Summary
Aqui vamos desenvolver as ferramentas necessárias para
Abstract
Nós desenvolvemos um sistema que integra imagens ao vivo de marcadores fluorescentes e as fatias de cultura de neuroepithelium embrionário mouse. Aproveitamos mouse linhas existentes para a célula de linhagem genética traçado: a linha Cre tamoxifeno induzível e uma linha repórter Cre expressar dsRed sobre recombinação Cre-mediada. Ao utilizar um nível relativamente baixo de tamoxifeno, fomos capazes de induzir a recombinação em um pequeno número de células, que permite que se siga as divisões celulares individuais. Além disso, observou-se a resposta de transcrição para o Sonic Hedgehog (Shh) de sinalização usando um OLIG2-eGFP transgênico linha 1-3 e acompanhámos formação de cílios por infectar a fatia culta com vírus expressando o marcador de cílios, Sstr3-GFP 4. A fim de imagem neuroepithelium, colhemos embriões em E8.5, isolada do tubo neural, montado a fatia neural em condições de cultura adequadas para a câmara de imagens e realizada lapso de tempo de imagem confocal. Nosso exmétodo in vivo de imagens ao vivo nos permite traçar divisões celulares individuais para avaliar a temporização relativa de formação de cílios e resposta Shh de um modo fisiologicamente relevante. Este método pode ser facilmente adaptado por meio de marcadores fluorescentes distintas e fornece o campo com o qual as ferramentas para controlar o comportamento de células in situ e em tempo real.
Protocol
Camundongos adultos são sacrificados por deslocamento cervical mecânica. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo IACUC e da Comissão de Biossegurança da Universidade de Emory.
1. Geração Embryo
- Cruz Cre linha tamoxifeno induzível, CAGGCreER e dsRedCre linha repórter (Tg (CAG-Bgeo,-DsRed * MST) 1Nagy) (Figura 1) 5,6. Para controlar a temporização relativa de Shh na resposta das células filhas, transversal e CAGGCreER linha com a DsRed OLIG2-eGFP BAC ratinhos transgénicos (Tg (OLIG2-EGFP) EK23Gsat) (Figura 1) 7,8.
- Dissolve-se o tamoxifeno em etanol a 100%, e realizar a injecção intraperitoneal de 2,5 mg de tamoxifeno por 40 g de peso corporal em mulheres grávidas em embrionário 6,5 (E6.5) para induzir a expressão de Cre e rotulagem DsRed num pequeno subconjunto de células.
- 48 horas depois dissecar embriões, identificar embriões positivos DsRed usando o microscópio de fluorescência, transferi-los para o prato de cultura e observávelde e divisões celulares individuais durante ex vivo de imagens (veja abaixo).
2. Todo Rato Embryo Cultura
- Dissecar embriões E8.5 em meio de lavagem pré-aquecido contendo DMEM/F12 (1:1) suplementado com 10% de soro de bezerro recém-nascido e 1% de penicilina / estreptomicina (P / S) 9.
- Logo após dissecação, lugar embriões no estágio de aquecimento de 37 ° C sob o microscópio fluorescente e identificar como GFP e / ou dsRed positivo (ver abaixo).
- Transfira até dois embriões em uma gota 500 ul de meio de cultura pré-equilibrada com 50% de soro de rato a partir de ratos Sprague-Dawley do sexo masculino e 50% de DMEM/F12 (1:1) sem vermelho de fenol suplementado com L-glutamina e 1% de HEPES 1 M em NaCl e 0,85% P / S 9.
- Aplicar uma camada fina (0,1 cm) de óleo mineral leve, equilibrada sobre o meio para evitar a evaporação e transferir a placa de cultura contendo os embriões a 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora.
3.Infecção viral
- A fim de etiqueta cílios no neuroepitélio, adicionar 5-10 ul de Sstr3-GFP lentivírus, aproximadamente 2 milhões de viriões, em 500 mL equilibrada gota de meio de cultura contendo um embrião E8.5.
- Após 18 horas de cultura, transferência de embriões infectados em várias gotas de meio de lavagem para lavar o vírus e preparar fatia tubo neural.
4. Tubo Neural Slice Preparação para imagens ao vivo
- Dissecar tubo neural do embrião E8.5 em meio de lavagem pré-aquecido, utilizando um tamanho de micro-faca 0,025 milímetros, em um 1% de agar prato revestido.
- Colocar o tubo neural isolado lado ventral para baixo numa gota de 150 mL de meio de cultura sem vermelho de fenol equilibrado sobre o mm de poli-L-lisina revestido prato fundo de vidro 35.
- Coloque pequenas quantidades de uma mistura 1:1 feita a partir de 100% puro vaselina e cera de vela derretida (vela do IKEA) ao redor do tubo neural montada, e pressione suavemente por um pedaço estreito de lamela de vidro, a fim deimobilizar a amostra.
- Cobrir a placa com uma camada fina (~ 0,1 centímetros) de óleo mineral leve, equilibrada (Figura 2).
5. Imaging and Time-lapse microscopia confocal viver
- Coloque prato sob a Nikon A1R Laser Scanning microscópio invertido confocal equipado com uma câmara ambiental que regula a temperatura, previsto para 37 ° C e 5% CO 2.
- É objectivo de 60x de imersão em óleo de gravar GFP cílios rotulados e células positivas DsRed, enquanto que a utilização de óleo objectiva de 40x de imersão para monitorar OLIG2-GFP e células positivas DsRed.
- Abra o software NIS Elements para criar condições de imagem lapso de tempo. Cada 10 minutos adquirir z pilhas de até 25 um, com um espaçamento de 1,5 um (objetiva de 40x) e até 8 mM, com um espaçamento de 0,4 um (objectiva 60x). Use 488 e 561 nm, o comprimento de onda de excitação e canal de transmissão, se necessário. Aquisição de imagens no tamanho 512 x 512. Configurar várias regiões definidas pelo usuário de interest para executar a gravação em simultâneo.
A exposição ideal de potência do laser e brilho da imagem foi ajustado pelo uso do laser de baixa intensidade (até 11% para mCherry 561, até 4,5% EGFP 405/488), velocidade de digitalização 1, linha média, 2 e tamanho de furo de pino (61 mm para DsRed; OLIG2 28,1 mm para 72 mm para; SSTR3GFP; 61,3 mm para DsRed e SSTR3GFP, 58 mm para DsRed e OLIG2). O uso de repórteres fluorescentes geneticamente codificados nos permitiu detectar o brilho com baixo consumo de energia laser. - Analisar os dados gravados usando software reconstrução Imaris 3D.
6. Imunofluorescência
- Fix embriões ou tubos neurais isoladas em paraformaldeído a 4% / tampão de fosfato 0,1 M em gelo (4 ° C) durante 1 hora numa placa de vidro.
- Lavar as amostras 2 horas em PBS em gelo (4 ° C) (variação de PBS algumas vezes) e colocado em 30% de sacarose / 0,1 M de tampão de fosfato durante a noite ou até embriões pia.
- Incorporar em outubro, congelar em gelo seco e armazenar em temperatura de -80 ° C. Perform em criostato de corte (10 mm).
- Lavar as lâminas durante 10 minutos em solução de lavagem contendo soro de ovelha inactivado por calor a 1% e 0,1% de Triton X-100 em PBS.
- Diluir anticorpos primários em solução de lavagem em seguir concentrações: Rat monoclonal anti-RFP (5F8), 1:200; coelho anti-Arl13b soro 1:1500 e mouse monoclonal anti-Arl13b 01:05 (295B/54); coelho anti-OLIG2 1:300; mouse monoclonais Pax6, Shh e Nkx2.2-all 01:10, e Coelho policlonal Ki67 1:500. Adicionar cerca de 150 mL por slide em câmara úmida plana, cubra com filme plástico para evitar ressecamento e deixar mais a noite a 4 ° C.
- Lavar as lâminas em solução de lavagem por três vezes, com 20 min de cada vez, à temperatura ambiente.
- Diluir anticorpos secundário Alexa Fluor 488, 568, 350 em soluções de lavagem na concentração de 1:200. Use Hoechst 1:3.000 ou TO-PRO-3 1:500 para corar núcleos. Adicionar 150 ul por lâmina, deixar 1 hora à temperatura ambiente em câmara húmida protegida da luz.
- Lave as lâminas em solução de lavagem twØ vezes, 30 min de cada vez a temperatura ambiente.
- Monte desliza em 80% Prolongar Ouro reagente anti-fade e vista dentro de 24 horas.
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Representative Results
Aqui realizamos ex vivo de imagens ao vivo de divisões celulares individuais dentro do E8.5 rato neuroepithelium. Para identificar as células individuais, induzida recombinase Cre em um subconjunto de células que contêm uma linha repórter que expressa Cre dsRed mediante recombinação 5,6 (Figura 3A). Assim, 48 horas mais tarde, fomos capazes de observar divisões celulares individuais durante ex vivo de imagens (Figuras 4A-D). Paralelamente, acompanhamos quando as células marcadas tornou Shh-responsive, incluindo um repórter da transcrição Shh modificada BAC transgênico linha OLIG2-eGFP (Figuras 3C-D; Figuras 4G-N), 1-3. Para observar a formação do cílios geramos Sstr3-GFP lentivírus para infectar os embriões em cultura (Figura 3B; Figuras 4A-D) 4. Imunofluorescência foi realizado para confirmar os resultados in vivo (Figuras 4E-F).
O time-voltasconfocal e observação de imagens dos embriões repórter dsRedCre expressando OLIG2-eGFP ou infectados com Sstr3-GFP lentivírus durante o cultivo in vitro são mostrados na Figura 5 10. A fim de ter certeza de que a expressão Sstr3-GFP que estávamos usando para visualizar os cílios não estava a interferir com qualquer processo biológico subjacente, que corroborou os nossos dados de imagem ao vivo com seções de embrião do tipo selvagem fixos. Porque nós achamos a mesma porcentagem de assincronia na formação de cílios e resposta Shh, indica que o vírus SSTR3-GFP não teve impacto desses processos (Figura 5A).
Figura 1. Fluxograma do procedimento de imagem ao vivo ex vivo utilizando neuroepithelium mouse. Rato A última cruzada e tamoxitratamento fen são retratados seguido por todo o método de cultura de embrião de rato. Embriões que expressam proteínas fluorescentes marcados são selecionados e preparados para imagens ao vivo. Clique aqui para ver a figura maior .
Figura 2. Preparação fatia do tubo neural para geração de imagens ao vivo. A) E8.5 embrião unturned com a primeira aparição de pares somito. B) Tubo Neural dissecado em médio pré-aquecido usando um micro-faca. C) fatia do tubo neural é montado do lado ventral para baixo no poli-L-lisina revestido prato fundo de vidro. D) Uma pequena quantidade de uma mistura feita a partir de vaselina e cera aplicada em torno do tubo neural e delicadamente cobertos por um ndrrow pedaço de vidro lamela. Clique aqui para ver a figura maior .
Figura 3. A visualização de proteínas marcadas com fluorescência em células vivas do tubo neural com microscopia confocal. D) rótulos DsRed células individuais. B) lentivírus SSTR3-GFP expressa em cílios como forma (setas amarelas). CD) de embriões E8.5 realização OLIG2-GFP mostra a expressão da GFP no neuroepitélio. Bar é de 30 um (A, D), 15 mm (B) e C (1,5 mM).
Figura 4. Monitorização formação cílios e sinalização Shh em células do tubo neural em desenvolvimento dividindo. DC) DsRed única célula positiva em divisão mostra um cílio formas dentro de uma célula filha antes da outra célula (C, seta branca). O filme foi fotografado em uma taxa de um quadro a cada 10 min. EF) imunofluorescência utilizando anticorpos contra RFP em verde (para dsRed linhagem de rastreamento) e Arl13b em vermelho (para cílios). Alargamento da área de box (E), sem Hoechst (F). GN) A célula positiva dsRed sofre divisão (IM). O OLIG2-GFP é expresso apenas em um filha (J, N). A gravação foi fotografada a uma taxa de um quadro a cada 10 min. Bar é 5 mm (AD), 50 mM (F), 25 mM (GN).
Figura 5. Contagem de células positivas dsRed com cílios e aparência Shh. A) Número de células DsRed submetidos a divisão e localização cílios. O símbolo * significa que pela formação ao vivo cílios imagem foi síncrona. B) Número de dsRed e células positivas OLIG2-GFP submetidos a divisão e sinalização Shh.
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Discussion
Nosso sistema ex vivo nos permite observar diretamente divisões celulares individuais dentro do neuroepithelium em tempo real em desenvolvimento. Como exemplo, examinamos divisões celulares dentro do rato tubo neural embrionário e monitorados ou formação cílio ou resposta Shh. Confirmámos nossos resultados de imagem (n = 24) foram consistentes com os resultados de secções fixas (n = 178), indicando a nossa técnica fornece dados fisiologicamente relevantes.
A técnica baseia-se na indução de Cre sendo limitado a um subconjunto de células, de modo a dose de tamoxifeno tem de ser preciso. Nós elaboramos a dosagem para a rotulagem de células individuais. Acreditamos que seria fácil rotular pequenos clones de células com um ligeiro aumento da dose com base na análise inicial da linha CAGGcreER, que mostraram uma resposta dependente da dose de tamoxifeno 6. Além disso, as condições de cultivo de embriões são fundamentais, como o desenvolvimento anormal ocorre se as condições estão desligados.Nós confirmamos que o desenvolvimento prosseguiu normalmente nas condições de cultura que usamos, que são conhecidos para trabalhar por pelo menos 36 h 11.
Os induzidas e Cre Cre linhas repórter que usamos são publicamente disponíveis para que possam ser facilmente obtido fazendo esta técnica bastante adaptável a pesquisadores com uma variedade de questões. A verdadeira força de nossa técnica é que, em células individuais geneticamente rotulagem, a abordagem pode ser utilizada para interrogar o comportamento de uma única célula em muitas linhas de rato mutante existentes e futuras. Isso será fundamental para compreender o que está realmente acontecendo de errado em muitas dessas linhas como a observação direta de células dentro do embrião dos mamíferos durante o desenvolvimento não tem sido extensivamente examinada. Nosso incorporaton de repórteres fluorescentes geneticamente codificadas para detectar o brilho com baixo consumo de energia do laser proporciona uma vantagem real para tal observação. É fácil imaginar as proteínas fluorescentes marcados marcação organelas celulares específicas ou outros trrepórteres anscriptional sendo integrado no futuro.
Nós estávamos interessados no tempo relativo de formação cílio primário e resposta Shh nas células-filhas de uma célula se dividir. No entanto, a linha transgénica que nos permitiu monitorizar a resposta Shh expresso OLIG2-eGFP por todo o citoplasma, impedindo-nos de ver o marcador do cílio primário, Sstr3-GFP na mesma célula. Assim, teríamos grandemente beneficiado a partir de um restrito OLIG2-eGFP nuclear ou um espectro distinto Sstr3 fluorescente proteína de fusão.
Além da utilização de linha segmentada e transgénico, mostrámos que a técnica pode ser adaptada usando construções virais e que infectem o neuroepitélio em cultura proporciona dados úteis. Isto será útil para investigadores no fornecimento de um método mais rápido do que a geração de uma linha de ratinho geneticamente modificadas. Além disso, a abordagem pode validar a geração de tal linha, na verdade, os nossos dados sustentam um translinha gênica expressar Sstr3-GFP será de grande utilidade para o campo.
Nosso método fornece ferramentas com que o campo pode monitorar mais imediatamente o comportamento das células. Juntamente com os ricos recursos de mutantes de rato esperamos que este método seja especialmente poderosa em análise de um conjunto de comportamentos celulares in situ.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este projecto de investigação foi apoiada por um suplemento ARRA, 5 R01 NS056380. Apoio adicional foi fornecido pela Viral Vector Core e do Núcleo de Microscopia da Emory Neuroscience NINDS Núcleo Instalações concessão, P30NS055077. Agradecemos o mouse Emory Transgênicos e Gene Segmentação do núcleo para a derivação da linha de mouse da GENSAT; Greg Pazour para o SSTR3-GFP IMCD3 linha celular estável, e Bradley Yoder para o Sstr3-GFP lentiviral construir. Os anticorpos monoclonais foram obtidos a partir dos estudos do desenvolvimento Hibridoma Bank, desenvolvido sob os auspícios da NICHD, e mantido pela Universidade de Iowa, Departamento de Ciências Biológicas, Iowa City, IA 52242. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo IACUC e da Comissão de Biossegurança da Universidade de Emory.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J | Jackson Laboratory | 005438 | |
| Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd | MMRRC, | 010555-UCD | |
| CAGGCreER | Jackson Laboratory | 003724 | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| DMEM/F12 (1:1) | GIBCO | 21041-025 | |
| Newborn calf serum | Lonza | 14-416F | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Rat Serum SD male | Harlan Bioproducts | 4520 | |
| 1M Hepes | BioWhittaker | 17-737E | |
| L-Glutamine | GIBCO | 21041-025 | |
| Light mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Sstr3-GFP lentivirus | Emory Viral Core | ||
| Micro-knife, size 0.025 mm | Electron Microscopy Sciences | 62091 | |
| 35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish | MatTek | P35GC-0-10-C | |
| 100% Petroleum Jelly | Kroger | FL9958c | |
| A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope | Nikon | ||
| NIS Elements software | Nikon | ||
| Imaris 3D software | Bitplane AG | Imaris 7.2.3 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Parafolmaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffer | Lab made | ||
| Rat monoclonal anti-RFP (5F8) | Chromotek | 110411 | |
| Rabbit anti-Arl13b serum | NeuroMab | ||
| mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 | NeuroMab | ||
| Rabbit anti-Olig2 | Chemicon | AB9610 | |
| Mouse monoclonals Pax6 | Developmental Hybridoma Bank | Pax6 | |
| Mouse monoclonalsShh | Developmental Hybridoma Bank | 5E1 | |
| Mouse monoclonals Nkx2.2 | Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | |
| Rabbit polyclonal Ki67 | Abcam | AB15580 | |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 | Molecular Probes | A11031 | |
| Alexa Fluor 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| H–chst | Fisher | AC22989 | |
| TO-PRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36934 |
References
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