Summary
Eine neuartige Methode, die quantitative Analyse von FRET (Förster Resonance Energy Transfer)-Signale für das Studium Enzymkinetik beschrieben.
Abstract
Reversible posttranslationale Modifikationen von Proteinen mit Ubiquitin oder Ubiquitin-ähnliche Proteine (UBLs) werden häufig verwendet, um dynamisch zu regulieren Protein-Aktivität und haben diverse Rollen in vielen biologischen Prozessen. Beispielsweise SUMO kovalent modifiziert eine große Anzahl oder Proteine mit wichtige Rollen bei vielen zellulären Prozessen, einschließlich der Zellzyklus-Regulation, Zellüberleben und Tod, DNA-Schädigung Antwort und Stress-Response 1-5. SENP, wie SUMO-spezifische Protease, um Funktionen wie einer Endopeptidase bei der Reifung von SUMO Vorstufen oder als Isopeptidase SUMO von der Zielproteine zu entfernen und Aktualisiere die SUMOylierung Zyklus 1,3,6,7.
Die katalytische Effizienz oder Spezifität eines Enzyms wird am besten durch das Verhältnis der kinetischen Konstanten, k cat / K M gekennzeichnet. In mehreren Untersuchungen haben die kinetischen Parameter von SUMO-SENP paarweise durch verschiedene Verfahren, einschließlich Polyacrylamid Gel-basierten Western-Blot bestimmt worden ist, radIOActive-markiertes Substrat, eine fluoreszierende Verbindung oder Protein markierte Substrat 8-13. Doch die Polyacrylamid-Gel-Techniken, die die "native" Proteine verwendet, aber aufwendig und technisch anspruchsvoll sind, haben die nicht leicht eignen sich für detaillierte quantitative Analyse. Das erhaltene k cat / K M aus Untersuchungen unter Verwendung Tetrapeptiden oder Proteine mit einem ACC-(7-Amino-4-carbamoylmetylcoumarin) oder AMC (7-Amino-4-methylcumarin) Fluorophor waren entweder bis zu zwei Größenordnungen niedriger als die natürlichen Substrate oder kann nicht eine deutliche Differenzierung der iso-und Endopeptidase Aktivitäten SENPs.
Kürzlich FRET-Protease-Tests wurden verwendet, um die Enzyme deubiquitinating (DUBs) oder SENPs mit der FRET-Paar von Cyan Fluorescent Protein (GFP) und gelb fluoreszierendes Protein (YFP) 9,10,14,15 studieren. Das Verhältnis von Akzeptor-Emission um Donoremission wurde als quantitative Parameter verwendet für Signal-Monitor für Protease ac FRETtivität Entschlossenheit. Allerdings ignoriert diese Methode Signal Kreuzkontaminationen bei der Akzeptor und Donor Emissionswellenlängen von Donor-und Akzeptor Eigenfluoreszenz und war somit nicht korrekt.
Wir entwickelten einen neuartigen hochempfindliche quantitative und FRET-Protease Assay zur Bestimmung der kinetischen Parameter von Pre-SUMO1 SENP1 Reifung durch. Gentechnisch FRET-Paar und CyPet YPet mit deutlich verbesserten Wirkungsgrad und FRET Fluoreszenzquantenausbeute, wurden verwendet, um die CyPet-(pre-SUMO1)-YPet Substrat 16 zu erzeugen. Wir differenziert und quantifiziert absolute Fluoreszenz-Signale von der Donor-und Akzeptor beigetragen und FRET an den Akzeptor und Emissionswellenlängen sind. Der Wert von k cat / K M wurde als (3,2 ± 0,55) erhalten x10 7 M -1 s -1 von SENP1 Richtung Pre-SUMO1, die in Übereinstimmung mit den allgemeinen enzymatischen kinetischen Parameter ist. Daher ist diese Methode gültig und kann verwendet werden, einsa allgemeinen Ansatz auf andere Proteasen sowie charakterisieren.
Protocol
Ein. Plasmidkonstrukte
- Amplifizieren die offenen Leseraster der Gene mittels PCR und Klonierung der PCR-Produkte in PCRII-TOPO-Vektor.
- Bestätigen der Produkte durch Sequenzierung und Klonen der cDNA CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet und katalytische Domäne in das SENP1 pET28 (b) Vektor mit einer N-terminalen Hexahistidin-Tag.
2. Protein Expression and Purification
- Transformieren Escherichia coli-Zellen des Stammes BL21 (DE3) mit pET28 (b) Vektoren, codierend CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet und die katalytischen Domänen von SENP1.
- Angewachsen die transformierten Bakterien in 2xYT Medium für 3 Stunden bei 37 ° C (unter Schütteln bei 250 rpm), um eine optische Dichte von 0,5 bei 600 nm erreicht.
- Fügen Sie 100 uM Isopropyl-β-D-(IPTG) (Endkonzentration), um die Proteinexpression zu induzieren und schütteln für 16 Stunden bei 25 ° C bei 200 Umdrehungen pro Minute.
- Ernten die Bakterien durch centrifugation bei 10.000 rpm bei 4 ° C für 5 min und resuspendiert ihnen in einem Puffer aus 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl und 5 mM Imidazol.
- Beschallen die Zellen für 10 Minuten in 5-sec Intervallen bei einer Leistungseinstellung von 25 W mit MiSonics 4000 Sonicator und sammeln sie durch Zentrifugation bei 35.000 × g bei 4 ° C für 30 min.
- Einrichten der Säule mit 500 ml Ni-NTA-Kügelchen für 1 l-Kultur und Transfer des Überstandes in die Säule.
- Waschen des Harzes mit einem Puffer von 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 500 mM NaCl und 10 mM Imidazol zweimal.
- Eluieren Protein mit Puffer von 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 500 mM NaCl und 500 mM Imidazol und Dialyse in einen Puffer von 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl und 1 mM Dithiothreitol (DTT) bei 4 ° C über Nacht.
- Die Konzentrationen der gereinigten Proteine durch das Bradford-Assay. Alternatives Verfahren zur Protein-Konzentration Messungen SDS-PAGE-Gelelektrophorese werden und dann mit Coomassie-Blau gefärbt, gefolgt mit bildgebendenquantitativ.
3. Quantitative FRET Spectrum Analysis
- Die allgemeine Strategie für den Test wurde am FRET Signalisierung (Abbildung 1). Die FRET-Paar wurde CyPet und YPet, an den N-und C-Termini tagged jeweils von Pre-SUMO1. SENP1 spaltet das Fusionsprotein CyPet-(pre-SUMO1)-YPet am Gly-Gly Seite auf SUMO1 der C-Terminus und somit löst die SUMO Schwanz mit YPet. Die FRET-Signal gestört wird, was zu einem Anstieg der Emission aus CyPet und eine dramatische Abnahme der YPet die Emission bei der CyPet Anregungswellenlänge.
- Der absolute FRET-induzierte YPet die Emission CyPet direkte Emission und YPet direkte Emission (Abbildung: wenn es durch Licht mit einer Wellenlänge von 414 nm, die gesamte Fluoreszenzemission CyPet-(pre-SUMO1)-YPet bei 530 nm angeregt werden aus drei Quellen abgeleitet werden 2).
wo FL 530/414 </ Sub> ist die gesamte Fluoreszenz-Emission bei 530 nm, wenn sie bei 414 nm angeregt, FRET FL ist die absolute FRET-Signals, FL ist CyPet (cont) die direkte Emission CyPet wenn sie bei 414 nm angeregt, und FL YPet (cont) ist die YPet direkte Emission, wenn bei 414 nm angeregt. Der Index der (cont) steht für den Beitrag.
- Die direkte Emission von CyPet bei 530 nm war proportional zu seiner Emission bei 475 nm, wenn sie bei 414 nm mit einem konstanten Verhältnis von α angeregt. CyPet-SUMO1 wurde bei Konzentrationen von 50, 100, 200, 500 und 750 nM hergestellt und 1 mM und die Emissionen bei 475 und 530 nm wurden nach Anregung bei 414 nm zur α (Abbildung 3-1) zu bestimmen.
- Die direkte Emission von YPet bei 530 nm bei Anregung bei 414 nm war proportional zu seiner Emission bei 530 nm, wenn bei 475 nm mit einem konstanten Verhältnis von β angeregt. YPet bei Konzentrationen von 50, 100, 200, 500, 750 A hergestelltnd 1000 nm, und die Emission bei 530 nm wurde gemessen, wenn die Proben durch Wellenlängen von 414 und 475 nm angeregt wurden β (Abb. 3-2) zu bestimmen.
- Wenn CyPet-(pre-SUMO1)-YPet durch SENP1 verdaut wurde, die Spaltung CyPet-SUMO1 und die SUMO1 Schwanz mit YPet veröffentlicht. Wenn die Verbindung bei 414 nm angeregt wurde, wurde die Fluoreszenz-Emission bei 530 nm (FL '530/414) verringert, aber trotzdem in drei Teile unterteilt werden:
wo FL '530/414 die gesamte Fluoreszenzemission bei 530 nm ist nach der Verdauung, wenn bei 414 nm angeregt, FL' FRET ist die verbleibende absolute FRET-Signals ist FL 'CyPet (475/414) die CyPet Emission bei 475 nm nach der Verdauung, wenn Anregung bei 414 nm (hier die CyPet Emission ist aus zwei Teilen: unverdaute CyPet-(pre-SUMO1)-YPet und verdauten CyPet-SUMO1) und FL YPet(530/475) ist die Emission YPet wenn bei 475 nm angeregt, die konstant ob CyPet-(pre-SUMO1)-YPet verdaut wird oder nicht.
- Nach Verdauung durch SENP1, FRET die verbleibende Emission (FL 'FRET) ist:
wobei C die Gesamtkonzentration der CyPet-(pre-SUMO1)-YPet und x die Konzentration der verdauten CyPet-(pre-SUMO1)-YPet.
- Durch die Kombination aller Elemente ist die nachgewiesene Fluoreszenz-Emission bei 530 nm unter Anregung von 414 nm (FL '530/414):
4. FRET-basierten Protease-Assay für Enzyme Kinetische Studie
- CyPet-(pre-SUMO1)-YPet wurde mit der katalytischen Domäne von SENP1 bei 37 ° C in einem Puffer von 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 0,1% inkubiert (v /v) Tween-20 und 1 mM DTT bis zu einem Gesamtvolumen von 80 ml und übertragen in 384-Well-Platte.
- Durchläufe wurden durch Messung der Fluoreszenz-Emission bei 475 und 530 nm nach einer Anregung bei 414 nm in einem Multiwell-Plattenleser Fluoreszenz für 5 min mit 15-sec Intervallen durchgeführt.
- Die Reaktionsgeschwindigkeit (v) wurde mit der Änderung in der Menge an Substrat (S) als korreliert:
- Die Konzentration des Produkts exponentiell von 0 als [S] 0 (original Substratkonzentration) bei t = 0:
- Wenn t = 0, ist die ursprüngliche Geschwindigkeit (V 0):
- Die concentration des SENP1 wurde fixiert, und die Konzentration des CyPet-(pre-SUMO1)-YPet wurde aus 100-mal mehr als die Konzentration des Enzyms, das durch Michaelis-Menten-Gleichung erforderlich ist erhöht.
- All der fluoreszierenden Lesungen wurden von der quantitative FRET-Analyse-Methode analysiert und dargestellt in GraphPad Prism V Software, um die Michaelis-Menten-Gleichung passen. Die nichtlineare Regression kann auch mit Hilfe von mehr gemeinsamen Software-Pakete wie Tabellenkalkulations-Programmen (z. B. Microsoft Excel) durchgeführt werden.
5. Repräsentative Ergebnisse
Reifung der Pre-SUMO1 durch SENP1 kann durch Überwachen der Änderungen des Fluoreszenzsignals bei 475 und 530 nm während des Verfahrens bestimmt werden. Das Ergebnis zeigte, dass die Geschwindigkeit des Vor-SUMO1 Verdauung durch SENP1 in einem Substrat-dosisabhängigen Weise (Abbildung 4). Dies legt nahe, dass die katalytische Domäne von SENP1 zeigt ausgezeichnete Aktivität zur pre-SUMO1 der Reifung. Die anfängliche Reaktiontion Geschwindigkeiten wurden durch die obige Analyse mit verschiedenen Substratkonzentrationen (Tabelle 1) berechnet.
Der k cat / K M-Verhältnis wird im Allgemeinen verwendet, um die Effizienz verschiedener Enzyme mit einem Substrat oder einem bestimmten Enzyms mit verschiedenen Substraten zu vergleichen. K M und V max aus der Michaelis-Menten-Gleichung durch Auftragen der verschiedenen Anfangsgeschwindigkeiten, entsprechend erhalten werden zu den verschiedenen Konzentrationen von CyPet-(pre-SUMO1)-YPet (Abbildung 5) k cat wurde als erhalten.:
Gemäß der obigen Analyse betrug die berechnete K M 0,21 ± 0,04 pM, war der k cat 6,90 ± 0,28 s -1, und die k cat / K M betrug (3,2 ± 0,55) x 10 7 M -1 > S -1.
Abbildung 1. Graph der FRET-basierten Protease Assay für SENP die pre-sumos Reifung.
Abbildung 2. Quantitative Analyse von Fluoreszenz-Signal in Form von Beiträgen durch den Donor, Akzeptor und FRET. Dissektion der Emissionsspektren CyPet-(pre-SUMO1)-YPet unter Anregung bei 414 nm. FL CyPet (530/414) wird CyPet die Emission bei 530 nm unter Anregung von 414 nm, FRET FL ist die FRET-induzierte YPet Emission bei 530 nm unter Anregung von 414 nm und FL YPet (530/414) YPet die Emission bei 530 nm unter Anregung von 414 nm.
load/4430/4430fig3.jpg "/>
Abbildung 3. Berechnung der Richtung Emissionsfaktor α und β.
Abbildung 4. Quantitative Analyse von CyPet-(pre-SUMO1)-YPet durch unterschiedliche Übersetzungsverhältnisse der katalytischen Domäne von SENP1 verdaut. Reaktionen wurden innerhalb der ersten 5 min verfolgt.
Abbildung 5. Michaelis-Menten grafische Analyse der CyPet-(pre-SUMO1)-YPet die Verdauung durch SENP1. Daten wurden aufgetragen und mittels GraphPad Prism V und nichtlineare Regression.
| [S] (uM) | V 0 (uM / s) | ||
| 0,115 | 0,0023 ± 0,00005 | 0,214 | 0,0028 ± 0,00004 |
| 0,407 | 0,0033 ± 0,00007 | ||
| 0,594 | 0,0037 ± 0,00013 | ||
| 0,725 | 0,0043 ± 0,00012 | ||
| 1,471 | 0,0051 ± 0,00036 | ||
| 1,899 | 0,0050 ± 0,00031 | ||
| 2,300 | 0,0050 ± 0,00062 |
Tabelle 1. Anfangsgeschwindigkeiten Bestimmung der pre-SUMO1 die Reifung durch SENP1. In jeder Substratkonzentration, wurden vier Proben verwendet werden, um die Verdauung zu messen. Die Standardabweichung kam aus den Variationen dieser vier Proben.
| K M (uM) | k cat (s-1) | k cat / k M (M -1 • s-1) |
| 0,21 ± 0,04 | 6,90 ± 0,28 | 3,2 ± 0,55 × 10 7 |
Tabelle 2. Kinetische Parameter der Pre-SUMO1 die Reifung durch SENP1 durch quantitative FRET-Analysen. Die Standardabweichung kam aus den vier Proben in jeder Substratkonzentration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FRET-Technologie verwendet wurde, um die Pre-SUMO1 SENP1 Reifung von 9 studieren. GFP-YFP wurde als FRET-Paar und ratiometrische Analyse, die das Verhältnis von Akzeptor zu Donor Emissionen verwendet, wurde verwendet, um die kinetischen Eigenschaften charakterisieren. Es besteht jedoch keine Berücksichtigung von Donor und Akzeptor Eigenfluoreszenz im herkömmlichen ratiometrische FRET-Analyse. Das Verhältnis nicht direkt mit der Menge an verdauten Substrat korrelieren.
Hier berichten wir über eine entwickelte hochempfindliche FRET-basierten Protease Assay, um die Kinetik der pre-SUMO1 die Reifung durch SENP1 studieren. Im Gegensatz zu den früheren ratiometrisch Ansatz, wir grundlegend verbessert das Verfahren mit einer neuen Theorie der FRET-Signals für die kinetische Analyse und experimentelle Verfahren zur Ableitung von kinetischen Parameter durch die Bestimmung der quantitativen Beiträge der Selbst-Fluoreszenz von Donor und Akzeptor, und die reale FRET- induzierte Akzeptors Emission. Ratiometrische Analyse kann das nicht tun. DieUnwissenheit selbst Fluoreszenzemissionen von Donor und Akzeptor kann zu einer Überschätzung des FRET-Signals und des Spenders Emissionen führen. Die Überschätzungen möglicherweise nicht stark beeinflussen die endgültige k cat / K M-Verhältnis (3,81 x10 7 M -1 s -1 für die ratiometrische Analyse, 3,2 x10 7 M -1 s -1 von unseren quantitativen FRET-Analyse), aber die Wirkung ist mehr offensichtlich, wenn die Untersuchung der einzelnen Parameter, K M (0,098 vs 0,21 uM) und k cat (3,43 s -1 vs 6,90 s -1), die wichtig bei der Bestimmung der geschwindigkeitsbestimmende Schritt und Inhibitor Potenz von Enzymen sind.
Die Methode, die wir berichten hier ist ein Ein-Schritt-Assay von Protease-Kinetik-Parameter und erfordert nur molekulare Klonierung und Proteinexpression ohne radioaktive Markierung oder teure Instrumente. Die Ein-Schritt-Verfahren vereinfacht nicht nur die experimentellen Verfahren, sondern begrenzt auch eine MengeVariationen. Die fluoreszierenden-markierte Proteine sind in der wässrigen Phase, die typischerweise ähnlich ihrer natürlichen Umgebung in Zellen. Fluoreszenzintensität kann durch allgemeine Fluoreszenzspektroskopie oder Fluoreszenz Platereader, die überall erhältlich sind, bestimmt werden. Verglichen mit dem traditionellen "Gel-based"-Verfahren bietet unser FRET-basierten Proteaseassay mehrere Vorteile, darunter höhere Empfindlichkeit, Echtzeit-Messung und weniger Zeit und Arbeit benötigt. Darüber hinaus sind die Methodik und Verfahren der Protease Kinetik Parameter Bestimmungen umweltfreundliche und ungefährliche Materialien, wie Radioisotope oder ätzenden Chemikalien. Darüber hinaus können die hochempfindliche FRET-Assay im High-Throughput biologischen Assays, wie Protease-Inhibitor-Screenings verwendet werden. Die kinetische Untersuchung kann auch verwendet werden, um die Eigenschaften der Inhibitoren (zB Ki, IC50) zu charakterisieren.
Daher ist die hochempfindliche quantitative FRET-based Proteasetests könnte ein starker Ansatz bei der Entwicklung von genomweiten Protease-Substrat-Profiling und Inhibitor-Screenings sein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir sind sehr dankbar, dass Victor GJ Rodgers für wertvolle Ratschläge. Wir danken allen Mitgliedern der Liao-Gruppe für sehr enge gemeinsame Arbeit und für die Hilfe bei dieser Studie. Diese Studie wurde von den National Institutes of Health (Grant AI076504 JL) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR II TOPO Kit | Invitrogen | K466040 | |
| 2xYT | Research Products Internationa.l Corp. | X15600 | |
| Ni-NTA Agrose | Thermo Scientific | 88222 | |
| Coomassie plus (Bradford) Assay Regent | Thermo Scientific | 23238 | |
| 384-well plate (glass bottom) | Greiner | 781892 | |
| FlexStation II 384 plate reader | Molecular Device |
References
- Johnson, E. S. Protein modification By SUMO. Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes & Development. 18, 2046-2059 (2004).
- Hay, R. T. SUMO: a history of modification. Molecular Cell. 18, 1-12 (2005).
- Müller, S., Hoege, C., Pyrowolakis, G., Jentsch, S. SUMO, ubiquitin's mysterious cousin. Nature. , 202-210 (2001).
- Hochstrasser, M. SP-RING for SUMO: new functions bloom for a ubiquitin-like protein. Cell. , 5-8 (2001).
- Drag, M., Salvesen, G. S. DeSUMOylating enzymes-SENPs. IUBMB Life. 60, 734-742 (2008).
- Mukhopadhyay, D., Dasso, M. Modification in reverse: the SUMO proteases. Trends in Biochemical Sciences. 32, 286-295 (2007).
- Reverter, D., Lima, C. D. Structural basis for SENP2 protease interactions with SUMO precursors and conjugated substrates. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1060-1068 (2006).
- Shen, L., et al. SUMO protease SENP1 induces isomerization of the scissile peptide bond. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1069-1077 (2006).
- Horton, R., Strachan, E., Vogel, K., Riddle, S. A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein. Analytical Biochemistry. 360, 138-143 (2007).
- Mikolajczyk, J., et al. Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-specific Proteases: PROFILING THE SPECIFICITIES AND ACTIVITIES OF HUMAN SENPs. Journal of Biological Chemistry. 282, 26217-26224 (2007).
- Kolli, N., Mikolajczyk, J., Drag, M., Mukhopadhyay, D., Moffatt, N., Dasso, M., Salvesen, G., Wilkinson, K. D. Distrubition and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes. Biochem. J. , 335-344 (2010).
- Drag, M., Mikolajczyk, J., Krishnakumar, I. M., Huang, Z., Salvesen, G. S. Activity profiling of human deSUMOylating enzymes (SENPs) with synthetic substrates suggests an unexpected specificity of two newly characterized members of the family. Biochemical Journal. 409, 461 (2008).
- Engels, I. H., et al. A time-resolved fluorescence resonance energy transfer-based assay for DEN1 peptidase activity. Analytical Biochemistry. 390, 85-87 (2009).
- Martin, S., Hattersley, N., Samuel, I., Hay, R., Tatham, M. A fluorescence-resonance-energy-transfer-based protease activity assay and its use to monitor paralog-specific small ubiquitin-like modifier processing. Analytical Biochemistry. 363, 83-90 (2007).
- Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. Nature Biotechnology. 23, 355-360 (2005).
