Summary
涉及的FRET（福斯特共振能量转移）信号的定量分析酶动力学研究的一种新方法。
Abstract
可逆的翻译后修饰的蛋白质与泛素或泛蛋白 - 样的蛋白质（Ubls）被广泛地用于动态调节蛋白的活性，并具有在许多生物过程中的各种不同的角色。例如，SUMO共价键修改大量蛋白质的重要角色，在许多细胞过程，包括细胞周期调控，细胞的生存和死亡，DNA损伤反应和应激反应1-5。 SENP，SUMO特异性蛋白酶，成熟的SUMO前体肽链内切酶的功能，或作为isopeptidase删除SUMO从靶蛋白SUMO化循环刷新1,3,6,7。
或特异性的酶的催化效率最好是其特征在于由比率的动力学常数，K 猫 / K M。在几项研究中，的动力学参数的SUMO-SENP对已确定的各种方法，包括基于聚丙烯酰胺凝胶Western-blot检测，RADIOActive的标记底物，荧光化合物或蛋白质标记底物8-13。然而，聚丙烯酰胺凝胶为基础的技术，它使用“本土”的蛋白质，但费力，技术要求高，不容易借给自己详细的定量分析。所得到的K 猫 / K M从使用的四肽或蛋白的研究，与ACC（7 -氨基-4-carbamoylmetylcoumarin）或AMC（7 -氨基-4 -甲基香豆素）荧光团要么达两个数量级低于天然底物或不能明确区分和肽链内切酶的活动SENPs。
最近，基于FRET的蛋白酶检测使用，研究去泛素酶（DUBS）或SENPs的FRET对青色荧光蛋白（CFP），黄色荧光蛋白（YFP）9,10,14,15。受体发射的比率被用作供体发射的定量参数FRET蛋白酶交流信号监视器拉了一的决心。然而，这种方法忽略的信号交叉污染的受体和供体受体和供体荧光发射波长，因而是不准确的。
我们开发了一个新的高度基于FRET的蛋白酶敏感和定量分析，确定动力学参数的SUMO1成熟的SENP1。一种工程FRET对CyPet的和YPet显着提高的FRET效率和荧光量子产率，被用来生成的CyPet（预SUMO1）-YPet基板16。我们差异化和量化的绝对贡献的供体和受体和FRET在接受器和发射波长，荧光信号。得到的k 猫 / K M的值（3.2±0.55）×10 7 M -1 -1 SENP1朝向预SUMO1，这是与一般的酶动力学参数。因此，这种方法是有效的，并可以使用了一个通用的方法来描述以及其他蛋白酶。
Protocol
1。质粒的构建。
- 通过PCR扩增的基因的开放阅读框架，PCR产物克隆到pCRII-TOPO载体中。
- 通过测序确认产品，和克隆的cDNA编码CyPet-（预SUMO1）-YPet，-SUMO1 CyPet，YPet和催化结构域的SENP1到pET28（二）的N-末端六组氨酸标签的向量。
2。蛋白质表达与纯化
- 转化大肠杆菌菌株BL21（DE3）细胞与pET28（二）编码CyPet-（预SUMO1）-YPet，-SUMO1 CyPet，YPet和催化结构域的SENP1的载体。
- 3小时的2xYT培养基中生长的转化的细菌在37℃下（在250rpm摇动），达到在600nm处的光密度为0.5。
- 加入100μM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）（最终浓度），以诱导蛋白表达，并在25℃下振摇16小时以200rpm。
- 收获的细菌centrifug振荡器在10,000 rpm下在4℃下5分钟，并再悬浮在一个缓冲区中的20mM Tris-HCl（pH值7.4）中，50 mM氯化钠，和5mM咪唑。
- 在功率设置为25 W使用MiSonics 4000超声波发生器，超声处理10分钟的细胞以5秒的间隔，并通过离心收集它们在35,000 xg离心在4℃下进行30分钟。
- 设置列用500毫升的Ni-NTA珠为1 L培养上清液转移入列。
- 的20mM Tris-HCl（pH值7.4）中，500 mM氯化钠，10mM咪唑两次用缓冲液洗涤树脂。
- 厄鲁特蛋白质用缓冲液的20mM Tris-HCl（pH值7.4）中，500 mM氯化钠，和500mM咪唑的20mM的Tris-HCl（pH值7.4），50 mM氯化钠和1mM二硫苏糖醇（DTT）到一个缓冲区和透析4°C过夜。
- 通过Bradford法确定的纯化的蛋白质的浓度。蛋白质浓度测量的另一种方法，将SDS-PAGE凝胶电泳，然后用考马斯亮蓝染色，然后用成像定量。
3。定量荧光共振能量转移频谱分析仪
- 检测的总体战略是基于FRET信号（ 图1）。 FRET对，CyPet和YPet的，被标记的N-和C-末端，分别预SUMO1。 SENP1切割融合蛋白CyPet-（预SUMO1）YPet SUMO1的C-末端的Gly-甘氨酸站点，因此，发行与YPet SUMO的尾巴。 FRET的信号被破坏，导致增加的排放物CyPet和急剧减少YPet的排放的CyPet激发波长。
- 当激发光的波长414nm处，的总荧光发射的CyPet（预-SUMO1）-YPet在530 nm处可以被来自从3来源：的绝对FRET-诱导YPet的排放，CyPet直接排放和YPet直接排放（ 图2）。
其中FL 四百十四分之五百三十〇 </ sub>的总荧光发射波长为530 nm时，在414 nm的激发，FL 荧光共振能量转移是绝对的共振信号，：FL CyPet（续）是CyPet直接排放兴奋时，位于414 nm，：FL YPet（续）是在YPet的兴奋时，位于414 nm的直接排放。 （续）下标代表了贡献。
- 在414 nm处激发时具有恒定 的比例的α，在530 nm处的直接排放CyPet是正比于它的发射波长在475 nm。CyPet SUMO1制备浓度为50，100，200，500，和750纳米和1mM和排放量在475和530 nm处分别测定激发后在414 nm处测定α（ 图3-1）。
- 在530 nm处的激发下在414 nm处的直接排放YPet成正比其在530 nm处的发射波长在475 nm激发时具有恒定 的比例，β。YPet制备浓度为50，100，200，500，750的届1,000纳米，和发射波长为530 nm，测定时，样品由414和475 nm的波长激发，以确定β（ 图3-2）。
- 由SENP1，当CyPet（预SUMO1）YPet消化，裂解CyPet-SUMO1和SUMO1尾YPet的。当化合物（ 佛罗里达州'530/414）在530 nm处的荧光发射波长在414 nm激发，被减少，但仍然可以被分为三个部分：
FL' 四百十四分之五百三十零的总消化后兴奋时，位于414 nm的荧光发射波长为530 nm，FL'FRET绝对是剩余的共振信号，FL'CyPet（475/414）是CyPet的排放量为475 nm时，消化后位于414 nm（CyPet排放在这里是由两部分组成：未消化CyPet-（预SUMO1）YPet，消化CyPet-SUMO1）激发和FL YPet（530/475）是在YPet的排放时，在475 nm的激发，这是不变的，是否CyPet-（预SUMO1）YPet消化或不。
- 由SENP1消化后，其它FRET发射（FL'FRET）是：
其中 C是总浓度CyPet-（预SUMO1）YPet 和 x是消化CyPet浓度（预SUMO1）YPet。
- 通过组合所有的项目中，检测出的荧光发射在530 nm下的414纳米（FL'530/414）的激发是：
4。基于FRET的蛋白酶含量，酶动力学研究
- CyPet-（预SUMO1）-YPet SENP1的催化结构域的孵育在37℃下在一个缓冲区中的20mM的Tris-HCl（pH值7.4），50 mM氯化钠，0.1％（体积/v）吐温20和1mM DTT的总体积为80ml，并转移到384孔板中。
- 运行，进行了15秒的间隔的5分钟，使用的激发波长为414 nm的荧光多孔板读数器后，通过测量在475和530 nm处的荧光发射。
- 反应速率（v）与在基片（S）的量的变化作为
- 成倍增加的产物浓度从0为[S] 0（原底物浓度）， 当 t = 0时：
- 当 t = 0时，原来的速度（V 0）是：
- 的浓固定，SENP1 entration和CyPet-（预SUMO1）-YPet的浓度增加至100倍以上酶的浓度，这是所需的Michaelis-Menten方程式。
- 所有的荧光读数由定量FRET分析方法进行分析，并绘制在V软件GraphPad棱镜适合Michaelis-Menten方程式。比较常见的套装软件，如电子表格程序（如Microsoft Excel）的帮助下，也可以进行非线性回归。
5。代表性的成果
成熟的预SUMO1 SENP1可以在此过程中通过监测在475和530 nm处的荧光信号中的变化确定。结果表明，预SUMO1消化SENP1的速度在基板剂量依赖性的方式（ 图4）。这表明，催化结构域的SENP1预SUMO1成熟表现出极好的活性。最初的反应TION速度计算具有不同的底物浓度（ 表1）通过上述分析。
的 k 猫 / K M比一般用于比较不同的酶的效率，与一个基板或一个特定的酶具有不同的基板，可以得到K M 和 V max通过绘制各种初始速度，对应从Michaelis-Menten方程式的不同浓度的CyPet-（预SUMO1）-YPet（ 图5），K 猫得到作为：
根据以上的分析，计算出的K M为0.21±0.04μM， 第 k 猫为6.90±0.28秒-1，并且第 k 猫 / K M比为（3.2±0.55）×10 7 M -1的 > -1。
图1。基于FRET的蛋白酶SENP的的前SUMOs成熟的分析图。
图2。的供体，受体和FRET定量分析荧光信号的贡献。夹层的发射光谱从CyPet（预SUMO1）YPet激发下，在414 nm处。：FL CyPet（四百一十四分之五百三十○）， 是CyPet的排放量在530 nm的激发下，414纳米，FL 荧光共振能量转移是在530纳米，414 nm的激发下荧光共振能量转移，诱导YPet排放，FL YPet（四百十四分之五百三十）YPet的排放量在530波长414 nm的激发下。
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图3。方向的排放因子α和β的计算。
图4。定量分析CyPet-（预SUMO1）-SENP1的催化结构域的不同比例的消化YPet。在第5分钟反应监测。
图5。米氏图形分析的SENP1 CyPet（预SUMO1）YPet的消化。数据绘制和GraphPad棱镜V和非线性回归分析。
| [S]（μM）的 | V 0（μM/秒） | ||
| 0.115 | 0.0023±0.00005 | 0.214 | 0.0028±0.00004 |
| 0.407 | 0.0033±0.00007 | ||
| 0.594 | 0.0037±0.00013 | ||
| 0.725 | 0.0043±0.00012 | ||
| 1.471 | 0.0051±0.00036 | ||
| 1.899 | 0.0050±0.00031 | ||
| 2.300 | 0.0050±0.00062 |
表1。初始速度确定前SUMO1的成熟SENP1。以各底物浓度，四个样品被用来衡量消化。来自这四个样品的变化的标准偏差。
| K M（μM）的 | ķ 猫 （1） | ķ 猫 / K M（M-1•S-1） |
| 0.21±0.04 | 6.90±0.28 | 3.2±0.55×10 7个 |
表2。前SUMO1的成熟SENP1通过定量荧光共振能量转移的动力学参数分析。来自四个样品在每个底物浓度的标准偏差。
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Discussion
FRET技术用于研究前SUMO1的成熟，由SENP1 9。 CFP-YFP用作FRET对和比例的分析，这是受体捐助排放比，用于表征的动力学性质。然而，有没有考虑供体和受体在传统比例的自身荧光共振分析。比例不直接与衬底消化量。
在这里，我们报告一个高度敏感的基于FRET的的蛋白酶分析研究动力学的前SUMO1的成熟SENP1。对比的比例的方法，从根本上提高一个新的理论方法与共振信号的动力学分析和实验过程，推导出动力学参数确定的供体和受体的自身荧光定量贡献，真正的FRET-诱导受体的排放。成比例的分析不能做到这一点。 “无知的供体和受体的荧光发射，可能会导致高估的共振信号和捐赠者的排放。高估可能极大地影响最终ķ 猫 / K M比值（3.81×10 7 M -1 3.2×10 7 M -1 -1 -1的比例分析，定量FRET分析），但效果更明显的学习时的各个参数，K M（0.098和0.21μM） 和 k 猫 （3.43 -1与6.90秒-1），这是重要的，在确定的限速步骤和抑制剂的酶的效力。
我们在这里报告的是一个单步检测蛋白酶动力学参数的方法，只需要分子克隆和无放射性标记的蛋白的表达或昂贵的仪器。一个个步骤，不仅简化了实验过程，但同时也限制了很多的变型。荧光标记的蛋白质，是在水相中，这通常是类似的他们在细胞中的自然环境。荧光强度可以由一般的荧光光谱法或荧光板阅读器，这是广泛使用的确定。与传统的“凝胶为基础”的方法相比，基于FRET的蛋白酶检测提供了几个优势，包括更高的灵敏度，实时测量，并减少需要的时间和劳动。此外，蛋白酶动力学参数测定的方法和程序，是环境友好型和非危险品，，如放射性同位素或苛刻的化学品。此外，基于FRET的高度敏感的方法可用于在高吞吐量的生物测定，如蛋白酶抑制剂放映。的动力学研究也可以被用来表征的抑制剂（ 例如文 ，其IC50）的属性。
因此，高度敏感的定量FRET-浅版蛋白酶检测可能成为一种强大的方法，发展的全基因组蛋白酶底物的分析和抑制剂放映。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们非常感谢维克多GJ罗杰斯宝贵的意见。我们感谢所有的廖组的成员非常密切的合作工作，并帮助这项研究。这项研究是由美国国立卫生研究院（批准AI076504 JL）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR II TOPO Kit | Invitrogen | K466040 | |
| 2xYT | Research Products Internationa.l Corp. | X15600 | |
| Ni-NTA Agrose | Thermo Scientific | 88222 | |
| Coomassie plus (Bradford) Assay Regent | Thermo Scientific | 23238 | |
| 384-well plate (glass bottom) | Greiner | 781892 | |
| FlexStation II 384 plate reader | Molecular Device |
References
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