Una instalación de Bajo Costo para audiometría conductual en roedores

Summary

Un método rápido y de bajo costo para la determinación del comportamiento de la audiencia parámetros como los umbrales de audición, discapacidad auditiva o percepciones fantasmas (tinnitus subjetivo) se describe. Utiliza pre-pulso de inhibición de la respuesta de sobresalto acústico y se puede implementar fácilmente en un ordenador personal mediante un AD programable / DA convertidor y un sensor piezoeléctrico.

Abstract

En la investigación auditiva animal, es crucial disponer de información precisa sobre los parámetros básicos de la audición de los sujetos animales que están implicadas en los experimentos. Dichos parámetros pueden ser las características fisiológicas de respuesta de la vía auditiva, por ejemplo, a través de la audiometría del tronco cerebral (BERA). Sin embargo, estos métodos permiten extrapolaciones sólo indirecta e incierta acerca de la percepción auditiva que corresponde a estos parámetros fisiológicos. Para evaluar el nivel de percepción de la audición, los métodos de comportamiento tienen que ser utilizados. Un problema potencial con el uso de los métodos de comportamiento para la descripción de la percepción en modelos animales es el hecho de que la mayoría de estos métodos implican algún tipo de paradigma de aprendizaje antes de que los sujetos pueden ser comportamiento probado, por ejemplo, animales que tenga que aprender a presionar una palanca en respuesta a un sonido. A medida que estos cambios percepción paradigmas de aprendizaje en sí que por consiguiente ^1,2 influirá sobre cualquier resultado obtenido con la percepciónestos métodos y por lo tanto deben ser interpretados con precaución. Las excepciones son los paradigmas que hacen uso de las respuestas reflejas, porque aquí no hay paradigmas de aprendizaje tienen que llevarse a cabo antes de la prueba perceptiva. Una respuesta refleja tal es la respuesta de sobresalto acústico (ASR) que pueden ser altamente reproducible suscitado inesperadas con los sonidos fuertes en los animales no tratados. Esta ASR a su vez puede estar influenciada por sonidos anterior en función de la perceptibilidad de este estímulo anterior: Suena muy por encima de umbral de audición completamente inhibir la amplitud de la ASR; suena cerca de umbral sólo ligeramente inhiben la ASR. Este fenómeno se denomina pre-pulso de inhibición (PPI) ^3,4, y la cantidad de PPI en la ASR gradualmente depende de la perceptibilidad del pre-pulso. PPI de la ASR está por lo tanto muy adecuado para determinar audiogramas de comportamiento en ingenuos, no entrenados los animales, para determinar problemas de audición o incluso para detectar posibles percepciones subjetivas tinnitus en estosanimales. En este trabajo se demuestra el uso de este método en un modelo de roedor (véase también la ref. ^5), el jerbo de Mongolia (Meriones unguiculatus), que es un conocido especie modelo para la investigación de la respuesta de sobresalto dentro del rango de audición humana normal (por ejemplo, ^6).

Protocol

1. Configuración de Montaje y programación de software

1. Instalar un convertidor D / A de la tarjeta de un ordenador personal (por ejemplo: NI PCI 6229, National Instruments) y conectarlo a una ruptura de la caja (por ejemplo: BNC-2110, National Instruments), ambos deben soportar al menos una entrada y un canal de salida con una frecuencia de muestreo de 44,1 kHz por lo menos cada uno.
2. Conecte la salida de la ruptura de la caja mediante un cable BNC a un amplificador de sonido (por ejemplo: AMP75 amplificador de potencia de banda ancha, Thomas Wulf).
3. Instalar una cámara de infrarrojos (por ejemplo: Pro Gran Cámara IP, Grandtec Electronics) para la vigilancia de los animales en la oscuridad.
4. Instalar un entorno de desarrollo integrado (por ejemplo: Matlab) para implementar un programa definido por el diagrama de flujo en la Figura 1. Una versión que se ejecuta en Matlab 2007b se puede obtener de forma gratuita por parte del autor correspondiente.
5. Dentro de una cámara insonorizada instalar un altavoz en una mesa. Conecte el altavoz to el amplificador de sonido.
6. Instale un sensor piezoeléctrico (por ejemplo, sensor de fuerza FSG15N1A, Honeywell) en la parte superior de una placa aislante, lo apoyará con energía y conectarlo mediante un cable BNC a la entrada de la ruptura de la caja: la señal del sensor de suelo.
7. Construir una cámara de medición de un tubo de vidrio acrílico ajustarse al tamaño de los roedores a medir (por ejemplo, los jerbos: longitud 15 cm, diámetro interior 4,3 cm, diámetro exterior 4,8 cm). Fijar una rejilla con un ancho de malla de 0,5 mm para la parte frontal del tubo y una puerta acolchada con un mecanismo de bloqueo (por ejemplo, un gancho) en la parte trasera. La fijación se puede hacer con pegamento caliente, para la puerta está fijado solamente la bisagra y el gancho para que el gancho del tubo.
8. Fije las patas de espuma de plástico que se ajustan a las dimensiones del tubo de medición en el tablero sensor aislante. Los pies deben apoyar el tubo en la parte delantera y trasera y levante el tubo al nivel del sensor. Asegúrese de que hay un ligero contacto entre el sensor piezoeléctrico y la cámara de medición. Fije la placa del sensor de la cámara de medición centrada en frente del parlante y poner un micrófono para el control de sonido al lado de él (por ejemplo, B & Type K 2669 / B y Tipo K 4190 conectado al amplificador de medida B & K Modelo 2610, todo: Bruel y Kjaer) a nivel de la cabeza de los animales de modo que no interfiera con el tubo.
9. Tenga en cuenta que la calidad de los datos audiométricos dependerá de la calidad de su sistema de sonido. En cualquier caso, utilice el micrófono y el amplificador de medida para determinar la función de transferencia de frecuencias del sistema antes de sus primeros experimentos e incluir una rutina en el software para corregir esta función de transferencia frecuencia para hacer la salida espectral de tu piso altavoz.
10. Alinee la cámara web con la configuración para que se pueda monitorear el comportamiento animal.

2. Determinación del comportamiento de los umbrales de audición (audiogramas)

1. Tome el animal de su jaula y ponerlo de cabeza en el tubo; cperder la puerta.
2. Poner el tubo en los pies de espuma y el sensor. Apague cualquier luz y cerrar la puerta de la cámara. La propia cámara no tiene aire acondicionado, pero tiene la temperatura, la humedad y otras variables ambientales del laboratorio circundante. Cambio de aire por los ventiladores no es aconsejable debido a que el ruido inducido pero el volumen de la cámara está apoyando oxígeno para el animal durante muchas horas. Espere 15 minutos para permitir que el animal se acostumbre a la instalación. El tiempo de aclimatación es beneficioso para el animal, ya que puede calmar a su propio ritmo y acostumbrarse al tubo. Por otra parte, no se ve ninguna diferencia en el comportamiento durante el tiempo de aclimatación durante varias sesiones, lo que indica que una sesión extra para familiarizar al animal con el tubo y la cámara antes del experimento no es necesario.
3. Inicie el programa y definir los parámetros de estimulación (ver también ref ^5.): Los estímulos consisten en tonos puros con diferentes fretensidad. El estímulo de sobresalto debe ser presentado con un nivel de presión de sonido lo suficientemente alto como para provocar una respuesta de sobresalto reproducible. En nuestro laboratorio utilizamos intensidad de 105 dB SPL (estímulo duración 6 ms 2 ms incluyendo coseno cuadrado subida y rampas de caída) para obtener respuestas de sobresalto en los jerbos de Mongolia. Los estímulos de prueba anteriores a los estímulos de sobresalto se presentan a diferentes frecuencias e intensidades en el rango a ser probado, por lo general por debajo de umbral de audición a niveles muy por encima del umbral y con frecuencias que cubren toda la gama audible de la especie. Frecuencia y duración de la respuesta de sobresalto y el estímulo de prueba se comparan en cada ensayo, el intervalo entre los estímulos entre sobresalto y estímulo de prueba se establece en 100 ms. Utilice por lo menos 15 repeticiones con intervalos interestímulo aleatorios de 10 ± 2,5 seg para cada frecuencia y la combinación de la intensidad de los estímulos de prueba (véase la figura 2A, izquierda). Estímulos de prueba posteriores se pueden presentar en cualquiera de los dos aleatorio o no funcionó-orden aleatorizado. Si usted está usando un enfoque no aleatorio (por ejemplo, un nivel de estímulo de prueba fijado para todas las frecuencias de prueba) dejar 5 minutos de recuperación entre series de estímulos diferentes. Observe que el umbral determinado absoluta dependerá de la aleatorización de los estímulos, pero posibles desplazamientos relativos de umbral no (por ejemplo después de un trauma acústico, cf. Ref. ^5).
4. Antes de analizar los datos, eliminar datos de ensayos no válidos (por ejemplo, los ensayos en el animal presentadas antes del estímulo de sobresalto,. Véase la Figura 2B).
5. Dentro de una ventana de tiempo de la primera 50 ms después del estímulo de sobresalto, calcular la amplitud de la respuesta (de pico a pico entre la primera máximo para el primer mínimo de la respuesta) y respuesta de latencia (tiempo desde el inicio de la aparición de estímulo respuesta) de cada ensayo individual .
6. Montar un Boltzmann-función de los datos de amplitud de respuesta completa de un conjunto de frecuencias según la intensidad prestimulus válido para todos los singlensayos e. El punto de 50% de la ^7-Boltzmann función indica el umbral de audición para esta frecuencia de estimulación.

3. Trauma acústico y cuantificación de la Discapacidad Auditiva

1. Preparar ketamina-xilazina-anestesia con una mezcla de clorhidrato de ketamina: 96 mg / kg (ketamina-ratiopharm, Ratiopharm); clorhidrato de xilazina: 4 mg / kg (Rompun 2%, Bayer); sulfato de atropina: 1 mg / kg (Atropinsulfat, B. Braun Melsungen AG) y solución fisiológica de NaCl (Berlin-Chemie AG, Berlín) con una proporción de 9:1:2:8.
2. Inyectar al animal con 3 ml / kg de anestesia subcutánea. Espere hasta que el animal está profundamente anestesiados (aprox. 5 min, comprobar los reflejos, por ejemplo, utiliza el reflejo de retirada pedal). Para mantener la anestesia durante las mediciones, continuamente inyectar la solución anestésica a una velocidad de 3 ml / kg / h utilizando una bomba de jeringa. Control de signos vitales con equipo adecuado (por ejemplo, la respiración a través de la cámara) y mantener caliente el animal por placing sobre una almohadilla térmica.
3. Inducir un trauma acústico, por ejemplo, usando un tono alto puro: por ejemplo, 2 kHz a 115 dB SPL durante 75 min.
4. Después del final de trauma detener la bomba de jeringa y dejar que el animal despierto en una jaula de despertador en una almohadilla de calentamiento en un lugar tranquilo. Compruebe con regularidad durante la fase de despertar si los signos vitales son estables. Ponga el animal en su jaula sólo cuando esté completamente despierto. Deje que el animal recupere de la anestesia (por lo menos 2 días) y el resto en su jaula.
5. Realice 2,1 a 2,6 vez. Comparar los umbrales de audición antes y después del trauma acústico mediante el cálculo del porcentaje de pérdida auditiva para cada frecuencia. Tras el final de todos los experimentos sin dolor sacrificar al animal.

4. Prueba de Percepción acústica Phantom (tinnitus subjetivo)

1. Realizar estas mediciones antes y después del trauma acústico.
2. Siga 2,1 a 2,2 si el animal no está ya en la configuración.
3. Un número de los paradigmas de estimulación puede ser utilizado para probar los roedores para tinnitus subjetivo. La relación en todos los aspectos es la prueba de la relevancia de un hueco o silencio en un ruido de fondo. Si el espacio es percibido por los animales, que puede ser utilizado como un estímulo de prueba para reducir una respuesta de sobresalto de forma análoga al procedimiento descrito en 2. Si el animal sufre de tinnitus (que es probable que desarrolle después de un trauma acústico), esta tinnitus se percibe en el hueco o silencio y por lo tanto hace que la brecha menos importante. El efecto de la diferencia en la respuesta de sobresalto en consecuencia será más débil en animales tinnitus comparación con los controles sanos (PPI reducida, cf. ^8). Esta percepción se prueba con dos protocolos ligeramente diferentes.
4. En el primer paradigma tinnitus subjetivo se presenta aquí (. Figura 2A, centro, cf ⁹⁾ utilizar los siguientes parámetros: intensidad de la estimulación de sonido 105 dB SPL sobresalto con frecuencias de 1 a 16 kHz en pasos de 1 octava, Stimulnosotros longitud de 6 ms 2 ms incluyendo coseno cuadrado subida y rampas de caída. Presentar un fondo de ruido blanco de 50 dB SPL durante el experimento, ya sea con o sin una brecha de 15 ms que precede al estímulo de sobresalto por 100 ms; presente al menos 15 ensayos para cada frecuencia y la brecha de la condición de entrada. Si se utiliza un enfoque no-aleatorio, dejar 5 minutos de recuperación entre las series de estímulos diferentes. El uso de diferentes frecuencias de estímulo de sobresalto le dará una estimación aproximada de la frecuencia percibida tinnitus.
5. Como segundo paradigma tinnitus subjetivo (Figura 2A, derecha) se pueden usar los siguientes parámetros de estimulación: la intensidad del sonido 105 dB SPL sobresalto, haga doble clic estímulo con 0,1 ms de duración por cada clic y 0,1 ms entre los clics, la segunda posición con la dirección invertida en comparación con el primero. Presentar un paso de banda filtró ruido de fondo de 50 dB SPL con una anchura gaussiana filtro de 0,5 octavas y frecuencias centrales van de 1 a 16 kHz en pasos de octava. Presente esta ei ruidother con o sin una brecha de 15 ms que precede al estímulo de sobresalto por 100 ms; presente al menos 15 ensayos para cada frecuencia y brecha condición. Si se utiliza un enfoque no-aleatorio, dejar 5 minutos de recuperación entre las series de estímulos diferentes. El uso de diferentes frecuencias centrales de paso de banda del ruido de fondo se dará una estimación aproximada de la frecuencia percibida tinnitus.
6. Siga 2,4 a 2,5; normalizar todos los datos adquiridos con los datos de referencia establecidos para cada frecuencia de prueba y cada condición de trauma, es decir, antes y después de un trauma acústico.. Esta referencia es la amplitud de la respuesta al estímulo de sobresalto tono puro sin ningún prestimulus (cf. 2,3). La frecuencia se determina por el tono puro o la frecuencia central de la banda de paso de ruido filtrada. Calcular la respuesta media de cada referencia y normalizar cada amplitud de la respuesta calculada dividiendo a través de su referencia.
7. Calcular PPI dividiendo las amplitudes de respuesta normalizadas de la conditio brechan a través de la media de la no-normalizado brecha condición de cada frecuencia de prueba.
8. Calcule el cambio de PPI después del trauma en porcentaje para cada frecuencia de prueba.

Las respuestas de sobresalto de animales son fáciles de generar y analizar. Figura 2B proporciona una visión general de un resultado típico de un animal estimulado con un tono puro de 105 dB SPL sin prestimulus de 15 veces. La mayoría de los ensayos son ensayos válidos y no válidos son fáciles de reconocer (ensayos marcados por el rojo cuadrado). Las amplitudes y latencias de respuesta se calculan solamente a partir de ensayos válidos.

Un cambio típico umbral de comportamiento se da en la Figura 3A. El audiograma de un animal ejemplar adquirido con el método descrito en 2 se administra antes (azul) y después (rojo) un trauma acústico en 2 kHz (área amarilla). Una pérdida de audición clara se muestra específicamente en 2 kHz. Las reacciones a una percepción subjetiva tinnitus puede servisto en la Figura 3B, las amplitudes de respuesta normalizada del mismo animal como anteriormente se muestran ejemplarmente para estimulaciones una octava por debajo y por encima del trauma como se describe en 4,5. La comparación de las respuestas a los estímulos con y sin espacio antes (azul) y después del trauma (rojo) permite una interpretación de una posible percepción tinnitus. Por debajo de la frecuencia de trauma no hay cambio de patrón de respuesta se puede encontrar, mientras que por encima del trauma el efecto de la diferencia desapareció después del trauma, lo que indica una mispercept a esta frecuencia.

Figura 1. Diagrama de flujo del programa utilizado para adquirir los umbrales conductuales y subjetivas de datos tinnitus. Tenga en cuenta que esta es sólo una versión simplificada del código de programa. Abreviaturas: GUI - Interfaz gráfica de usuario; ISI - intervalo entre estímulos.

Figura 2. Auditivo de sobresalto respuesta (ASR) estímulos. A Esquemas de las tres diferentes protocolos de estimulación utilizado. Panel izquierdo: inhibición pre-pulso (PPI) de la ASR medida sin ningún estímulo puro tono de prueba antes (verde) el tono de sobresalto (rojo), el plazo de respuesta se representa en color azul. Panel Centro: Brecha / paradigma ruido con la presentación del estímulo de tono puro sobresalto de diferentes frecuencias en un fondo de ruido blanco. Panel derecho: Brecha / ruido paradigma con la presentación de estímulo de sobresalto clic en filtrado de paso de banda de fondo de diferentes frecuencias centrales B Ejemplos de respuestas de sobresalto auditivo de 15 ensayos grabados con el paradigma umbral sin prestimulus a 1 kHz de frecuencia de estimulación.. Tres ensayos se cuentan no válidos (cuadrados rojos) que el animal se movía ya antes del inicio de la estimulación.

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Figura 3. Ejemplos de resultados de ASR en un animal. Un umbral conductual antes (azul) y después (rojo) el trauma acústico a 2 kHz (zona amarilla). Los umbrales se calculan a partir de las respuestas al protocolo PPI ASR modulada mediante la función de Boltzmann-punto de inflexión como valor umbral. Tenga en cuenta que la pérdida de la audición a los 2 kHz a cantidades más del 66%, mientras que farer lejos de la frecuencia de un trauma puede ver a menudo incluso mejoría de los umbrales auditivos B amplitudes de respuesta normalizados (círculos abiertos:. Pruebas individuales, círculos rellenos: medios, bigotes: desviación estándar) durante la estimulación con el espacio / ruido protocolo clic ASR (4,5) para 1 y 4 kHz frecuencias centrales. Las respuestas son ordenados para los ensayos sin y con vacío en el ruido antes y después del trauma a 2 kHz. Sólo a 4 kHz el efecto de la brecha desaparece después del trauma que indica una percepción subjetiva tinnitus alrededor de estefrecuencia.

Discussion

Se presenta una configuración barata y fácil de construir para mediciones audiométricas en roedores basa en la inhibición pre-pulso de respuestas de sobresalto acústicas que pueden ser utilizados para determinar los umbrales conductuales de audición (= audiogramas ¹⁰⁾ y auditivas perceptos fantasma como tinnitus subjetivo ^11. Especialmente las últimas mediciones están en el foco de varios informes recientes ^8,12,13,14 y puede ser visto como un requisito previo para las investigaciones electrofisiológicas de los mecanismos neuronales subyacentes a esta enfermedad. El uso de este método es posible diferenciar los animales se desarrolló una percepción subjetiva tinnitus después de un trauma acústico y los que no lo hicieron, y luego seguir investigando a estas personas, por ejemplo, con registros electrofisiológicos en la corteza auditiva primaria.

Un paso crítico en el análisis de los datos de sobresalto después de un trauma acústico es la normalización de los datos a la amplitud de sobresalto que puedemáximamente ser obtenido sin precedentes estímulo de prueba: Esto es particularmente importante distinguir reducidas respuestas de sobresalto basado en la pérdida de audición de reducción de PPI en animales de tinnitus: Los efectos del trauma acústico están cambiando con el tiempo, a medida que el animal se recupera en parte de ella, pero aproximadamente el 50 por % de la pérdida de audición es permanente. En contraste con los informes mencionados anteriormente, donde el umbral auditivo se prueban, pero no se utiliza para la calibración, se trató de minimizar los efectos de los diferentes umbrales de audición de cada frecuencia y el efecto de la trauma acústico en sí por la normalización de cada amplitud de la respuesta con una referencia. Además se utilizan dos tipos diferentes de protocolos para evaluar cualquier percepto tinnitus, con el primero (4,4) trabaja mejor para los animales analizados en largas escalas de tiempo de una semana después del trauma en el segundo "clásico" (4,5) trabaja mejor para los animales analizados en una semana después del trauma.

Una limitación de este método es cleaRLY que no es posible evaluar los efectos agudos de un trauma acústico. Al menos dos días entre la anestesia y la primera post-medición debe ser elegido, como el animal tiene que recuperarse de ella. Para obtener una estimación de la pérdida de audición después de un trauma agudo directamente, audiometría de tronco cerebral (BERA) puede ser utilizado.