Summary
Een nieuwe werkwijze die kwantitatieve analyse van FRET (Förster Resonance Energy Transfer) signalen is beschreven voor het bestuderen enzymkinetiek.
Abstract
Omkeerbare posttranslationele modificaties van eiwitten met ubiquitine of ubiquitine-achtige eiwitten (Ubls) worden veel gebruikt voor het dynamisch regelen eiwitactiviteit en diverse rollen in vele biologische processen. Zo wijzigt SUMO covalent een groot aantal of eiwitten met een rol in de cellulaire processen, waaronder celcyclus regulering, celoverleving en dood, DNA schade respons, en stressrespons 1-5. SENP als SUMO-specifiek protease, functies als endopeptidase in de rijping van SUMO precursors of een isopeptidase verwijderen SUMO uit de doeleiwitten en vernieuw de SUMOylation cyclus 1,3,6,7.
De katalytische efficiëntie of specificiteit van een enzym best gekenmerkt door de verhouding van de kinetische constanten, kcat / M. In verscheidene studies is de kinetische parameters van SUMO-SENP paren bepaald door verschillende methoden, waaronder polyacrylamide gel gebaseerde western-blot, radIOActive-gemerkt substraat, fluorescerende verbinding of eiwit gemerkt substraat 8-13. De polyacrylamide-gel-gebaseerde technieken, die de "natieve" eiwitten gebruikt, maar zijn omslachtig en technisch zware, die niet verder lenen zich gedetailleerde kwantitatieve analyse. De verkregen kcat / M van studies met tetrapeptiden of eiwitten met ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) of AMC (7-amino-4-methylcumarine) fluorofoor waren ofwel tot twee orden van grootte lager dan de natuurlijke substraten of niet duidelijk onderscheid maken tussen de iso-en endopeptidase activiteiten van SENPs.
Recentelijk FRET gebaseerde protease assays werden gebruikt om de ubiquitinerings enzymen (Dubs) of SENPs bestuderen met het FRET paar cyaan fluorescent eiwit (CFP) en geel fluorescent eiwit (YFP) 9,10,14,15. De verhouding van acceptor emissie van de donor emissie werd gebruikt als kwantitatieve parameter voor FRET signaal monitor voor protease activiteit vastberadenheid. Deze methode signaal kruisbesmettingen genegeerd de acceptor en donor emissie golflengten door acceptor en donor fluorescentie zichzelf en was dus niet nauwkeurig.
We hebben een nieuwe, uiterst gevoelige en kwantitatieve FRET gebaseerde protease assay voor het bepalen van kinetische parameters van pre-SUMO1 volgroeiing door SENP1. Een aangelegde FRET-paar CyPet en YPet met aanzienlijk verbeterde FRET efficiency en fluorescentie kwantumopbrengst, werden gebruikt om de CyPet-(pre-SUMO1)-YPet substraat 16 genereren. We onderscheiden en gekwantificeerd absolute fluorescentiesignalen bijgedragen door de donor en acceptor en FRET de acceptor en emissiegolflengten respectievelijk. De waarde van k cat / K M werd verkregen (3,2 ± 0,55) x 10 7 M-1 s -1 van SENP1 naar pre-SUMO1, hetgeen overeenkomt met de algemene enzymatische kinetische parameters. Daarom is deze werkwijze geldt en kan worden gebruikt eensa algemene aanpak van andere proteasen karakteriseren als goed.
Protocol
1. Plasmideconstructen
- Versterken de open reading frames van de genen door PCR en klonering van de PCR producten in pCRII-TOPO vector.
- Bevestig de producten door sequentiebepaling en klonering van de cDNA codeert CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet en katalytische domeinen van SENP1 in de pET28 (b) vector met een N-eindstandige hexahistidine tag.
2. Protein Expression and Purification
- Escherichia coli cellen transformeren van stam BL21 (DE3) met pET28 (b) coderen CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet en de katalytische domeinen van SENP1.
- De getransformeerde bacteriën gekweekt in 2xYT medium gedurende 3 uur bij 37 ° C (schudden bij 250 rpm) tot een optische dichtheid van 0,5 bij 600 nm bereiken.
- Voeg 100 uM isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) (eindconcentratie) om eiwitexpressie te induceren en gedurende 16 uur schudden bij 25 ° C bij 200 rpm.
- Oogst de bacteriën door centrifugatie bij 10.000 rpm bij 4 ° C gedurende 5 min en resuspendeer ze in een buffer van 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl en 5 mM imidazool.
- Sonificeer de cellen gedurende 10 min in 5 sec tussenpozen met een vermogensinstelling van 25 W met MiSonics 4000 sonicator opvangen en door centrifugeren bij 35.000 xg bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
- Stel de kolom met 500 ml Ni-NTA beads voor 1 L cultuur en de overdracht van de supernatant in de kolom.
- Was de hars met buffer van 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 500 mM NaCl en 10 mM imidazool tweemaal.
- Elueer eiwit met buffer van 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 500 mM NaCl en 500 mM imidazool en dialyse in een buffer van 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl en 1 mM dithiothreitol (DTT) bij 4 ° C overnacht.
- Wordt de concentratie van de gezuiverde eiwitten door de Bradford assay. Alternatieve methode voor eiwitconcentratie metingen SDS-PAGE-gelelektroforese zijn en vervolgens gekleurd met Coomassie blauw gevolgd met imagingkwantitatieve.
3. Kwantitatieve FRET Spectrum Analysis
- De algemene strategie voor de assay was gebaseerd op FRET signalering (figuur 1). De FRET-paar is CyPet en YPet, gekoppeld aan de N-en C-termini, respectievelijk pre-SUMO1. SENP1 het fusie-eiwit splitst CyPet-(pre-SUMO1)-YPet de Gly-Gly site in SUMO1 de C-terminus en daarmee geeft de SUMO staart met YPet. De FRET signaal wordt verstoord, hetgeen resulteert in een toename van de emissie van CyPet en een dramatische afname van de emissie YPet's at the CyPet excitatiegolflengte.
- Wanneer opgewekt door licht met een golflengte 414 nm, de totale fluorescentie-emissie van CyPet-(pre-SUMO1)-YPet bij 530 nm kan worden uit drie bronnen: de absolute FRET geïnduceerde YPet de emissie CyPet direct emissie en YPet directe emissie (Fig. 2).
waar FL 530/414 </ Sub> is de totale fluorescentie-emissie bij 530 nm wanneer opgewekt bij 414 nm, FL FRET is de absolute FRET signaal, FL CyPet (cont) is de CyPet directe emissie wanneer opgewekt bij 414 nm, en FL YPet (cont) is de YPet directe emissie wanneer opgewekt bij 414 nm. De subscript van (vervolg) staat voor bijdrage.
- De directe emissie van CyPet bij 530 nm is evenredig aan de emissie bij 475 nm na excitatie bij 414 nm met een constante verhouding van α. CyPet-SUMO1 werd bereid in concentraties van 50, 100, 200, 500 en 750 nM en 1 mM en emissie bij 475 en 530 nm werden gemeten na excitatie bij 414 nm om α (Figuur 3-1) bepalen.
- De directe emissie van YPet bij 530 nm onder excitatie bij 414 nm is evenredig aan de emissie bij 530 nm na excitatie bij 475 nm met een constante verhouding van β. YPet werd bereid in concentraties van 50, 100, 200, 500, 750 eennd 1000 nM en de emissie bij 530 nm werd gemeten toen de monsters werden opgewekt door golflengten van 414 en 475 nm om β (figuur 3-2) bepalen.
- Wanneer CyPet-(pre-SUMO1)-YPet werd verteerd door SENP1, de splitsing vrijgegeven CyPet-SUMO1 en de SUMO1 staart met YPet. Wanneer de verbinding werd geëxciteerd bij 414 nm, werd de fluorescentie-emissie bij 530 nm (FL '530/414) met maar nog worden onderverdeeld in drie categorieën:
waar FL '530/414 is de totale fluorescentie-emissie bij 530 nm na de spijsvertering wanneer opgewekt bij 414 nm, FL' FRET is de resterende absolute FRET signaal, FL 'CyPet (475/414) is de CyPet emissie bij 475 nm na de spijsvertering als opgewonden bij 414 nm (hier de CyPet emissie uit twee delen: onverteerde CyPet-(pre-SUMO1)-YPet en verteerd CyPet-SUMO1), en FL YPet(530/475) is YPet emissie bij excitatie bij 475 nm, die constant of CyPet-(pre-SUMO1)-YPet wordt verteerd of niet.
- Na digestie door SENP1, de resterende FRET emissie (FL "FRET) is:
waarin C de totale concentratie van CyPet-(pre-SUMO1)-YPet en x de concentratie van gedigereerde CyPet-(pre-SUMO1)-YPet.
- Door het combineren van alle items, de gedetecteerde fluorescentie-emissie bij 530 nm onder excitatie van 414 nm (FL '530/414) is:
4. FRET gebaseerde Protease Assay voor Enzyme Kinetic Study
- CyPet-(pre-SUMO1)-YPet werd geïncubeerd met het katalytische domein van SENP1 bij 37 ° C in een buffer van 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 0,1% (v /v) Tween-20 en 1 mM DTT tot een totaal volume van 80 ml en overgebracht naar 384-wells plaat.
- Runs werden uitgevoerd door het meten van de fluorescentie-emissie bij 475 en 530 nm na excitatie bij 414 nm in een fluorescentie-plaatlezer multiwell gedurende 5 min met 15 seconde.
- De reactiesnelheid (v) is gecorreleerd met de verandering in de hoeveelheid substraat (S) als:
- De concentratie van product exponentieel van 0 als [S] 0 (oorspronkelijke substraatconcentratie) bij t = 0:
- Op t = 0, de oorspronkelijke snelheid (V 0) is:
- Het concentration van SENP1 werd vastgesteld en de concentratie van CyPet-(pre-SUMO1)-YPet verhoogd van 100 keer meer dan de concentratie van het enzym, dat volgens Michaelis-Menten vergelijking.
- Alle fluorescente metingen werden geanalyseerd door de kwantitatieve analysemethode FRET en afgebeeld in GraphPad Prism V Software de Michaelis-Menten vergelijking passen. De niet-lineaire regressie kan ook worden uitgevoerd met behulp van meer gebruikelijke softwarepakketten zoals spreadsheet programma's (zoals Microsoft Excel).
5. Representatieve resultaten
Rijping van pre-SUMO1 door SENP1 kan worden bepaald door het volgen van de veranderingen in de fluorescentie signaal bij 475 en 530 nm tijdens het proces. Het resultaat toonde dat de snelheid van pre-SUMO1 digestie door SENP1 in een substraat dosis afhankelijke wijze (Figuur 4). Dit suggereert dat het katalytische domein van SENP1 vertoont uitstekende activiteit voor rijping pre-SUMO1's. De eerste reactie snelheden werden berekend volgens bovenstaande analyse met verschillende substraatconcentraties (tabel 1).
De kcat / M-verhouding wordt algemeen gebruikt om de efficiëntie van verschillende enzymen vergelijken met een substraat of een bepaald enzym met verschillende substraten. K M en V max te verkrijgen bij de Michaelis-Menten vergelijking door het uitzetten van de verschillende initiële snelheden, die overeenkomen de verschillende concentraties CyPet-(pre-SUMO1)-YPet (Figuur 5) k cat werd verkregen.:
Volgens de bovenstaande analyse de berekende K M 0,21 ± 0,04 uM, de kcat was 6,90 ± 0,28 s-1 en de kcat / M bedroeg (3,2 ± 0,55) x 10 7 M-1 > S -1.
Figuur 1. Grafiek van FRET-gebaseerde assay voor protease SENP pre-Sumos rijping.
Figuur 2. Kwantitatieve analyse van fluorescent signaal als bijdragen van de donor, acceptor en FRET. Dissectie van de emissie spectra van CyPet-(pre-SUMO1)-YPet onder excitatie bij 414 nm. FL CyPet (530/414) wordt CyPet De emissie bij 530 nm onder excitatie van 414 nm, FL FRET is de FRET-geïnduceerde YPet emissie bij 530 nm onder excitatie van 414 nm, en FL YPet (530/414) is YPet's emissie bij 530 nm onder excitatie van 414 nm.
load/4430/4430fig3.jpg "/>
Figuur 3. Berekening van richting emissiefactor α en β.
Figuur 4. Kwantitatieve analyse van CyPet-(pre-SUMO1)-YPet gedigereerd met verschillende verhoudingen van het katalytische domein van SENP1. Reacties werden gevolgd binnen de eerste 5 minuten.
Figuur 5. Michaelis-Menten grafische analyse van digestie CyPet-(pre-SUMO1)-YPet's door SENP1. De gegevens werden uitgezet en geanalyseerd met GraphPad Prism V en niet-lineaire regressie.
| [S] (uM) | V 0 (uM / s) | ||
| 0.115 | 0,0023 ± 0,00005 | 0.214 | 0,0028 ± 0,00004 |
| 0.407 | 0,0033 ± 0,00007 | ||
| 0.594 | 0,0037 ± 0,00013 | ||
| 0.725 | 0,0043 ± 0,00012 | ||
| 1.471 | 0,0051 ± 0,00036 | ||
| 1.899 | 0,0050 ± 0,00031 | ||
| 2.300 | 0,0050 ± 0,00062 |
Tabel 1. Eerste snelheden bepaling van rijping pre-SUMO1's door SENP1. In elk substraatconcentratie werden vier monsters voor de vertering te meten. De standaardafwijking kwam van de variaties van deze vier monsters.
| K M (uM) | k cat (s-1) | kcat / M (M-1 s •-1) |
| 0,21 ± 0,04 | 6,90 ± 0,28 | 3,2 ± 0,55 x 10 7 |
Tabel 2. Kinetische parameters van rijping pre-SUMO1's door SENP1 door kwantitatieve analyse FRET. De standaardafwijking was van de vier monsters in elk substraatconcentratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FRET technologie is gebruikt om vooraf SUMO1 de rijping studie door SENP1 9. CFP-YFP werd gebruikt als FRET-paar en ratiometrische analyse, is de verhouding van donor acceptor aan emissies, werd gebruikt om de kinetische eigenschappen karakteriseren. Er is echter geen rekening gehouden met donor en acceptor zelf fluorescentie in de traditionele ratiometrische FRET analyse. De verhouding niet rechtstreeks verband met de hoeveelheid gedigesteerd substraat.
Hier rapporteren we een ontwikkelde zeer gevoelige FRET-gebaseerde protease assay om de kinetische van rijping pre-SUMO1 te bestuderen door SENP1. In tegenstelling tot de vorige ratiometrische aanpak wij fundamenteel verbeterde de methode met een nieuwe theorie van FRET signaal voor kinetische analyse en experimentele procedure afleiden kinetische parameters door bepaling van de kwantitatieve bijdrage van zelf-fluorescentie van donor en acceptor, en de real-FRET geïnduceerde acceptor-uitstoot. Ratiometrisch analyse kan dit niet doen. Deonwetendheid van zelf-fluorescerende emissie van donor en acceptor kan leiden tot een overschatting van de FRET signaal en de donor-uitstoot. De overschattingen misschien niet grote invloed op de uiteindelijke kcat / M-verhouding (3,81 x10 7 M-1 s -1 voor de ratiometrische analyse 3,2 x10 7 M-1 s -1 van onze kwantitatieve analyse FRET), maar het effect is duidelijk bij het bestuderen van de afzonderlijke parameters, K M (0,098 vs 0,21 uM) en k cat (3,43 vs 6,90 s-1 s -1), die van belang om de snelheidsbeperkende stap inhibitor potentie van enzymen.
De methode is dat we hier een stap van assay protease kinetiek parameters en vereist slechts moleculaire klonering en eiwitexpressie zonder radioactieve labeling of dure instrumenten. De eenstapsprocedure vereenvoudigt niet alleen de experimentele procedure maar beperkt ook veelvariaties. De fluorescent gemerkte eiwitten zijn in de waterfase, doorgaans vergelijkbaar in hun natuurlijke omgeving cellen. Fluorescentie-intensiteit kan worden bepaald door algemene fluorescentiespectroscopie of fluorescentie plaat readers, die overal verkrijgbaar. Vergeleken met de traditionele "gel-based"-methode, onze FRET-gebaseerde protease assay biedt verschillende voordelen, met inbegrip van verhoogde gevoeligheid, real-time meting, en minder tijd en arbeid die nodig is. Bovendien is de methodiek en de procedure van protease kinetiek parameter bepalingen zijn milieuvriendelijk en niet-gevaarlijke materialen, zoals radio-isotopen of agressieve chemicaliën. Bovendien kunnen de zeer gevoelige FRET-gebaseerde test worden gebruikt in high-throughput biologische assays, zoals protease inhibitor screenings. De kinetische studie kan ook worden gebruikt om de eigenschappen van de remmers (zoals Ki, IC50) te karakteriseren.
Daarom is de uiterst gevoelige kwantitatieve FRET-based protease testen kan een krachtige aanpak bij de ontwikkeling genoom-brede protease-substraat profilering en remmer screenings zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We zijn erg dankbaar voor Victor GJ Rodgers voor waardevolle adviezen. Wij danken alle leden van de Liao-groep voor zeer nauwe samenwerking werk en voor hulp bij dit onderzoek. Dit onderzoek werd ondersteund door de National Institutes of Health (Grant AI076504 naar JL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR II TOPO Kit | Invitrogen | K466040 | |
| 2xYT | Research Products Internationa.l Corp. | X15600 | |
| Ni-NTA Agrose | Thermo Scientific | 88222 | |
| Coomassie plus (Bradford) Assay Regent | Thermo Scientific | 23238 | |
| 384-well plate (glass bottom) | Greiner | 781892 | |
| FlexStation II 384 plate reader | Molecular Device |
References
- Johnson, E. S. Protein modification By SUMO. Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes & Development. 18, 2046-2059 (2004).
- Hay, R. T. SUMO: a history of modification. Molecular Cell. 18, 1-12 (2005).
- Müller, S., Hoege, C., Pyrowolakis, G., Jentsch, S. SUMO, ubiquitin's mysterious cousin. Nature. , 202-210 (2001).
- Hochstrasser, M. SP-RING for SUMO: new functions bloom for a ubiquitin-like protein. Cell. , 5-8 (2001).
- Drag, M., Salvesen, G. S. DeSUMOylating enzymes-SENPs. IUBMB Life. 60, 734-742 (2008).
- Mukhopadhyay, D., Dasso, M. Modification in reverse: the SUMO proteases. Trends in Biochemical Sciences. 32, 286-295 (2007).
- Reverter, D., Lima, C. D. Structural basis for SENP2 protease interactions with SUMO precursors and conjugated substrates. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1060-1068 (2006).
- Shen, L., et al. SUMO protease SENP1 induces isomerization of the scissile peptide bond. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1069-1077 (2006).
- Horton, R., Strachan, E., Vogel, K., Riddle, S. A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein. Analytical Biochemistry. 360, 138-143 (2007).
- Mikolajczyk, J., et al. Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-specific Proteases: PROFILING THE SPECIFICITIES AND ACTIVITIES OF HUMAN SENPs. Journal of Biological Chemistry. 282, 26217-26224 (2007).
- Kolli, N., Mikolajczyk, J., Drag, M., Mukhopadhyay, D., Moffatt, N., Dasso, M., Salvesen, G., Wilkinson, K. D. Distrubition and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes. Biochem. J. , 335-344 (2010).
- Drag, M., Mikolajczyk, J., Krishnakumar, I. M., Huang, Z., Salvesen, G. S. Activity profiling of human deSUMOylating enzymes (SENPs) with synthetic substrates suggests an unexpected specificity of two newly characterized members of the family. Biochemical Journal. 409, 461 (2008).
- Engels, I. H., et al. A time-resolved fluorescence resonance energy transfer-based assay for DEN1 peptidase activity. Analytical Biochemistry. 390, 85-87 (2009).
- Martin, S., Hattersley, N., Samuel, I., Hay, R., Tatham, M. A fluorescence-resonance-energy-transfer-based protease activity assay and its use to monitor paralog-specific small ubiquitin-like modifier processing. Analytical Biochemistry. 363, 83-90 (2007).
- Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. Nature Biotechnology. 23, 355-360 (2005).
