Summary
Une nouvelle méthode qui analyse quantitative de FRET (Förster Resonance Energy Transfer) des signaux est décrite pour l'étude de la cinétique enzymatique.
Abstract
Réversibles modifications post-traductionnelles des protéines avec des protéines ubiquitine ou l'ubiquitine-like (UBLS) sont largement utilisés pour réguler dynamiquement l'activité des protéines et jouent des rôles divers dans de nombreux processus biologiques. Par exemple, SUMO modifie de façon covalente un grand nombre ou des protéines avec des rôles importants dans de nombreux processus cellulaires, y compris les cellules cycle de régulation, la survie cellulaire et la mort, la réponse dommages à l'ADN et de réponse au stress 1-5. SENP, comme SUMO protéase spécifique, fonctionne comme une endopeptidase dans la maturation de précurseurs ou sous forme SUMO isopeptidase pour supprimer SUMO de ses protéines cibles et actualiser le cycle 1,3,6,7 SUMOylation.
L'efficacité ou la spécificité catalytique d'une enzyme est mieux caractérisée par le rapport des constantes cinétiques k cat / K m. Dans plusieurs études, les paramètres cinétiques de SUMO-SENP paires ont été déterminées par des méthodes différentes, y compris en gel de polyacrylamide à base de western-blot, radIOActive substrat marqué, un composé fluorescent ou une protéine marquée substrat 8-13. Cependant, les techniques de polyacrylamide à base de gel, qui étaient les «indigènes» des protéines, mais sont laborieux et techniquement exigeant, qui ne se prêtent pas facilement à une analyse quantitative détaillée. Le obtenues k cat / K M d'études utilisant tétrapeptides ou des protéines avec un ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) ou AMC (7-amino-4-méthylcoumarine) fluorophore étaient soit jusqu'à deux ordres de grandeur plus faible que les substrats naturels ou ne peut pas distinguer clairement les activités et les iso-endopeptidase de SENPs.
Tests de protéase récemment, à base de FRET ont été utilisés pour étudier les enzymes désubiquitination (DUB) ou SENPs avec la paire FRET de la protéine fluorescente cyan (CFP) et la protéine fluorescente jaune (YFP) 9,10,14,15. Le taux d'émission de l'accepteur d'émission du donneur a été utilisé en tant que paramètre quantitatif de FRET signal de contrôle en courant alternatif pour la protéasetivité détermination. Cependant, cette méthode de signaux ignorés contaminations croisées à l'accepteur et donneur d'onde d'émission accepteur et donneur d'auto-fluorescence et donc n'était pas exacte.
Nous avons développé un roman très sensible et quantitative dosage de protease FRET basée sur la détermination des paramètres cinétiques de la pré-SUMO1 maturation par SENP1. Une ingénierie FRET CyPet paire et avec YPet considérablement amélioré l'efficacité et la fluorescence FRET rendement quantique, ont été utilisés pour générer le CyPet-(pré-SUMO1)-YPet substrat 16. Nous avons distingué et quantifiés absolues des signaux de fluorescence apportées par le donneur et l'accepteur et FRET aux longueurs d'onde d'émission et accepteurs, respectivement. La valeur de k cat / K M a été obtenu comme (3,2 ± 0,55) x 10 7 M -1 s -1 SENP1 vers pré-SUMO1, qui est en accord avec les généraux paramètres cinétiques enzymatiques. Par conséquent, cette méthode est valable et peut être utilisésa approche générale pour caractériser d'autres protéases ainsi.
Protocol
1. Constructions plasmidiques
- Amplifier les cadres ouverts de lecture des gènes par PCR et le clonage des produits PCR dans pCRII-TOPO vecteur.
- Confirmer les produits de séquençage, et cloner l'ADNc codant pour CyPet-(pré-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, et YPet domaines catalytiques de SENP1 dans l'pET28 (b) avec un vecteur étiquette hexahistidine N-terminale.
2. Expression et purification des protéines
- Transformer des cellules d'Escherichia coli de la souche BL21 (DE3) avec pET28 (b) des vecteurs codant CyPet-(pré-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet et les domaines catalytiques de SENP1.
- Cultivé des bactéries transformées dans un milieu 2xYT pendant 3 heures à 37 ° C (agitation à 250 tours par minute) pour atteindre une densité optique de 0,5 à 600 nm.
- Ajouter 100 uM isopropyl-β-D-galactoside (IPTG) (concentration finale) pour induire l'expression des protéines et agiter pendant 16 heures à 25 ° C à 200 tpm.
- Récolter les bactéries par centrifugtion à 10000 rpm à 4 ° C pendant 5 min et les remettre en suspension dans un tampon de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM de NaCl et 5 mM imidazole.
- Soniquer les cellules pendant 10 min dans 5 sec intervalles à une puissance de 25 W en utilisant MiSonics 4000 sonicateur et les récupérer par centrifugation à 35.000 xg à 4 ° C pendant 30 min.
- Mettre en place la colonne avec 500 ml de Ni-NTA perles de culture 1 L et transférer le surnageant dans la colonne.
- Laver la résine avec un tampon de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 500 mM de NaCl, et 10 mM d'imidazole deux fois.
- Protéines élue avec un tampon de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 500 mM et 500 mM d'imidazole et la dialyse dans un tampon de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 50 mM et 1 mM de dithiothréitol (DTT) à 4 ° C pendant la nuit.
- Déterminer les concentrations des protéines purifiées par la méthode de Bradford. Autre méthode pour la mesure des concentrations de protéines sera électrophorèse sur gel SDS-PAGE, puis colorées au bleu de Coomassie suivie par imageriequantitative.
3. FRET quantitative d'analyse spectrale
- La stratégie générale pour le test était basé sur le FRET de signalisation (Figure 1). La paire FRET, et CyPet YPet, a été marqué à l'extrémité N-et C-terminales, respectivement, de pré-SUMO1. SENP1 clive la protéine de fusion CyPet-(pré-SUMO1)-YPet sur le site Gly-Gly dans SUMO1 C-terminale et, ainsi, libère la queue avec YPet SUMO. Le signal de FRET est perturbé, ce qui entraîne une augmentation de l'émission de CyPet et une diminution spectaculaire des émissions de YPet de la longueur d'onde d'excitation CyPet.
- Lorsqu'il est excité par de la lumière de longueur d'onde 414 nm, l'émission de fluorescence totale de CyPet-(pré-SUMO1)-YPet à 530 nm peuvent être dérivés à partir de trois sources: des émissions de l'absolu FRET induite YPet, la CyPet directe d'émission et YPet directe d'émission (Figure 2).
où FL 530/414 </ Sub> est l'émission de fluorescence totale à 530 nm lorsqu'il est excité à 414 nm, FL FRET est l'absolu signal de FRET, FL CyPet (cont) est l'émission CyPet directe lorsqu'il est excité à 414 nm, et FL YPet (cont) est le YPet diriger des émissions lorsqu'il est excité à 414 nm. L'indice de (cont) représente la contribution.
- L'émission directe de CyPet à 530 nm est proportionnelle à son émission à 475 nm lorsqu'il est excité à 414 nm avec un rapport constant de α. CyPet-SUMO1 été préparées à des concentrations de 50, 100, 200, 500 et 750 nM et 1 mM , et les émissions à 475 et 530 nm ont été mesurées après excitation à 414 nm pour déterminer α (figure 3-1).
- L'émission directe de YPet à 530 nm sous excitation à 414 nm est proportionnelle à son émission à 530 nm lorsqu'il est excité à 475 nm avec un rapport constant de β. YPet été préparées à des concentrations de 50, 100, 200, 500, 750 Ae 1.000 nM, et l'émission à 530 nm a été mesurée lorsque les échantillons sont excités par des longueurs d'onde de 414 et 475 nm pour déterminer β (figure 3-2).
- Lorsque CyPet-(pré-SUMO1)-YPet a été digéré par SENP1, le clivage publié CyPet-SUMO1 et la queue SUMO1 avec YPet. Lorsque le composé est excité à 414 nm, l'émission de fluorescence à 530 nm (FL '530/414) a été diminué, mais peut encore être divisé en trois parties:
où FL '530/414 est l'émission de fluorescence totale à 530 nm après digestion lorsqu'il est excité à 414 nm, FL' FRET est le reste absolue signal de FRET, CyPet FL »(475/414) est l'émission CyPet à 475 nm après digestion quand excité à 414 nm (ici l'émission CyPet est en deux parties: non digérés CyPet-(pré-SUMO1)-YPet et digéré CyPet-SUMO1), et FL YPet(530/475) est l'émission YPet lorsqu'il est excité à 475 nm, qui est constante si CyPet-(pré-SUMO1)-YPet est digéré ou non.
- Après digestion par SENP1, le reste FRET émission (FL 'FRET) est la suivante:
où C est la concentration totale de CyPet-(pré-SUMO1)-YPet et x est la concentration de digéré CyPet-(pré-SUMO1)-YPet.
- En combinant tous les éléments, l'émission de fluorescence détectée à 530 nm sous excitation de 414 nm (FL '530/414) est la suivante:
4. Essai de la protéase à base de FRET pour l'étude cinétique enzymatique
- CyPet-(pré-SUMO1)-YPet a été incubé avec le domaine catalytique de SENP1 à 37 ° C dans un tampon de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 0,1% (v /v) de Tween-20 et 1 mM de DTT dans un volume total de 80 ml et transférée dans la plaque 384-puits.
- Essais ont été réalisés en mesurant l'émission de fluorescence à 475 et 530 nm après une excitation à 414 nm dans un lecteur de fluorescence de plaque multi puits pendant 5 min à 15-Sec intervalles.
- La vitesse de la réaction (V) est en corrélation avec la variation de la quantité de substrat (S) en tant que:
- La concentration du produit augmente de façon exponentielle à partir de 0 à [S] 0 (concentration en substrat d'origine) quand t = 0:
- Quand t = 0, la vitesse initiale (V 0) est la suivante:
- Le concentréentration de SENP1 est fixée, et la concentration de CyPet-(pré-SUMO1)-YPet a été augmentée de 100 fois supérieure à la concentration de l'enzyme, ce qui est requis par l'équation de Michaelis-Menten.
- Toutes les lectures fluorescentes ont été analysés par la méthode d'analyse FRET quantitative et tracés dans GraphPad Prism V Logiciel pour s'adapter à l'équation de Michaelis-Menten. La régression non linéaire peut également être effectuée à l'aide d'autres logiciels courants tels que des tableurs (comme Microsoft Excel).
5. Les résultats représentatifs
Maturation de la pré-SUMO1 par SENP1 peut être déterminée en contrôlant les variations du signal de fluorescence à 475 nm et 530 au cours du processus. Les résultats ont montré que la vitesse de pré-SUMO1 digestion par SENP1 substrat d'une manière dose-dépendante (Figure 4). Ceci suggère que le domaine catalytique de SENP1 présente une activité excellente pour la maturation du pré-SUMO1. La réaction initialetion vitesses ont été calculées par l'analyse ci-dessus avec des concentrations de substrat différentes (tableau 1).
Le k cat / K M est généralement utilisé pour comparer l'efficacité des différentes enzymes avec un substrat ou une enzyme particulière avec différents substrats. K M et V max peut être obtenu à partir de l'équation de Michaelis-Menten en traçant les différentes vitesses initiales, correspondant pour les différentes concentrations de CyPet-(pré-SUMO1)-YPet (figure 5) k cat a été obtenue comme.:
Selon l'analyse ci-dessus, la valeur calculée est de 0,21 M K ± 0,04 uM, le chat était k 6,90 ± 0,28 s -1 et k cat / K M ratio était de (3,2 ± 0,55) x 10 7 M -1 > S -1.
Figure 1. Graphe de test FRET protéase à base de SENP pré-sumos maturation.
Figure 2. Analyse quantitative de signal fluorescent à titre de contributions par le donneur, accepteur et FRET. La dissection des spectres d'émission de CyPet-(pré-SUMO1)-YPet sous excitation à 414 nm. CyPet FL (530/414) est des émissions CyPet de à 530 nm sous excitation de 414 nm, FL FRET est l'émission FRET induite YPet à 530 nm sous excitation de 414 nm, et FL YPet (530/414) est une émission YPet de à 530 nm sous excitation de 414 nm.
load/4430/4430fig3.jpg "/>
Figure 3. Calcul du facteur α et β direction d'émission.
La figure 4. L'analyse quantitative de CyPet-(pré-SUMO1)-YPet digéré par différentes proportions du domaine catalytique de SENP1. Les réactions ont été suivies dans les 5 premières minutes.
Figure 5. Michaelis-Menten analyse graphique de la digestion CyPet-(pré-SUMO1)-YPet par SENP1. Les données ont été tracées et analysées par GraphPad Prism V et la régression non linéaire.
| [S] (M) | V 0 (pM / s) | ||
| 0,115 | 0,0023 ± 0,00005 | 0,214 | 0,0028 ± 0,00004 |
| 0,407 | 0,0033 ± 0,00007 | ||
| 0,594 | 0,0037 ± 0,00013 | ||
| 0,725 | 0,0043 ± 0,00012 | ||
| 1,471 | 0,0051 ± 0,00036 | ||
| 1,899 | 0,0050 ± 0,00031 | ||
| 2,300 | 0,0050 ± 0,00062 |
Tableau 1. Initiale de détermination des vitesses de maturation pré-SUMO1 par SENP1. Dans chaque concentration de substrat, quatre échantillons ont été utilisés pour mesurer la digestion. L'écart-type est venu à partir des variations de ces quatre échantillons.
| K M (M) | k cat (s-1) | k cat / K m (M -1 s •-1) |
| 0,21 ± 0,04 | 6,90 ± 0,28 | 3,2 ± 0,55 x 10 7 |
Tableau 2. Paramètres cinétiques de maturation pré-SUMO1 par SENP1 par FRET quantitative d'analyse. L'écart-type est venu des quatre échantillons de chaque concentration de substrat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FRET technologie a été utilisée pour étudier la maturation pré-SUMO1 par SENP1 9. CFP-YFP a été utilisé comme la paire FRET et l'analyse ratiométrique, qui est le rapport de l'accepteur d'émissions de bailleurs de fonds, a été utilisé pour caractériser les propriétés cinétiques. Cependant, il n'ya aucune considération de donneur et accepteur d'auto-fluorescence dans le ratiométrique traditionnelle analyse FRET. Le rapport n'est pas directement corrélée avec la quantité de substrat digéré.
Nous rapportons ici un test très sensible développé protéase à base de FRET pour étudier la cinétique de maturation pré-SUMO1 par SENP1. Contrairement à l'approche précédente ratiométrique, nous sommes fondamentalement amélioré la méthode avec une nouvelle théorie du signal de FRET pour l'analyse cinétique et une procédure expérimentale pour déterminer les paramètres cinétiques par la détermination des contributions quantitatives de l'auto-fluorescence du donneur et de l'accepteur, et le réel FRET induite par l'émission de l'accepteur. Analyse radiométrique peut pas faire cela. Laignorance de soi-fluorescentes émissions de donneur et accepteur peut conduire à une surestimation du signal de FRET et l'émission du donneur. Les surestimations peut-être pas une grande incidence sur la finale k cat / K M (3,81 x10 7 M -1 s -1 pour l'analyse ratiométrique, 3,2 x10 7 M -1 s -1 par notre analyse FRET quantitative), mais l'effet est plus évidente lorsque l'on étudie les différents paramètres, K M (0.098 vs 0,21 uM) et k cat (3,43 vs 6,90 s -1 s -1), qui sont importants dans la détermination de l'étape limitant la vitesse et la puissance inhibiteur d'enzymes.
La méthode que nous rapportons est une méthode en une étape de paramètres cinétiques de protéase et ne nécessite que le clonage moléculaire et l'expression de protéines sans marquage radioactif ou instruments coûteux. La procédure en une étape non seulement simplifie la procédure expérimentale, mais limite aussi beaucoupdes variations. Les protéines marquées par fluorescence sont dans la phase aqueuse, ce qui est généralement similaire à leur environnement naturel dans les cellules. L'intensité de fluorescence peut être déterminée par spectroscopie de fluorescence général ou lecteurs de plaques de fluorescence, qui sont largement disponibles. Comparé à la traditionnelle "à base de gel" méthode, notre analyse FRET protéase à base offre plusieurs avantages, notamment une sensibilité accrue, mesure en temps réel, et moins de temps et le travail nécessaires. En outre, la méthodologie et la procédure de détermination des paramètres cinétiques de protéase sont des matériaux respectueux de l'environnement et non dangereux, tels que les radio-isotopes ou de produits chimiques agressifs. En outre, le très sensible FRET à base de test peut être utilisé en haut débit des dosages biologiques, tels que les inhibiteurs de la protéase projections. L'étude cinétique peut également être utilisé pour caractériser les propriétés des inhibiteurs (par exemple, Ki, CI50).
Par conséquent, le quantitatif très sensible FRET-based tests de protéase pourrait être une approche efficace dans le développement de l'ensemble du génome protéase-substrat profilage et des projections inhibitrices.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous sommes très reconnaissants à Victor GJ Rodgers pour ses conseils précieux. Nous tenons à remercier tous les membres du groupe Liao pour le travail collaboratif très proche et de l'aide pour cette étude. Cette étude a été financée par le National Institutes of Health (Grant AI076504 à JL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR II TOPO Kit | Invitrogen | K466040 | |
| 2xYT | Research Products Internationa.l Corp. | X15600 | |
| Ni-NTA Agrose | Thermo Scientific | 88222 | |
| Coomassie plus (Bradford) Assay Regent | Thermo Scientific | 23238 | |
| 384-well plate (glass bottom) | Greiner | 781892 | |
| FlexStation II 384 plate reader | Molecular Device |
References
- Johnson, E. S. Protein modification By SUMO. Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes & Development. 18, 2046-2059 (2004).
- Hay, R. T. SUMO: a history of modification. Molecular Cell. 18, 1-12 (2005).
- Müller, S., Hoege, C., Pyrowolakis, G., Jentsch, S. SUMO, ubiquitin's mysterious cousin. Nature. , 202-210 (2001).
- Hochstrasser, M. SP-RING for SUMO: new functions bloom for a ubiquitin-like protein. Cell. , 5-8 (2001).
- Drag, M., Salvesen, G. S. DeSUMOylating enzymes-SENPs. IUBMB Life. 60, 734-742 (2008).
- Mukhopadhyay, D., Dasso, M. Modification in reverse: the SUMO proteases. Trends in Biochemical Sciences. 32, 286-295 (2007).
- Reverter, D., Lima, C. D. Structural basis for SENP2 protease interactions with SUMO precursors and conjugated substrates. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1060-1068 (2006).
- Shen, L., et al. SUMO protease SENP1 induces isomerization of the scissile peptide bond. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1069-1077 (2006).
- Horton, R., Strachan, E., Vogel, K., Riddle, S. A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein. Analytical Biochemistry. 360, 138-143 (2007).
- Mikolajczyk, J., et al. Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-specific Proteases: PROFILING THE SPECIFICITIES AND ACTIVITIES OF HUMAN SENPs. Journal of Biological Chemistry. 282, 26217-26224 (2007).
- Kolli, N., Mikolajczyk, J., Drag, M., Mukhopadhyay, D., Moffatt, N., Dasso, M., Salvesen, G., Wilkinson, K. D. Distrubition and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes. Biochem. J. , 335-344 (2010).
- Drag, M., Mikolajczyk, J., Krishnakumar, I. M., Huang, Z., Salvesen, G. S. Activity profiling of human deSUMOylating enzymes (SENPs) with synthetic substrates suggests an unexpected specificity of two newly characterized members of the family. Biochemical Journal. 409, 461 (2008).
- Engels, I. H., et al. A time-resolved fluorescence resonance energy transfer-based assay for DEN1 peptidase activity. Analytical Biochemistry. 390, 85-87 (2009).
- Martin, S., Hattersley, N., Samuel, I., Hay, R., Tatham, M. A fluorescence-resonance-energy-transfer-based protease activity assay and its use to monitor paralog-specific small ubiquitin-like modifier processing. Analytical Biochemistry. 363, 83-90 (2007).
- Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. Nature Biotechnology. 23, 355-360 (2005).
