Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Kvantitativ FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Analyse for SENP1 Protease Kinetics Bestemmelse

Published: February 21, 2013 doi: 10.3791/4430

Summary

En hidtil ukendt fremgangsmåde indebærer kvantitativ analyse af FRET (Förster Resonance Energy Transfer) signaler beskrives til undersøgelse af enzymkinetik.

Abstract

Reversible posttranslationelle modifikationer af proteiner med ubiquitin eller ubiquitin-lignende proteiner (Ubls) er almindeligt anvendt til dynamisk at regulere protein aktivitet og har forskellige roller i mange biologiske processer. For eksempel kovalent SUMO ændrer mange eller proteiner med vigtige roller i mange cellulære processer, herunder celle-cyklus regulering, celleoverlevelse og død, DNA beskadigelse respons og stressrespons 1-5. SENP, som SUMO-specifik protease, til funktioner som en endopeptidase i modningen af SUMO forstadier eller som en isopeptidase fjerne SUMO fra sine målproteiner og opfriske SUMOylation cyklus 1,3,6,7.

Den katalytiske effektivitet eller specificitet af et enzym er bedst karakteriseret ved forholdet mellem de kinetiske konstanter, kcat / KM. I flere studier har de kinetiske parametre for SUMO-SENP par blevet bestemt ved forskellige fremgangsmåder, herunder polyacrylamid-gel-baseret Western-blot, radIOActive-mærket substrat, fluorescerende forbindelse eller protein mærket substrat 8-13. Men de polyacrylamid-gel-baserede teknikker, der benyttede "indfødte" proteiner, men er arbejdskrævende og teknisk krævende, og som ikke umiddelbart egner sig til detaljeret kvantitativ analyse. Det opnåede kcat / KM fra studier med anvendelse af tetrapeptider eller proteiner med en ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) eller AMC (7-amino-4-methylcoumarin) fluorophor var enten op til to størrelsesordener lavere end de naturlige substrater eller kan ikke klart skelne mellem de iso-og endopeptidase aktiviteter SENPs.

For nylig FRET-baserede protease assays blev anvendt til at undersøge de afubiquitinerende enzymer (DUBs) eller SENPs med FRET-par af cyan fluorescerende protein (CFP), og gult fluorescerende protein (YFP) 9,10,14,15. Forholdet mellem acceptor emission til donor-emissionen blev anvendt som den kvantitative parameter for FRET signal monitor for protease activitet beslutsomhed. Men denne metode ignorerede signal krydskontaminationer på acceptor og donor emissionsbølgelængder ved acceptor og donor selv-fluorescens og derfor var ikke korrekte.

Vi udviklede en ny meget følsom og kvantitativ FRET-baseret proteaseassay til bestemmelse af de kinetiske parametre af præ-SUMO1 modning af SENP1. En manipuleret FRET-par CyPet og YPet med væsentlig forbedret FRET effektivitet og fluorescens kvantumudbytte, blev anvendt til at generere CyPet-(præ-SUMO1)-YPet substrat 16. Vi differentieret og kvantificeret absolutte fluorescenssignaler bidraget af donor og acceptor og FRET på acceptor-og emissionsbølgelængder, henholdsvis. Værdien af k cat / K M blev opnået som (3,2 ± 0,55) x 10 7 M-1s-1 for SENP1 mod præ-SUMO1, hvilket er i overensstemmelse med almindelige enzymatiske kinetiske parametre. Derfor er denne metode er gyldigt og kan anvendes etsa generel tilgang til at karakterisere andre proteaser så godt.

Protocol

1. Plasmidkonstruktioner

  1. Forstærke de åbne læserammer af generne ved hjælp af PCR, og klone PCR-produkterne ind i pCRII-TOPO vector.
  2. Bekræft produkterne ved sekventering, og klone cDNA'et, der koder CyPet-(præ-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet og katalytiske domæner af SENP1 ind i pET28 (b) vektoren med et N-terminalt hexahistidin-tag.

2. Protein Expression and Purification

  1. Transformere Escherichia coli celler af stamme BL21 (DE3) med pET28 (b) vektorer, der koder CyPet-(præ-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet og de ​​katalytiske domæner af SENP1.
  2. Dyrkes de transformerede bakterier i 2xYT-medium i 3 timer ved 37 ° C (omrystning ved 250 rpm) for at opnå en optisk densitet på 0,5 ved 600 nm.
  3. Tilsæt 100 uM isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) (slutkoncentration) til at inducere proteinekspression og omrystes i 16 timer ved 25 ° C ved 200 rpm.
  4. Høste bakterierne ved centrifugtion ved 10.000 rpm ved 4 ° C i 5 min og resuspenderes dem i en buffer af 20 mM Tris-HCI (pH 7,4), 50 mM NaCI og 5 mM imidazol.
  5. Sonikeres cellerne i 10 minutter i 5-sek intervaller ved en effekt indstilling på 25 W ved hjælp MiSonics 4000 sonikator og samle dem ved centrifugering ved 35.000 x g ved 4 ° C i 30 minutter.
  6. Opsætning af søjlen med 500 ml Ni-NTA beads for 1 L kultur og overføres supernatanten til kolonnen.
  7. Vask harpiksen med puffer af 20 mM Tris-HCI (pH 7,4), 500 mM NaCI og 10 mM imidazol to gange.
  8. Eluer protein med puffer af 20 mM Tris-HCI (pH 7,4), 500 mM NaCI og 500 mM imidazol og dialyse i en buffer af 20 mM Tris-HCI (pH 7,4), 50 mM NaCI og 1 mM dithiothreitol (DTT) ved 4 ° C natten over.
  9. Bestemme koncentrationerne af de oprensede proteiner ved Bradford-assay. Alternativ fremgangsmåde til proteinkoncentration målinger vil være SDS-PAGE-gelelektroforese og derefter farvet med Coomassie blue følges med imagingkvantitativ.

3. Kvantitativ FRET Spectrum Analysis

  1. Den generelle strategi for assayet var baseret på FRET signalering (fig. 1). The FRET-par, blev CyPet og YPet, fæstnet i N-og C-terminalerne, henholdsvis før SUMO1. SENP1 spalter fusionsproteinet CyPet-(præ-SUMO1)-YPet på Gly-Gly sted i SUMO1 s C-terminal og dermed frigiver SUMO hale med YPet. FRET-signalet er forstyrret, hvilket resulterer i en forøgelse af emissionen fra CyPet og et kraftigt fald i YPet udledning på CyPet excitationsbølgelængde.
  2. Når ophidset af lys med en bølgelængde 414 nm, den samlede fluorescens emission af CyPet-(pre-SUMO1)-YPet ved 530 nm kan afledes fra tre kilder: den absolutte FRET-induceret YPet på udledningen, CyPet direkte emission og YPet direkte emission (figur 2).

Ligning 1
hvor FL 530/414 </ Sub> er det samlede fluorescensemission ved 530 nm, når anslået ved 414 nm, FL FRET er den absolutte FRET signal, FL CyPet (fortsat) er den CyPet direkte emission, når anslået ved 414 nm, og FL YPet (fortsat) er YPet direkte emission, når ophidset ved 414 nm. Den sænket af (fortsat) står for bidrag.

  1. Den direkte emission af CyPet ved 530 nm var proportional med dens emission ved 475 nm ved excitation ved 414 nm med et konstant forhold mellem α. CyPet-SUMO1 blev fremstillet i koncentrationer på 50, 100, 200, 500, og 750 nM og 1 mM , og emissioner ved 475 og 530 nm blev målt efter excitation ved 414 nm for at bestemme α (Figur 3-1).
  2. Den direkte emission af YPet ved 530 nm under excitation ved 414 nm var proportional med dens emission ved 530 nm ved excitation ved 475 nm med et konstant forhold mellem β. YPet blev fremstillet i koncentrationer på 50, 100, 200, 500, 750 and 1.000 nM og emission ved 530 nm blev målt, når prøverne blev exciteres ved bølgelængder på 414 og 475 nm for at bestemme β (Figur 3-2).
  3. Når CyPet-(præ-SUMO1)-YPet blev fordøjet med SENP1, spaltning frigivet CyPet-SUMO1 og SUMO1 hale med YPet. Når forbindelsen blev anslået ved 414 nm, blev den fluorescensemission ved 530 nm (FL «530/414) faldt men som stadig kan opdeles i tre dele:

Ligning 2
hvor FL «530/414 er det totale fluorescensemission ved 530 nm efter fordøjelse, når de exciteres ved 414 nm, FL« FRET er den resterende absolutte FRET signal, FL 'CyPet (475/414) er CyPet emission ved 475 nm efter fordøjelse, når ophidset ved 414 nm (her CyPet emissionen er fra to dele: ufordøjede CyPet-(præ-SUMO1)-YPet og fordøjet CyPet-SUMO1), og FL YPet(530/475) er YPet emission når de exciteres ved 475 nm, som er konstant uanset CyPet-(præ-SUMO1)-YPet fordøjes eller ej.

  1. Efter fordøjelse af SENP1, FRET de resterende emission (FL 'FRET) er:

Ligning 3
hvor C er den samlede koncentration af CyPet-(præ-SUMO1)-YPet og x er koncentrationen af fordøjet CyPet-(præ-SUMO1)-YPet.

  1. Ved at kombinere alle de elementer, er den detekterede fluorescensemission ved 530 nm i excitation af 414 nm (FL '530/414):

Ligning 4

4. FRET-baseret Protease Assay for Enzyme kinetisk undersøgelse

  1. CyPet-(præ-SUMO1)-YPet blev inkuberet med det katalytiske domæne af SENP1 ved 37 ° C i en buffer af 20 mM Tris-HCI (pH 7,4), 50 mM NaCI, 0,1% (volumen /v) Tween-20 og 1 mM DTT i et totalvolumen på 80 ml og overført til 384-brøndsplade.
  2. Kørsler blev udført ved måling af fluorescensemission ved 475 og 530 nm efter en excitation ved 414 nm i en fluorescens flerbrøndsplade læser i 5 minutter med 15 sek intervaller.
  3. Reaktionshastigheden (v) blev korreleret med ændringer i mængden af substrat (S) som:

Ligning 5

  1. Koncentrationen af produktet steget eksponentielt fra 0 som [S] 0 (original substratkoncentration), når t = 0:

Ligning 6

  1. Når t = 0, den oprindelige hastighed (V 0) er:

Ligning 7

  1. Den concentration af SENP1 blev fastsat, og koncentrationen af ​​CyPet-(præ-SUMO1)-YPet blev øget fra 100 gange mere end koncentrationen af ​​enzym, som kræves af Michaelis-Menten ligningen.
  2. Alle de fluorescerende aflæsninger blev analyseret ved den kvantitative FRET analysemetode og afbildet i GraphPad Prism V Software til at passe til Michaelis-Menten ligningen. Den lineære regression kan også udføres ved hjælp af flere fælles software-pakker som regnearksprogrammer (såsom Microsoft Excel).

5. Repræsentative resultater

Modning af præ-SUMO1 af SENP1 kan bestemmes ved at overvåge ændringerne i fluorescenssignalet ved 475 og 530 nm under processen. Resultatet viste, at hastigheden af præ-SUMO1 fordøjelse med SENP1 i en substrat-dosisafhængig måde (figur 4). Dette tyder på, at det katalytiske domæne af SENP1 udviser fremragende aktivitet for pre-SUMO1 modning. Den indledende reaktiontion hastigheder blev beregnet ved ovenstående analyse med forskellige substratkoncentrationer (tabel 1).

The kcat / KM-forholdet er generelt bruges til at sammenligne effektiviteten af forskellige enzymer med et substrat eller et bestemt enzym med forskellige substrater. K M og V max kan opnås fra Michaelis-Menten-ligningen ved at plotte de forskellige indledende hastigheder, svarende til de forskellige koncentrationer af CyPet-(præ-SUMO1)-YPet (figur 5) kcat blev opnået som.:

Ligning 8
Ifølge den ovenstående analyse, var den beregnede K M 0,21 ± 0,04 uM, at kcat var 6,90 ± 0,28 s-1, og kcat / KM-forholdet var (3,2 ± 0,55) x 10 7 M-1 > S -1.

Figur 1
Fig. 1. Graf over FRET-baseret protease assay for SENP pre-SUMOs modning.

Figur 2
Figur 2. Kvantitativ analyse af fluorescerende signal som bidrag fra donor, acceptor og FRET. Dissektion af emissionsspektre fra CyPet-(præ-SUMO1)-YPet under excitation ved 414 nm. FL CyPet (530/414) er CyPet udledning ved 530 nm i excitation af 414 nm, FL FRET er det FRET-induceret YPet emission ved 530 nm i excitation af 414 nm, og FL YPet (530/414) er YPet udledning ved 530 nm i excitation af 414 nm.

load/4430/4430fig3.jpg "/>
Figur 3. Beregning af retningen emissionsfaktor α og β.

Figur 4
Figur 4. Kvantitativ analyse af CyPet-(præ-SUMO1)-YPet fordøjet med forskellige forhold mellem det katalytiske domæne af SENP1. Reaktioner blev overvåget inden for de første 5 min.

Figur 5
Figur 5. Michaelis-Menten grafisk analyse af CyPet-(præ-SUMO1)-YPet s fordøjelse med SENP1. Data blev plottet og analyseret ved GraphPad Prism V og ikke-lineær regression.

[S] (uM) V 0 (uM / s)
0,115 0,0023 ± 0,00005 0,214 0,0028 ± 0,00004
0,407 0,0033 ± 0,00007
0,594 0,0037 ± 0,00013
0,725 0,0043 ± 0,00012
1,471 0,0051 ± 0,00036
1,899 0,0050 ± 0,00031
2,300 0,0050 ± 0,00062

Tabel 1. Indledende hastigheder bestemmelse af præ-SUMO1 modning af SENP1. I hver substratkoncentration blev fire prøver til måling af fordøjelsen. Standardafvigelsen kom fra variationer af disse fire prøver.

K M (uM) kcat (s-1) k cat / k M (M -1 • s-1)
0,21 ± 0,04 6,90 ± 0,28 3,2 ± 0,55 × 10 7

Tabel 2. Kinetiske parametre af præ-SUMO1 modning af SENP1 ved kvantitativ FRET analyse. Standardafvigelsen kom fra de fire prøver i hver substratkoncentration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

FRET teknologi er blevet anvendt til at undersøge pre-SUMO1 modning af SENP1 9. CFP-YFP blev anvendt som FRET-par og ratiometrisk analyse, som er forholdet mellem acceptoren i donor-emission, blev anvendt til at karakterisere de kinetiske egenskaber. Imidlertid er der ingen behandling af donor og acceptor selv-fluorescens i den traditionelle ratiometrisk FRET-analyse. Forholdet ikke direkte korrelerer med mængden af ​​spaltet substrat.

Her rapporterer vi en udviklet meget følsom FRET-baseret proteaseassay at studere den kinetiske af præ-SUMO1 modning af SENP1. I modsætning til den tidligere ratiometrisk fremgangsmåde, grundlæggende vi forbedret fremgangsmåde med en ny teori om FRET signal til kinetisk analyse og en eksperimentel procedure til at udlede kinetiske parametre ved bestemmelse af kvantitative bidrag af selv-fluorescens fra donoren og acceptoren, og det virkelige FRET- induceret acceptorens emission. Ratiometrisk analyse kan ikke gøre dette. Denuvidenhed om selv-fluorescerende emission af donor og acceptor kan føre til en overvurdering af den FRET signalet og donorens emission. De overestimations måske ikke væsentligt påvirker den endelige kcat / KM-forhold (3,81 x10 7 M-1s-1 for ratiometrisk analyse, 3,2 x10 7 M-1s-1 med vores kvantitative FRET-analyse), men virkningen er mere indlysende, når man undersøger de enkelte parametre, K M (0,098 vs 0,21 uM) og kkat (3,43 s-1 vs 6,90 s-1), som er vigtige ved bestemmelse af hastighedsbegrænsende trin og inhibitor potens af enzymer.

Fremgangsmåden rapporterer vi her er en et-trins assay for protease kinetik parametre og kun kræver molekylær kloning og proteinekspression uden radioaktiv mærkning eller dyre instrumenter. The ettrinsprocedure ikke blot forenkler den eksperimentelle procedure, men begrænser også megetvariationer. De fluorescens-mærkede proteiner er i den vandige fase, som typisk svarer til deres naturlige miljø i celler. Fluorescensintensitet kan bestemmes ved almindelige fluorescensspektroskopi eller fluorescens plade læsere, som er bredt tilgængelige. Sammenlignet med den traditionelle "gel-baserede" metoden, tilbyder vores FRET-baseret proteaseassay flere fordele, herunder øget følsomhed, realtidsmåling, og mindre tid og arbejde nødvendig. Desuden metode og procedure for protease kinetik parameter bestemmelser er miljøvenlige og ikke-farlige materialer, såsom radioisotoper eller skrappe kemikalier. Desuden kan den meget følsomme FRET-baseret assay anvendes til high-throughput biologiske assays, såsom proteaseinhibitorer screeninger. Den kinetiske undersøgelse kan også anvendes til at beskrive egenskaberne af hæmmere (f.eks Ki, IC50).

Derfor er den meget følsomme kvantitative FRET-based protease-assays kunne være en magtfuld indfaldsvinkel i udviklingen af ​​genom-dækkende protease-substrat profilering og inhibitor screeninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Vi er meget taknemmelige for Victor GJ Rodgers for værdifuld rådgivning. Vi takker alle medlemmerne af Liao-koncernen til et meget tæt samarbejde arbejde og for at få hjælp med denne undersøgelse. Denne undersøgelse blev støttet af National Institutes of Health (Grant AI076504 til JL).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PCR II TOPO Kit Invitrogen K466040
2xYT Research Products Internationa.l Corp. X15600
Ni-NTA Agrose Thermo Scientific 88222
Coomassie plus (Bradford) Assay Regent Thermo Scientific 23238
384-well plate (glass bottom) Greiner 781892
FlexStation II 384 plate reader Molecular Device

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johnson, E. S. Protein modification By SUMO. Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).
  2. Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes & Development. 18, 2046-2059 (2004).
  3. Hay, R. T. SUMO: a history of modification. Molecular Cell. 18, 1-12 (2005).
  4. Müller, S., Hoege, C., Pyrowolakis, G., Jentsch, S. SUMO, ubiquitin's mysterious cousin. Nature. , 202-210 (2001).
  5. Hochstrasser, M. SP-RING for SUMO: new functions bloom for a ubiquitin-like protein. Cell. , 5-8 (2001).
  6. Drag, M., Salvesen, G. S. DeSUMOylating enzymes-SENPs. IUBMB Life. 60, 734-742 (2008).
  7. Mukhopadhyay, D., Dasso, M. Modification in reverse: the SUMO proteases. Trends in Biochemical Sciences. 32, 286-295 (2007).
  8. Reverter, D., Lima, C. D. Structural basis for SENP2 protease interactions with SUMO precursors and conjugated substrates. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1060-1068 (2006).
  9. Shen, L., et al. SUMO protease SENP1 induces isomerization of the scissile peptide bond. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1069-1077 (2006).
  10. Horton, R., Strachan, E., Vogel, K., Riddle, S. A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein. Analytical Biochemistry. 360, 138-143 (2007).
  11. Mikolajczyk, J., et al. Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-specific Proteases: PROFILING THE SPECIFICITIES AND ACTIVITIES OF HUMAN SENPs. Journal of Biological Chemistry. 282, 26217-26224 (2007).
  12. Kolli, N., Mikolajczyk, J., Drag, M., Mukhopadhyay, D., Moffatt, N., Dasso, M., Salvesen, G., Wilkinson, K. D. Distrubition and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes. Biochem. J. , 335-344 (2010).
  13. Drag, M., Mikolajczyk, J., Krishnakumar, I. M., Huang, Z., Salvesen, G. S. Activity profiling of human deSUMOylating enzymes (SENPs) with synthetic substrates suggests an unexpected specificity of two newly characterized members of the family. Biochemical Journal. 409, 461 (2008).
  14. Engels, I. H., et al. A time-resolved fluorescence resonance energy transfer-based assay for DEN1 peptidase activity. Analytical Biochemistry. 390, 85-87 (2009).
  15. Martin, S., Hattersley, N., Samuel, I., Hay, R., Tatham, M. A fluorescence-resonance-energy-transfer-based protease activity assay and its use to monitor paralog-specific small ubiquitin-like modifier processing. Analytical Biochemistry. 363, 83-90 (2007).
  16. Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. Nature Biotechnology. 23, 355-360 (2005).

Tags

Bioengineering biokemi molekylærbiologi Proteins Kvantitativ FRET analyse QFRET enzym kinetik analyse SENP SUMO plasmid protein ekspression protein oprensning proteaseassay kvantitativ analyse
Kvantitativ FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Analyse for SENP1 Protease Kinetics Bestemmelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, Y., Liao, J. Quantitative FRETMore

Liu, Y., Liao, J. Quantitative FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination. J. Vis. Exp. (72), e4430, doi:10.3791/4430 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter