteas kinetics parameter bestämningar är miljövänliga och ofarliga material, såsom radioisotoper eller starka kemikalier. Dessutom, kan den mycket känsliga FRET-baserad analys användas i hög genomströmning biologiska analyser, såsom screening proteashämmare. Den kinetiska undersökningen kan också användas för att karakterisera egenskaperna hos de hämmare (t.ex. Ki, IC50).

Därför är mycket känsliga kvantitativa FRET-based proteas-analyser kan vara en kraftfull metod för att utveckla genomet hela proteas-substrat profilering och filmvisningar inhibitor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Vi är mycket tacksamma mot Victor GJ Rodgers för värdefulla råd. Vi tackar alla medlemmar i Liao grupp för mycket nära samarbete arbete och för hjälp med denna studie. Denna studie stöddes av National Institutes of Health (Grant AI076504 till JL).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PCR II TOPO Kit Invitrogen K466040
2xYT Research Products Internationa.l Corp. X15600
Ni-NTA Agrose Thermo Scientific 88222
Coomassie plus (Bradford) Assay Regent Thermo Scientific 23238
384-well plate (glass bottom) Greiner 781892
FlexStation II 384 plate reader Molecular Device

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johnson, E. S. Protein modification By SUMO. Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).
  2. Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes & Development. 18, 2046-2059 (2004).
  3. Hay, R. T. SUMO: a history of modification. Molecular Cell. 18, 1-12 (2005).
  4. Müller, S., Hoege, C., Pyrowolakis, G., Jentsch, S. SUMO, ubiquitin's mysterious cousin. Nature. , 202-210 (2001).
  5. Hochstrasser, M. SP-RING for SUMO: new functions bloom for a ubiquitin-like protein. Cell. , 5-8 (2001).
  6. Drag, M., Salvesen, G. S. DeSUMOylating enzymes-SENPs. IUBMB Life. 60, 734-742 (2008).
  7. Mukhopadhyay, D., Dasso, M. Modification in reverse: the SUMO proteases. Trends in Biochemical Sciences. 32, 286-295 (2007).
  8. Reverter, D., Lima, C. D. Structural basis for SENP2 protease interactions with SUMO precursors and conjugated substrates. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1060-1068 (2006).
  9. Shen, L., et al. SUMO protease SENP1 induces isomerization of the scissile peptide bond. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1069-1077 (2006).
  10. Horton, R., Strachan, E., Vogel, K., Riddle, S. A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein. Analytical Biochemistry. 360, 138-143 (2007).
  11. Mikolajczyk, J., et al. Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-specific Proteases: PROFILING THE SPECIFICITIES AND ACTIVITIES OF HUMAN SENPs. Journal of Biological Chemistry. 282, 26217-26224 (2007).
  12. Kolli, N., Mikolajczyk, J., Drag, M., Mukhopadhyay, D., Moffatt, N., Dasso, M., Salvesen, G., Wilkinson, K. D. Distrubition and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes. Biochem. J. , 335-344 (2010).
  13. Drag, M., Mikolajczyk, J., Krishnakumar, I. M., Huang, Z., Salvesen, G. S. Activity profiling of human deSUMOylating enzymes (SENPs) with synthetic substrates suggests an unexpected specificity of two newly characterized members of the family. Biochemical Journal. 409, 461 (2008).
  14. Engels, I. H., et al. A time-resolved fluorescence resonance energy transfer-based assay for DEN1 peptidase activity. Analytical Biochemistry. 390, 85-87 (2009).
  15. Martin, S., Hattersley, N., Samuel, I., Hay, R., Tatham, M. A fluorescence-resonance-energy-transfer-based protease activity assay and its use to monitor paralog-specific small ubiquitin-like modifier processing. Analytical Biochemistry. 363, 83-90 (2007).
  16. Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. Nature Biotechnology. 23, 355-360 (2005).

Tags

Bioteknik biokemi molekylärbiologi proteiner Quantitative FRET analys QFRET enzymkinetik analys SENP SUMO plasmid proteinuttryck proteinrening proteas analys kvantitativ analys
Kvantitativ FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Analys för SENP1 Proteas Kinetik Fastställande
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, Y., Liao, J. Quantitative FRETMore

Liu, Y., Liao, J. Quantitative FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination. J. Vis. Exp. (72), e4430, doi:10.3791/4430 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter