Summary
Um novo método que envolve a análise quantitativa de FRET (Förster Resonance Energy Transfer) sinais é descrito para o estudo de cinética enzimática.
Abstract
Reversíveis modificações pós-tradução de proteínas com proteínas ubiquitina ou ubiquitina-like (Ubls) são amplamente usados para regular a actividade da proteína de forma dinâmica e têm diversos papéis em diversos processos biológicos. Por exemplo, SUMO covalentemente modifica um grande número de proteínas ou com papéis importantes em muitos processos celulares, incluindo a regulação do ciclo celular, sobrevivência e morte celular, resposta a danos no ADN, e resposta ao estresse 1-5. SENP, como SUMO-protease específico, funciona como uma endopeptidase na maturação dos precursores SUMO ou como uma isopeptidase para remover SUMO de proteínas-alvo e refrescar o ciclo SUMOilação 1,3,6,7.
A eficiência catalítica ou especificidade de uma enzima é melhor caracterizada por a razão entre as constantes cinéticas, k cat / K M. Em diversos estudos, os parâmetros cinéticos da SUMO-SENP pares foram determinadas por vários métodos, incluindo em gel de poliacrilamida-based western-blot, radIOActive marcado com composto de substrato, fluorescente ou proteína marcada substrato 8-13. No entanto, as técnicas de gel de poliacrilamida-base, que utilizaram os "nativos" proteínas, mas são trabalhosos e tecnicamente exigente, que não se prestam facilmente à análise quantitativa detalhada. A obtido k cat / K M a partir de estudos que utilizam tetrapéptidos ou proteínas com um ACC (ácido 7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) ou AMC (7-amino-4-metilcumarina) fluoróforo ou eram até duas ordens de grandeza mais baixa do que os substratos naturais ou não pode diferenciar claramente as iso-endopeptidase e atividades de SENPs.
Os ensaios de protease recentemente, FRET base foram utilizados para estudar as enzimas deubiquitinating (Dubs) ou SENPs com o par FRET de proteína fluorescente ciano (PCP) e proteína fluorescente amarela (YFP) 9,10,14,15. A proporção de emissão de aceitador para emissão de dador foi utilizado como parâmetro quantitativo para FRET monitor de sinal para a protease acdade determinação. No entanto, este método ignorado sinal contaminações cruzadas, no comprimento de onda de emissão de aceitador e dador de aceitador e dador de auto-fluorescência e, portanto, não era correcto.
Desenvolveu-se um novo ensaio altamente sensível e quantitativo da protease FRET com base para a determinação dos parâmetros cinéticos de uma pré-maturação por SUMO1 SENP1. Um par de engenharia FRET CyPet e YPet melhorou significativamente a eficiência com FRET e rendimento quântico de fluorescência, foram utilizadas para gerar o CyPet (pré-SUMO1)-substrato YPet 16. Nós diferenciados e quantificados absolutos sinais de fluorescência contribuídos pelo dador e aceitador FRET e nos comprimentos de onda de emissão e de aceitador, respectivamente. O valor de k cat / K M foi obtido como (3,2 ± 0,55) x10 7 M -1 s -1 de SENP1 para pré-SUMO1, o que está de acordo com os parâmetros cinéticos enzimáticos gerais. Assim, este método é válido e pode ser utilizado umsa geral aproximar para caracterizar outras proteases bem.
Protocol
1. Construções de plasmídeos
- Amplificar os quadros de leitura abertos de genes por PCR, e clonar os produtos de PCR em pCRII-TOPO vector.
- Confirmar os produtos de sequenciação e clonagem do cDNA que codifica CyPet (pré-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet e domínios catalíticos de SENP1 para o vector pET28 (b) com um etiqueta de hexa-histidina N-terminal.
2. Protein Expression and Purification
- Transformar células de Escherichia coli da estirpe BL21 (DE3) com pET28 (b) vectores que codificam CyPet (pré-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet e os domínios catalíticos de SENP1.
- Cultivadas as bactérias transformadas em meio 2xYT durante 3 horas a 37 ° C (com agitação a 250 rpm) para atingir uma densidade óptica de 0,5 a 600 nm.
- Adicione 100 ^ M isopropil-β-D-tiogalactósido (IPTG) (concentração final) para induzir a expressão da proteína e agitar durante 16 horas a 25 ° C a 200 rpm.
- Colheita das bactérias por centrifugção a 10.000 rpm a 4 ° C durante 5 min e ressuspender os em um tampão de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 50 mM e 5 mM de imidazole.
- Sonicar as células durante 10 minutos em intervalos de 5 s com um ajuste de potência de 25 W, utilizando MiSonics sonicador 4000 e recolhê-las por meio de centrifugação a 35.000 xg, a 4 ° C durante 30 min.
- Defina-se a coluna com 500 ml de pérolas de Ni-NTA de uma cultura de L e transferir o sobrenadante para a coluna.
- Lava-se a resina com tampão de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 500 mM, imidazol 10 mM e duas vezes.
- Proteína elui-se com tampão de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 500 mM, e 500 mM de imidazole e diálise num tampão de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 50 mM e 1 mM de ditiotreitol (DTT) a 4 ° C durante a noite.
- Determinar as concentrações das proteínas purificadas pelo ensaio de Bradford. Método alternativo para a medição da concentração de proteína será SDS-PAGE electroforese em gel e, em seguida, coradas com azul de Coomassie seguido de imagiologiaquantitativo.
3. Quantitativa FRET Análise de Espectro
- A estratégia geral para o ensaio foi baseado em FRET de sinalização (Figura 1). O par FRET, CyPet e YPet, foi etiquetada com o N-e C-terminais, respectivamente, da pré-SUMO1. SENP1 cliva a proteína de fusão CyPet (pré-SUMO1) YPet-no local Gly-Gly, em SUMO1 do C-terminal e, deste modo, liberta a cauda SUMO com YPet. O sinal FRET é interrompido, resultando num aumento da emissão de CyPet e uma diminuição dramática das emissões de YPet no comprimento de onda de excitação CyPet.
- Quando excitado por luz de comprimento de onda de 414 nm, a emissão total de fluorescência de CyPet-(pré-SUMO1)-YPet a 530 nm pode ser obtido a partir de três fontes: emissões absoluto FRET induzida YPet, a CyPet directo emissão e YPet directa de emissão (figura 2).
onde FL 530/414 </ Sub> é o total de emissões de fluorescência a 530 nm quando excitado a 414 nm, FL FRET é o absoluto FRET sinal, FL CyPet (cont) é a emissão direta CyPet quando excitado a 414 nm, e FL YPet (cont) é o YPet dirigir emissão quando excitado a 414 nm. O índice de (cont) representa contribuição.
- A emissão directa de CyPet a 530 nm foi proporcional à sua emissão a 475 nm quando excitado a 414 nm, com uma proporção constante de α. CyPet-SUMO1 foi preparada em concentrações de 50, 100, 200, 500, e 750 nM e 1 mM , e as emissões de 475 e 530 nm foi medida após a excitação a 414 nm para determinar α (Figura 3-1).
- A emissão directa de YPet a 530 nm sob excitação em 414 nm foi proporcional à sua emissão a 530 nm quando excitado a 475 nm, com uma proporção constante de β. YPet foi preparada em concentrações de 50, 100, 200, 500, 750 And 1000 nM, e a emissão a 530 nm foi medida em que as amostras foram excitados por comprimentos de onda de 414 e 475 nm para determinar β (Figura 3-2).
- Quando CyPet (pré-SUMO1)-YPet foi digerido por SENP1, a clivagem libertado CyPet-SUMO1 ea cauda SUMO1 com YPet. Quando o composto foi excitada a 414 nm, a emissão de fluorescência a 530 nm (FL '530/414) foi reduzida, mas ainda podem ser divididas em três partes como:
onde FL '530/414 é a emissão total de fluorescência a 530 nm após a digestão, quando excitado a 414 nm, FL' FRET é o restante sinal FRET absoluto, CyPet FL '(475/414) é a emissão a 475 nm CyPet após a digestão quando excitada a 414 nm (a emissão CyPet aqui é a partir de duas partes: CyPet não digerido (pré-SUMO1)-YPet e digerido CyPet-SUMO1) e FL YPet(530/475) é a emissão YPet quando excitado a 475 nm, que é constante se CyPet (pré-SUMO1)-YPet é digerido ou não.
- Após a digestão por SENP1, o restante FRET emissão (FL 'FRET) é a seguinte:
em que C é a concentração total de CyPet (pré-SUMO1)-YPet e x é a concentração de digerido CyPet (pré-SUMO1)-YPet.
- Através da combinação de todos os elementos, a emissão de fluorescência detectada a 530 nm sob excitação de 414 nm (530 FL '/ 414) é o seguinte:
4. FRET baseada Protease Assay para Estudo Cinético Enzyme
- CyPet (pré-SUMO1)-YPet foi incubada com o domínio catalítico de SENP1 a 37 ° C num tampão de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 50 mM, 0,1% (v /v) de Tween-20 e 1 mM de DTT a um volume total de 80 ml e transferidas para placas de 384 poços.
- Ensaios foram realizados através da medição da emissão de fluorescência a 475 e 530 nm, após uma excitação a 414 nm num leitor de fluorescência de placas com múltiplas cavidades, durante 5 min com intervalos de 15 seg.
- A velocidade da reacção (v) foi correlacionado com a alteração da quantidade de substrato (S), como:
- A concentração do produto aumentou exponencialmente a partir de 0, tal como [S] 0 (concentração de substrato original) quando t = 0:
- Quando t = 0, a velocidade inicial (V 0) é a seguinte:
- O concentration de SENP1 foi fixado, e a concentração de CyPet (pré-SUMO1)-YPet foi aumentada de 100 vezes mais do que a concentração de enzima, o que é exigido por equação de Michaelis-Menten.
- Todas as leituras de fluorescência foram analisados pelo método de análise quantitativa FRET e representado no GraphPad Software Prism V para ajustar a equação de Michaelis Menten. A análise de regressão não-linear também pode ser realizada com o auxílio de pacotes de software mais comuns, tais como programas de folha de cálculo (tais como o Microsoft Excel).
5. Resultados representativos
Maturação de pré-SUMO1 por SENP1 pode ser determinada por monitorização das alterações do sinal de fluorescência a 475 e 530 nm durante o processo. O resultado mostrou que a velocidade de pré-SUMO1 digestão por SENP1 de um modo de substrato dependente da dose (Figura 4). Isto sugere que o domínio catalítico de SENP1 exibe uma actividade excelente para a maturação de pré-SUMO1. A reação inicialção velocidades foram calculadas através da análise acima, com diferentes concentrações de substrato (Tabela 1).
O k cat / K M é geralmente usado para comparar a eficiência de enzimas diferentes com um substrato de uma enzima específica ou com diferentes substratos. K M e V max pode ser obtido a partir da equação de Michaelis-Menten, traçando as velocidades iniciais diferentes, correspondentes para as diferentes concentrações de CyPet (pré-SUMO1)-YPet (Figura 5) k cat foi obtido como.:
De acordo com a análise acima, o K calculado M foi de 0,21 ± 0,04 mM, o gato k foi 6,90 ± 0,28 s -1, e razão k cat / K M foi de (3,2 ± 0,55) x10 7 M -1 > S -1.
Figura 1. Gráfico de FRET ensaio baseado em protease para a maturação de pré-SENP sumos.
Figura 2. Análise quantitativa de sinal fluorescente como contribuições pelo dador-aceitador e FRET. Dissecação de espectros de emissão a partir de CyPet (pré-SUMO1) YPet sob excitação a 414 nm. CyPet FL (530/414) é emissão CyPet de a 530 nm, com excitação de 414 nm, FL FRET é a FRET induzida emissão YPet a 530 nm sob excitação de 414 nm, e FL YPet (530/414) é a emissão YPet de a 530 nm, com excitação de 414 nm.
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Figura 3. Cálculo de direção α fator de emissão e β.
Figura 4. Análise quantitativa de CyPet (pré-SUMO1) YPet digerido por razões diferentes do domínio catalítico de SENP1. As reações foram monitoradas dentro primeiros 5 min.
Figura 5. Michaelis-Menten análise gráfica de digestão CyPet (pré-SUMO1)-YPet do por SENP1. Os dados foram traçados e analisados por GraphPad Prism V e de regressão não-linear.
| [S] (uM) | V 0 (^ M / s) | ||
| 0,115 | 0,0023 ± 0,00005 | 0,214 | 0,0028 ± 0,00004 |
| 0,407 | 0,0033 ± 0,00007 | ||
| 0,594 | 0,0037 ± 0,00013 | ||
| 0,725 | 0,0043 ± 0,00012 | ||
| 1,471 | 0,0051 ± 0,00036 | ||
| 1,899 | 0,0050 ± 0,00031 | ||
| 2,300 | 0,0050 ± 0,00062 |
Tabela 1. Determinação velocidades iniciais de maturação de pré-SUMO1 por SENP1. Em cada concentração de substrato, quatro amostras foram utilizadas para medir a digestão. O desvio padrão foi de variações destas quatro amostras.
| K M (| iM) | k cat (s-1) | k cat / K m (M -1 • s-1) |
| 0,21 ± 0,04 | 6,90 ± 0,28 | 3,2 ± 0,55 x 10 7 |
Tabela 2. Parâmetros cinéticos de maturação de pré-SUMO1 por SENP1 por análise quantitativa FRET. O desvio padrão foi de quatro amostras de cada concentração de substrato.
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Discussion
FRET tecnologia tem sido utilizada para estudar a maturação de pré-SUMO1 por SENP1 9. CFP-YFP foi utilizado como o par de FRET e análise raciométrica, que é a relação entre as emissões de aceitador de doadores, foi utilizada para caracterizar as propriedades cinéticas. No entanto, não há qualquer consideração de dador e aceitador de auto-fluorescência na raciométrica tradicional FRET análise. A relação não é directamente correlacionada com a quantidade de substrato digerido.
Relatamos aqui um ensaio desenvolvido protease altamente sensível FRET baseada estudar a cinética da maturação pré-SUMO1 de pelo SENP1. Em contraste com a abordagem anterior raciométrica, que fundamentalmente melhorado o método com uma nova teoria de sinal FRET para a análise cinética e um procedimento experimental para derivar os parâmetros cinéticos de determinação da contribuição quantitativa de auto-fluorescência do dador e do aceitador, e o real FRET- emissão induzida aceitador de. Análise raciométrica não pode fazer isso. Oignorância do auto-fluorescentes emissões de doador e receptor pode levar a uma superestimação do sinal FRET e emissão do doador. As superestimativas pode não afetar muito a final k cat / K M (3,81 x10 7 M -1 s -1 para a análise raciométrica, 3,2 x10 7 M -1 s -1 pela nossa análise quantitativa FRET), mas o efeito é mais evidente quando se estuda os parâmetros individuais, K M (0,098 vs 0,21 uM) e k cat (3,43 vs 6,90 s -1 s -1), que são importantes para determinar o passo limitante da velocidade e da potência de inibidor de enzimas.
O método relatamos aqui é um ensaio de um passo dos parâmetros cinéticos da protease e requer apenas a clonagem molecular e expressão de proteína, sem marcação radioactiva ou instrumentos caros. O procedimento de um passo, não só simplifica o procedimento experimental, mas também limita muitode variações. As proteínas fluorescentes marcados em fase aquosa, que é geralmente semelhante ao seu ambiente natural nas células. A intensidade de fluorescência pode ser determinada por espectroscopia de fluorescência geral ou leitores de placas de fluorescência, que estão amplamente disponíveis. Em comparação com o tradicional "gel à base de" método, o nosso ensaio de protease FRET baseada oferece várias vantagens, incluindo aumento da sensibilidade, medida em tempo real, e menos tempo e trabalho necessário. Além disso, a metodologia eo procedimento de determinações de parâmetros cinéticos da protease são materiais ecológicos e não perigosos, tais como radioisótopos ou produtos químicos. Além disso, a elevada sensibilidade do ensaio com base em FRET pode ser utilizado em alto rendimento ensaios biológicos, tais como rastreios de inibidores da protease. O estudo cinético também pode ser utilizado para caracterizar as propriedades dos inibidores (por exemplo, Ki, IC50).
Portanto, o quantitativo altamente sensível FRET-basensaios ed protease pode ser uma poderosa abordagem no desenvolvimento de todo o genoma de perfis de protease-substrato e inibidor de rastreios.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Estamos muito gratos a Victor GJ Rodgers para o conselho valioso. Agradecemos a todos os membros do grupo de Liao de muito perto o trabalho colaborativo e para ajudar com este estudo. Este estudo foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (Grant AI076504 a JL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR II TOPO Kit | Invitrogen | K466040 | |
| 2xYT | Research Products Internationa.l Corp. | X15600 | |
| Ni-NTA Agrose | Thermo Scientific | 88222 | |
| Coomassie plus (Bradford) Assay Regent | Thermo Scientific | 23238 | |
| 384-well plate (glass bottom) | Greiner | 781892 | |
| FlexStation II 384 plate reader | Molecular Device |
References
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