Summary
FRETの定量分析（フェルスター共鳴エネルギー転移）信号を含む新規な方法は、酵素反応速度論を研究するために記述されている。
Abstract
ユビキチンまたはユビキチン様タンパク質（Ubls）を持つタンパク質の可逆的翻訳後修飾は、広く動的にタンパク質の活性を調節し、多くの生物学的プロセスで多様な役割を持っているために使用されます。たとえば、SUMOは共有結合で細胞周期調節、細胞の生存と死、DNA損傷応答、ストレス応答1月5日を含む多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を持つ大規模な番号またはタンパク質を変更します。 SUMO特異的プロテアーゼとしてSENP、SUMO前駆体の成熟にエンドペプチダーゼとして、あるいはその標的タンパク質からSUMOを削除し、SUMO化サイクル1,3,6,7をリフレッシュするイソペプチダーゼとして機能します。
酵素の触媒効率や特異性は、最高の速度定数は、k 猫 / K Mの比であることを特徴とする。いくつかの研究では、SUMO-SENPペアの速度論的パラメータは、RAD、ポリアクリルアミドゲルベースのウェスタンブロットを含む様々な方法によって決定された基板8から13というラベルの付いたioactive標識基質、蛍光化合物またはタンパク質。しかし、 "ネイティブ"のタンパク質を使用しましたが、ポリアクリルアミドゲルベースの技術は、面倒で技術的に厳しいですが、その容易に詳細な定量分析には役立たない。 （7 -アミノ-4 - carbamoylmetylcoumarin）[ACC]またはAMC（7 -アミノ-4 -メチルクマリン）蛍光体でテトラペプチドまたはタンパク質を用いた研究から得られたK 猫 / K M天然の基質よりも低い二桁までのいずれかであったまたは明らかにiso-およびSENPsのエンドペプチダーゼの活動を区別することはできません。
最近では、プロテアーゼアッセイと脱ユビキチン化酵素（ダビング）またはSENPsを勉強するために使用されたベースがFRETは、シアン蛍光タンパク質（CFP）と黄色蛍光タンパク質（YFP）9,10,14,15のFRETペア。プロテアーゼAC用信号モニタのFRETのドナー発光に対するアクセプター発光の比率は、定量的なパラメータとして使用されましたtivity決定。しかし、この方法では、アクセプターとドナーの自己蛍光によるアクセプターとドナーの発光波長での信号のクロスコンタミネーションを無視し、したがって、正確ではありませんでした。
我々はSENP1によってプリSUMO1成熟の速度論的パラメータを決定するための新規高感度かつ定量的なFRETベースプロテアーゼアッセイを開発しました。工学的には、大幅に改善FRET効率と蛍光量子収率とペアCyPetとYPetのFRET CyPet-（プリSUMO1）YPet基板16を生成するために使用された。私たちは、差別やドナーとアクセプターが寄与するとそれぞれ、アクセプターおよび発光波長でFRETが絶対的な蛍光シグナルを定量化した。 K 猫 / K Mの値は（3.2±0.55）として得た一般的な酵素の速度論的パラメータと一致しているプレSUMO1、向かってSENP1のx10の7 M -1 s -1で 。したがって、この方法は有効であり、使用することができます同様に他のプロテアーゼを特徴付けるためのSAの一般的なアプローチ。
Protocol
1。プラスミド構築
- PCRにより遺伝子のオープンリーディングフレームを増幅し、PCRII-TOPOベクターにPCR産物をクローニングします。
- 配列決定することによって製品を確認して、クローンをコードするcDNA CyPet-（プリSUMO1）YPet、CyPet-SUMO1、YPetおよびN-末端ヒスチジンタグ付きpET28（b）のベクトルにSENP1の触媒ドメイン。
2。タンパク質の発現と精製
- pET28とBL21（DE3）株の大腸菌細胞を形質転換（b）にCyPet-（プリSUMO1）YPet、CyPet-SUMO1、YPetとSENP1の触媒ドメインをコードするベクター。
- 600nmで0.5の光学濃度に到達するために37°C（250 rpmで振とう）で3時間2×YT培地で形質転換された細菌を増殖させた。
- タンパク質の発現を誘導し、25℃で16時間振盪100μMのイソプロピル-β-D-ガラクトシド（IPTG）（最終濃度）を追加°200rpmで、C。
- centrifugによって細菌を収穫4℃、10,000 rpmでation℃で5分間及び20mMのトリス-HCl（pH7.4）、50mMのNaCl、5 mMイミダゾールのバッファーで再懸濁します。
- MiSonics 4000ソニケーターを用いて25Wの電力設定で5秒間隔で10分間、細胞を超音波洗浄し、4℃で35000×gで遠心分離することにより、それらを収集℃で30分間。
- 1Lの培養のための500ミリリットルNi-NTAビーズを使用して列を設定し、カラムに上清を移す。
- 倍の20mMトリス-HCl（pH7.4）、500mMのNaCl、10mMのイミダゾール緩衝液を用いて樹脂を洗浄します。
- 20mMのトリス-HCl（pH7.4）、500mMのNaCl、500 mMイミダゾール、20 mMのトリス-HCl（pH7.4）、50mMのNaClおよび1mMジチオスレイトール（DTT）でのバッファに透析のバッファーで溶出タンパク質4℃で一晩。
- Bradford法により精製したタンパク質の濃度を決定する。タンパク質濃度測定のための代替方法は、イメージングと続か次にクーマシーブルーで染色したSDS-PAGEゲル電気泳動することとなります定量。
3。定量的なFRETスペクトラム解析
- アッセイのための一般的な戦略は、（ 図1）シグナリングFRETに基づくものであった。 FRET対を、CyPetとYPetは、事前SUMO1、それぞれ、N末端とC末端にタグ付けされていた。 SENP1 SUMO1のC末端のGly-Glyのサイトで切断融合タンパク質CyPet-（プリSUMO1）YPetとは、このように、YPetとSUMOの尾を解放します。信号がCyPetからの発光の増加とCyPet励起波長でYPetの排出の劇的な減少、その結果、破壊されたFRET。
- 絶対FRET誘起YPetの排出、CyPet直接排出とYPet直接排出（ 図 ：波長414 nmの光で励起すると、530nmでCyPet-（プリSUMO1）YPetの総蛍光発光は、次の3つのソースから導出することができる2）。
どこフロリダ414分の530 </ sub>の414 nmで励起し530nmの総蛍光発光は、FLはFRETが絶対にFRETシグナルであり、 フロリダ州CyPet（続き）は 414 nmで励起CyPet直接排出であり、 フロリダ州YPet（続き）は YPetです414 nmで励起直接排出。の添字（続き）が拠出を意味します。
- αの一定比率と414 nmで励起した場合に530 nmでCyPetの直接排出量は475nmで、その排出に比例していた。CyPet-SUMO1が50の濃度は、100、200、500、750 nMおよび1 mMで調製した、475および530 nmでの排出量α（ 図3-1）を決定するために414 nmで励起した後に測定した。
- βの定数比で475 nmで励起した場合に414 nmで励起下で530nmでYPetの直接排出量は530nmで、その排出に比例していた。YPetを50の濃度は、100、200、500、750で調製したND 1,000 nmで、サンプルをβ（ 図3-2）を決定するために414および475 nmの波長によって励起されたときに530nmの発光を測定した。
- CyPet-（プリSUMO1）YPetがSENP1によって消化されたとき、切断はCyPet-SUMO1とYPetとSUMO1尾をリリースしました。化合物は、414 nmで励起したとき、530nmの（ フロリダ州'414分の530）での蛍光発光が減少しましたが、まだのように3つの部分に分けることができます：
フロリダ'414 nmで励起した場合に414分の530は消化後に530nmで総蛍光発光であり、 フロリダ州'はどこに残っている絶対的なFRETシグナルですフレット 、 フロリダ'CyPet（414分の475）のとき消化後に475nmのCyPet放出で414 nmの（ここCyPet発光は二つの部分からなります。未消化CyPet-（プリSUMO1）YPetと消化CyPet-SUMO1）で励起し、FL YPet（475分の530）CyPet-（プリSUMO1）YPetが消化されているかどうか。定数である475 nmで励起YPet排出、ある
- SENP1による消化後、残りは放出（ フロリダ州'はFRET）であるFRET：
ここで、Cは CyPet-（プリSUMO1）YPet と xの合計濃度であると、消化の濃度CyPet-（プリSUMO1）YPetです。
- すべてのアイテムを組み合わせることにより、414 nmの励起下で530nmで（ フロリダ州'414分の530）で検出された蛍光発光は、次のとおりです。
4。酵素速度論的研究のためのFRETベースプロテアーゼアッセイ
- CyPet-（プリSUMO1）YPetは（20mMのトリス-HCl（pH7.4）、50mMのNaCl、0.1％の緩衝液中で37℃でSENP1の触媒ドメインとインキュベートしたV /80ミリリットルの全体積V）のTween-20および1mM DTTおよび384ウェルプレートに移した。
- ランは、15秒間隔で5分間蛍光マルチウェルプレートリーダーで414 nmで励起した後に475および530 nmでの蛍光発光を測定することにより行った。
- 反応速度（v）のように基板（S）の量の変化と相関していた：
- 生成物の濃度は 、t = 0 [S] 0（元の基質濃度）として、0から指数関数的に増加した。
- T = 0のとき、元の速度（V 0）は、次のとおりです。
- 濃SENP1のentrationを固定し、CyPet-（プリSUMO1）YPetの濃度がミカエリス·メンテン式によって必要とされる酵素の濃度よりも100倍以上まで増加した。
- 蛍光測定値のすべてが定量的なFRET分析法により分析し、ミカエリス·メンテン式に合わせてグラフパッドプリズムVソフトウェアにプロットした。非線形回帰も、スプレッドシートプログラム（Microsoft Excelなど）のようなより一般的なソフトウェアパッケージの助けを借りて行うことができます。
5。代表的な結果
SENP1による事前SUMO1の成熟は、プロセス中に475および530 nmでの蛍光信号の変化を監視することによって決定することができる。結果が示され、その基板用量依存的にSENP1による事前SUMO1消化の速度（ 図4）。プリSUMO1の成熟のための優れた活性SENP1展示の触媒ドメインというこれが示唆している。初期REACる速度が異なる基質濃度（ 表1）上記の分析により算出した。
K 猫 / K M比は 、一般に、1つの基板または異なる基質を持つ特定の酵素と異なる酵素の効率を比較するために使用されます、KとMとV maxは 、様々な初期速度をプロットすることにより、ミカエリス·メンテン式から得ることができ、対応する。CyPet-（プリSUMO1）YPet（ 図5）の異なる濃度に k 猫は、次のように得られた：
上記の分析によると、計算されたK Mは 0.21±0.04μMでは、k catは ±0.28 s -1で 6.90であった、 と k 猫 / K M比 （0.55±3.2）であったx10の7 M -1 > s -1で 。
図1 SENPのプリSUMOs成熟のためのFRETベースプロテアーゼアッセイのグラフ。
図2ドナー、アクセプターとFRETによる貢献として、蛍光シグナルの定量分析。 CyPet-414 nmで励起下（プリSUMO1）YPet。 フロリダCyPet（414分の530）からの発光スペクトルの解剖 CyPetの排出量は414 nmの励起下で530nmである、 フロリダFRET FRETによって誘発される414 nmの励起下で530nmでYPet放出、およびFL YPet（414分の530）で414 nmの励起下で530nmでYPetの放出である。
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図3方向排出係数αとβの計算。
図4 SENP1の触媒ドメインの異なる比率で消化CyPet-（プリSUMO1）YPetの定量分析。反応は、最初の5分以内にモニターした。
図5 SENP1によってCyPet-（プリSUMO1）YPetの消化のミカエリス-メンテングラフィカル解析。データをプロットし、グラフパッドプリズムVおよび非線形回帰により分析した。
| [S]（μM） | V 0（μm/ sで） | ||
| 0.115 | 0.0023±0.00005 | 0.214 | 0.0028±0.00004 |
| 0.407 | 0.0033±0.00007 | ||
| 0.594 | 0.0037±0.00013 | ||
| 0.725 | 0.0043±0.00012 | ||
| 1.471 | 0.0051±0.00036 | ||
| 1.899 | 0.0050±0.00031 | ||
| 2.300 | 0.0050±0.00062 |
表1。SENP1による事前SUMO1の成熟の初期速度を決定。各基質濃度では、4つのサンプルは、消化を測定するために使用されていました。標準偏差は、これらの4つのサンプルのバリエーションから来ました。
| K M（μM） | K 猫 （S-1） | K 猫 / K M（M -1•S-1） |
| 0.21±0.04 | 6.90±0.28 | 3.2±0.55×10 7 |
表2定量によってSENP1による事前SUMO1の成熟の速度論的パラメータは、FRET分析。標準偏差は、各基質濃度で4つのサンプルから来ました。
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Discussion
FRET技術はSENP1 9でプリSUMO1の成熟を 研究するために使用されています。 CFP-YFPは、ドナー·アクセプターへの排出量の比率であるFRETペアとレシオメトリック分析、として使用された速度論的性質を特徴づけるために使用されていました。しかし、伝統的なレシオメトリックでの自己蛍光がFRET分析ドナーとアクセプターのは考慮されていません。比は、直接消化された基質の量と相関しない。
ここでは、SENP1によってプリSUMO1の成熟の運動を研究するために開発された高感度のFRETベースプロテアーゼアッセイを報告している。前のレシオメトリックなアプローチとは対照的に、我々は根本的にドナーとアクセプターからの自己蛍光の定量的な貢献を決定することによって、速度論的パラメータを導出する動力学的解析と実験的な手順については、FRETシグナルの新しい理論と方法を改善し、本当のは、FRET-誘発アクセプタの発光。レシオメトリックな分析はこれを行うことはできません。ザドナーとアクセプターの自己蛍光放出の無知はFRETシグナルとドナーの発光の過大評価につながる可能性があります。 overestimationsが大幅決勝K 猫 K / M比（レシオメトリック分析のための3.81×10 7 M -1 s -1で 、3.2×10 7 M -1 s -1で私たちの定量的なFRET解析による）に影響を与えないかもしれませんが、効果はそれ以上です律速段階とする酵素の阻害剤の効力を決定する上で重要であり、個々のパラメータは、K、M（0.098対0.21μM）およびK 猫 （3.43秒-1対6.90秒-1）、勉強するときは明らか。
我々はここで報告方法は、プロテアーゼ動態パラメータのワンステップアッセイであり、放射性標識または高価な機器なしでのみ分子クローニングとタンパク質発現を必要とします。ワンステップの手順は、実験手順を簡素化するだけでなく、多くのことを制限するだけでなく、バリエーション。蛍光標識タンパク質は、典型的には、細胞内の自然環境に似ている水相である。蛍光強度は、広く利用可能である一般的な蛍光分光法または蛍光プレートリーダーによって決定することができる。伝統的な "ジェルベース"の方法によった場合に比べ、私たちのFRETベースプロテアーゼアッセイは、感度の向上、リアルタイムで測定し、必要に少ない時間と労働を含む、いくつかの利点を提供しています。さらに、プロテアーゼ動態パラメータの測定の方法論と手順では、このような放射性同位元素または過酷な化学物質など環境に配慮し、非危険物である。また、高感度FRETベースアッセイは、プロテアーゼ阻害剤の上映など、高スループットの生物学的アッセイで使用することができる。運動研究もインヒビターの特性（ 例えば起 、IC50）を特徴付けるために使用することができます。
したがって、高感度定量がFRET-BASEDプロテアーゼアッセイは、ゲノムワイドなプロテアーゼ基質プロファイリングおよびインヒビタースクリーニングを開発する上で強力なアプローチである可能性があります。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
私たちは、貴重なアドバイスのためにビクターGJロジャースに大変感謝しております。我々は非常に密接な共同作業のために、この研究のヘルプは遼グループのすべてのメンバーに感謝します。この研究は、米国国立衛生研究所（JLにグラントAI076504）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR II TOPO Kit | Invitrogen | K466040 | |
| 2xYT | Research Products Internationa.l Corp. | X15600 | |
| Ni-NTA Agrose | Thermo Scientific | 88222 | |
| Coomassie plus (Bradford) Assay Regent | Thermo Scientific | 23238 | |
| 384-well plate (glass bottom) | Greiner | 781892 | |
| FlexStation II 384 plate reader | Molecular Device |
References
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