Summary
Un nuovo metodo che utilizza l'analisi quantitativa di FRET (Förster Resonance Energy Transfer) segnali è descritto per lo studio di cinetica enzimatica.
Abstract
Reversibili modificazioni post-traduzionali di proteine con proteine ubiquitina o ubiquitina-like (Ubls) sono ampiamente utilizzati per regolare in modo dinamico l'attività della proteina e hanno ruoli diversi in molti processi biologici. Ad esempio, SUMO modifica covalentemente un numero grande o proteine con un ruolo importante in molti processi cellulari, tra cui cellule-regolazione del ciclo, la sopravvivenza cellulare e la morte, danno la risposta del DNA e risposta allo stress 1-5. SENP, come SUMO-specifiche proteasi, funziona come un endopeptidasi nella maturazione dei precursori SUMO o come isopeptidase per rimuovere SUMO dalle sue proteine bersaglio e aggiornare il ciclo sumoilazione 1,3,6,7.
L'efficienza catalitica o specificità di un enzima è meglio caratterizzato dal rapporto delle costanti cinetiche, k cat / K M. In diversi studi, i parametri cinetici di SUMO-SENP coppie sono state determinate con vari metodi, tra cui gel di poliacrilammide-based western blot, radIOActive-marcato substrato, composto fluorescente o proteina marcata substrato 8-13. Tuttavia, le poliacrilammide-gel a base di tecniche, che hanno utilizzato i "nativi", ma le proteine sono laboriosi e tecnicamente impegnativo, che non si prestano ad una dettagliata analisi quantitativa. Il ottenuta k cat / K M da studi usando tetrapeptidi o proteine con ACC (7-ammino-4-carbamoylmetylcoumarin) o AMC (7-ammino-4-metil) fluoroforo erano o fino a due ordini di grandezza inferiore ai substrati naturali o non può chiaramente distinguere le iso-e attività di endopeptidasi SENPs.
Saggi della proteasi Recentemente, FRET-based sono stati utilizzati per studiare gli enzimi deubiquitinating (Dubs) o SENPs con il FRET coppia di proteina fluorescente ciano (PCP) e giallo proteina fluorescente (YFP) 9,10,14,15. Il rapporto di emissione dell'accettore di emissione del donatore è stato utilizzato come parametro quantitativo per FRET segnale monitor per proteasi acproduttività determinazione. Tuttavia, questo metodo ignorato segnale contaminazioni crociate al accettore e lunghezze d'onda di emissione del donatore e accettore da donatore auto-fluorescenza e quindi non era accurata.
Abbiamo sviluppato un nuovo altamente sensibile e quantitativa FRET saggio basato proteasi per determinare i parametri cinetici di pre-SUMO1 maturazione da SENP1. Un multistrato FRET CyPet coppia e YPet con significativamente migliorato FRET efficienza e resa quantica di fluorescenza, sono stati utilizzati per generare il CyPet-(pre-SUMO1)-YPet substrato 16. Abbiamo differenziato e quantificato assoluti segnali di fluorescenza fornite dal donatore e accettore FRET e alle lunghezze d'onda di emissione e accettori, rispettivamente. Il valore di k cat / K M è stato ottenuto come (3,2 ± 0,55) x10 7 M -1 s -1 SENP1 verso di pre-SUMO1, che è in accordo con i parametri generali cinetica enzimatica. Pertanto, questo metodo è valido e può essere utilizzato unsa generale approccio per caratterizzare proteasi anche altri.
Protocol
1. Costrutti plasmidici
- Amplificare le fasi di lettura aperte dei geni mediante PCR, e clonare i prodotti di PCR in pCRII-TOPO vettore.
- Confermare i prodotti dal sequenziamento, e clonare il cDNA codificante CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet e domini catalitici di SENP1 nella (b) pET28 vettore con un N-terminale tag hexahistidine.
2. Espressione e purificazione di proteine
- Trasformare cellule di Escherichia coli ceppo BL21 (DE3) con pET28 (b) vettori codificanti CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet ed i domini catalitici di SENP1.
- Coltivato i batteri trasformati in mezzo 2xYT per 3 ore a 37 ° C (agitando a 250 rpm) per raggiungere una densità ottica di 0,5 a 600 nm.
- Aggiungere 100 mM isopropil-β-D-tiogalattoside (IPTG) (concentrazione finale) per indurre l'espressione di proteine e agitare per 16 ore a 25 ° C a 200 rpm.
- Raccogliere i batteri da centrifugzione a 10.000 rpm a 4 ° C per 5 minuti e risospendere in un tampone di 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 5 mM e imidazolo.
- Sonicare le cellule per 10 min a 5-sec intervalli in un livello di potenza di 25 W utilizzando MiSonics 4000 sonicatore e alla loro raccolta per centrifugazione a 35.000 xg a 4 ° C per 30 min.
- Impostare la colonna con 500 ml Ni-NTA perline per 1 L cultura e trasferire il sopranatante in colonna.
- Lavare la resina con tampone di 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 500 mM NaCl, 10 mM imidazolo e due volte.
- Proteine eluire con tampone di 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 500 mM, e 500 mM imidazolo e dialisi in un tampone di 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 1 mM ditiotreitolo (DTT) a 4 ° C per una notte.
- Determinare le concentrazioni delle proteine purificate dal saggio Bradford. Metodo alternativo per la misura della concentrazione di proteine sarà SDS-PAGE elettroforesi su gel e quindi colorato con Coomassie blue seguita con imagingquantitativa.
3. Quantitativa FRET Analisi dello spettro
- La strategia generale per il saggio è basato su FRET segnalazione (Figura 1). La coppia FRET, CyPet e YPet, è stato etichettato per la N-e C-termini, rispettivamente, di pre-SUMO1. SENP1 scinde la proteina di fusione CyPet-(pre-SUMO1)-YPet al Gly-Gly del sito in SUMO1 del C-terminale e, quindi, rilascia la coda SUMO con YPet. Il segnale di FRET è interrotto, con conseguente aumento delle emissioni da CyPet e una drastica riduzione delle emissioni di YPet alla lunghezza d'onda di eccitazione CyPet.
- Quando eccitato dalla luce di lunghezza d'onda 414 nm, l'emissione totale di fluorescenza di CyPet-(pre-SUMO1)-YPet a 530 nm può essere derivato da tre fonti: emissione assoluto FRET indotta YPet, il CyPet emissione diretta e YPet emissione diretta (Figura 2).
dove FL 530/414 </ Sub> è l'emissione totale di fluorescenza a 530 nm quando viene eccitato a 414 nm, FL FRET è l'assoluto segnale di FRET, FL CyPet (continua) è l'emissione CyPet diretta quando viene eccitato a 414 nm, e FL YPet (continua) è la YPet emissione diretta quando viene eccitato a 414 nm. L'indice di (continua) sta per contributo.
- L'emissione diretta di CyPet a 530 nm è proporzionale alla sua emissione a 475 nm quando viene eccitato a 414 nm con un rapporto costante di α. CyPet-SUMO1 è stato preparato a concentrazioni di 50, 100, 200, 500, e 750 nm e 1 mm , e le emissioni a 475 e 530 nm sono stati misurati dopo eccitazione a 414 nm per determinare α (Figura 3-1).
- L'emissione diretta di YPet a 530 nm in eccitazione a 414 nm è proporzionale alla sua emissione a 530 nm quando viene eccitato a 475 nm con un rapporto costante di β. YPet è stato preparato a concentrazioni di 50, 100, 200, 500, 750 And 1.000 nm e l'emissione a 530 nm è stata misurata quando i campioni sono stati eccitati da lunghezze d'onda di 414 e 475 nm per determinare β (Figura 3-2).
- Quando CyPet-(pre-SUMO1)-YPet è stato digerito dal SENP1, la scissione rilasciato CyPet-SUMO1 e la coda SUMO1 con YPet. Quando il composto è stato eccitato a 414 nm, l'emissione di fluorescenza a 530 nm (FL '530/414) è diminuita ma può ancora essere divisa in tre parti come:
dove FL '530/414 è il totale delle emissioni di fluorescenza a 530 nm dopo la digestione quando eccitato a 414 nm, FL' FRET è il restante assoluto segnale di FRET, FL 'CyPet (475/414) è l'emissione CyPet a 475 nm dopo la digestione quando eccitato a 414 nm (in questo caso l'emissione CyPet è da due parti: non digerito CyPet-(pre-SUMO1)-YPet e digerito CyPet-SUMO1), e FL YPet(530/475) è l'emissione YPet quando eccitato a 475 nm, che è costante se CyPet-(pre-SUMO1)-YPet viene digerito o meno.
- Dopo digestione SENP1, il restante FRET emissione (FL 'FRET) è:
dove C è la concentrazione totale di CyPet-(pre-SUMO1)-YPet ed x è la concentrazione di digerito CyPet-(pre-SUMO1)-YPet.
- Combinando tutti gli elementi, l'emissione di fluorescenza rilevata a 530 nm in eccitazione di 414 nm (FL '530/414) è:
4. FRET saggio basato Proteasi per Enzyme studio cinetico
- CyPet-(pre-SUMO1)-YPet stato incubato con il dominio catalitico di SENP1 a 37 ° C in un tampone di 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 0,1% (v /v) Tween-20 e DTT 1 mM in un volume totale di 80 ml e trasferita in piastra a 384 pozzetti.
- Piste stati condotti misurando l'emissione di fluorescenza a 475 e 530 nm dopo eccitazione a 414 nm in un lettore di piastra multipozzetto fluorescenza per 5 minuti con intervalli di 15 sec.
- La velocità di reazione (v) è stata correlata con la variazione della quantità di substrato (S), come:
- La concentrazione di prodotto aumentato esponenzialmente da 0 a [S] 0 (concentrazione del substrato originale) quando t = 0:
- Quando t = 0, la velocità iniziale (V 0) è:
- Il concentration di SENP1 è stato fissato, e la concentrazione di CyPet-(pre-SUMO1)-YPet stata aumentata da 100 volte superiore alla concentrazione di enzima, che è richiesta da Michaelis-Menten.
- Tutte le letture di fluorescenza sono stati analizzati con il metodo di analisi quantitativa FRET e tracciata in Software GraphPad Prism V per adattarsi alla Michaelis-Menten. La regressione non lineare può essere eseguita anche con l'ausilio di pacchetti software più comuni, come i programmi di fogli di calcolo (ad esempio Microsoft Excel).
5. Risultati rappresentativi
Maturazione di pre-SUMO1 da SENP1 può essere determinata monitorando i cambiamenti nel segnale di fluorescenza a 475 e 530 nm durante il processo. Il risultato ha mostrato che la velocità di pre-SUMO1 digestione SENP1 in un modo dipendente dalla dose-substrato (Figura 4). Questo suggerisce che il dominio catalitico di SENP1 mostra un'attività eccellente per la maturazione di pre-SUMO1. La reazione inizialevelocità zione sono stati calcolati dalla precedente analisi con diverse concentrazioni di substrato (Tabella 1).
Il cat / K k rapporto M è generalmente utilizzato per confrontare le efficienze di differenti enzimi con un substrato o un particolare enzima con substrati diversi. K M e V max può essere ottenuta dalla equazione di Michaelis-Menten tracciando le velocità iniziali diverse, corrispondenti per le diverse concentrazioni di CyPet-(pre-SUMO1)-YPet (Figura 5) cat k è stato ottenuto come.:
Secondo l'analisi di cui sopra, il valore calcolato per K M è stato 0,21 ± 0,04 mM, il gatto k era 6,90 ± 0,28 s-1, e il gatto / K M k rapporto era (3,2 ± 0,55) x10 7 M -1 > S -1.
Figura 1. Grafico di FRET saggio basato proteasi per SENP pre-Sumos maturazione.
Figura 2. L'analisi quantitativa del segnale fluorescente, come contributi del donatore accettore, e FRET. Dissezione di spettri di emissione da CyPet-(pre-SUMO1)-YPet sotto eccitazione a 414 nm. FL CyPet (530/414) è emissione CyPet di a 530 nm in eccitazione di 414 nm, FL FRET è il FRET indotta emissioni YPet a 530 nm in eccitazione di 414 nm, e FL YPet (530/414) è l'emissione YPet di a 530 nm in eccitazione di 414 nm.
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Figura 3. Calcolo del fattore di emissione α direzione e β.
Figura 4. Analisi quantitativa di CyPet-(pre-SUMO1)-YPet digerito dai rapporti diversi del dominio catalitico di SENP1. Le reazioni sono state monitorate entro i primi 5 min.
Figura 5. Michaelis-Menten analisi grafica di digestione CyPet-(pre-SUMO1)-YPet da parte SENP1. I dati sono stati riportati e analizzati da GraphPad Prism V e la regressione non lineare.
| [S] (pM) | V 0 (pM / s) | ||
| 0,115 | 0,0023 ± 0,00005 | 0,214 | 0,0028 ± 0,00004 |
| 0,407 | 0,0033 ± 0,00007 | ||
| 0,594 | 0,0037 ± 0,00013 | ||
| 0,725 | 0,0043 ± 0,00012 | ||
| 1,471 | 0,0051 ± 0,00036 | ||
| 1,899 | 0,0050 ± 0,00031 | ||
| 2,300 | 0,0050 ± 0,00062 |
Tabella 1. Iniziale determinazione velocità di maturazione pre-SUMO1 da parte SENP1. In ogni concentrazione del substrato, quattro campioni sono stati utilizzati per misurare la digestione. La deviazione standard è venuto dalle variazioni di questi quattro campioni.
| K M (pM) | k cat (s-1) | k cat / K M (M -1 • s-1) |
| 0,21 ± 0,04 | 6,90 ± 0,28 | 3,2 ± 0,55 × 10 7 |
Tabella 2. Parametri cinetici di maturazione pre-SUMO1 da parte SENP1 da quantitativa FRET analisi. La deviazione standard è venuto dai quattro campioni per ogni concentrazione del substrato.
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Discussion
FRET tecnologia è stata usata per studiare la maturazione pre-SUMO1 da parte SENP1 9. CFP-YFP è stato usato come FRET coppia e analisi raziometrico, che è il rapporto tra accettore di emissioni donatori, è stato utilizzato per caratterizzare le proprietà cinetiche. Tuttavia, non vi è alcuna considerazione di donatore e accettore auto-fluorescenza nella raziometrica tradizionale analisi FRET. Il rapporto non è direttamente correlata con la quantità di substrato digerito.
Qui riportiamo un sviluppato altamente sensibile FRET saggio basato proteasi per studiare la cinetica di maturazione pre-SUMO1 da parte SENP1. In contrasto con l'approccio precedente raziometrico, abbiamo sostanzialmente migliorato il metodo con una nuova teoria di FRET segnale per l'analisi cinetica e una procedura sperimentale per ricavare i parametri cinetici per la determinazione dei contributi quantitativi di auto-fluorescenza dal donatore e accettore, e il reale FRET- accettore di emissione indotta. Analisi Raziometrico non può farlo. Ilignoranza di auto-fluorescenti emissioni di donatore e accettore può portare ad una sovrastima del segnale di FRET e l'emissione del donatore. La sovrastima potrebbe non influire notevolmente la finale k cat / K rapporto M (3,81 x10 7 M -1 s -1 per l'analisi raziometrico, 3.2 x10 7 M -1 s -1 dalla nostra analisi quantitativa FRET), ma l'effetto è più evidente quando si studiano i singoli parametri, K M (0,098 vs 0,21 pM) e k gatto (3,43 vs 6,90 s-1 s-1), che sono importanti nel determinare il fattore limitante e la potenza inibitore degli enzimi.
Il metodo riportiamo qui è un one-step test di proteasi parametri cinetici e richiede solo la clonazione molecolare e l'espressione della proteina senza marcatura radioattiva o strumenti costosi. La fase unica procedura non solo semplifica la procedura sperimentale, ma limita anche moltodi variazioni. Le proteine fluorescenti sono contrassegnati nella fase acquosa, che in genere è simile al loro ambiente naturale in cellule. Intensità di fluorescenza può essere determinata generale spettroscopia di fluorescenza o lettori di piastre a fluorescenza, che sono ampiamente disponibili. Rispetto al metodo tradizionale "gel-based", la FRET saggio basato proteasi offre diversi vantaggi, tra cui una maggiore sensibilità, misura in tempo reale, e meno tempo e lavoro necessari. Inoltre, la metodologia e la procedura di proteasi determinazioni dei parametri cinetici sono materiali ecologici e non pericolosi, come radioisotopi o sostanze chimiche aggressive. Inoltre, l'elevata sensibilità FRET saggio basato può essere utilizzato in saggi biologici high throughput screening, come proteasi. Lo studio cinetico può anche essere utilizzato per caratterizzare le proprietà degli inibitori (ad es Ki, IC50).
Pertanto, il quantitativo altamente sensibile FRET-basEd saggi proteasi potrebbe essere un approccio efficace per lo sviluppo di tutto il genoma proteasi-substrato profilatura e proiezioni inibitori.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Siamo molto grati a Victor GJ Rodgers per preziosi consigli. Ringraziamo tutti i membri del gruppo di Liao per molto stretto lavoro di collaborazione e di aiuto con questo studio. Questo studio è stato sostenuto dal National Institutes of Health (Grant AI076504 a JL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR II TOPO Kit | Invitrogen | K466040 | |
| 2xYT | Research Products Internationa.l Corp. | X15600 | |
| Ni-NTA Agrose | Thermo Scientific | 88222 | |
| Coomassie plus (Bradford) Assay Regent | Thermo Scientific | 23238 | |
| 384-well plate (glass bottom) | Greiner | 781892 | |
| FlexStation II 384 plate reader | Molecular Device |
References
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