Summary
Her kan vi utvikle de nødvendige verktøy for
Abstract
Vi har utviklet et system som integrerer direkte avbildning av fluorescerende markører og dyrking skiver av embryonale mus neuroepithelium. Vi tok nytte av eksisterende mus linjer for genetisk celle avstamning tracing: en tamoxifen-induserbar Cre linje og en Cre reporter linjen uttrykker DsRed på Cre-mediert rekombinasjon. Ved å bruke et relativt lavt nivå av tamoxifen, var vi i stand til å indusere rekombinasjon i et lite antall celler, tillater oss å følge de enkelte celledelinger. I tillegg observerte vi transcriptional svar på Sonic Hedgehog (Hysj) signal ved hjelp av en Olig2-eGFP transgene linjen 1-3 og vi overvåkes dannelsen av flimmerhårene ved å infisere den kultiverte skive med virus som uttrykker flimmerhårene markør, Sstr3-GFP fire. For å avbilde neuroepithelium, vi høstet embryoer på E8.5, isolert nevralrøret, montert det nevrale skive i riktig dyrking forhold til bildebehandling kammeret og utførte time-lapse confocal bildebehandling. Vår exvivo direkte avbildning metoden gjør oss i stand til å spore enkelt celledelinger for å vurdere den relative timing av primære cilier dannelse og Hysj respons i en fysiologisk relevant måte. Denne metoden kan enkelt tilpasses ved hjelp av ulike fluorescerende markører og gir feltet de verktøyene som brukes til å overvåke celle atferd in situ og i sanntid.
Protocol
Voksne mus avlives av mekanisk halshugging. Alle dyr prosedyrene ble godkjent av IACUC og biosikkerhet Committee ved Emory University.
En. Embryo Generation
- Cross tamoxifen-induserbar Cre linje, CAGGCreER, og dsRedCre reporter linje (Tg (CAG-Bgeo,-DsRed * MST) 1Nagy) (figur 1) 5,6. Å overvåke den relative timing av Hysj respons i datter celler, kryss CAGGCreER og DsRed tråd med Olig2-eGFP BAC transgene mus (Tg (Olig2-EGFP) EK23Gsat) (figur 1) 7,8.
- Oppløs tamoxifen i 100% etanol, og utføre intraperitoneal injeksjon av 2,5 mg tamoxifen per 40 g kroppsvekt i gravide hunner ved embryonisk 6,5 (E6.5) for å indusere ekspresjon Cre og DsRed merking i en liten undergruppe av celler.
- 48 timer senere dissekere embryoer, identifisere DsRed positive embryoer ved hjelp av fluorescerende mikroskop, overføre dem til kultur fatet og observerbaree encellete divisjoner under ex vivo avbildning (se nedenfor).
2. Hele Mouse Embryo Kultur
- Dissekere E8.5 embryoer i forvarmet vask medium som inneholder DMEM/F12 (01:01) supplert med 10% nyfødt kalv serum og 1% Penicillin / streptomycin (P / S) 9.
- Rett etter disseksjon, sted embryoer på 37 ° C oppvarming scenen under fluorescerende mikroskop og identifisere som GFP og / eller DsRed positive (se nedenfor).
- Overfør opptil 2 embryoer i en 500 mL dråpe av pre-ekvilibrert kulturmedier inneholdende 50% Rotte Serum fra en Sprague-Dawley hann-og 50% DMEM/F12 (1:1) uten fenolrødt supplert med L-glutamin og 1% av 1 M HEPES i 0,85% NaCl og P / S 9.
- Påføres et tynt lag (0,1 cm) ekvilibrert med lett mineralolje over mediet for å forhindre fordamping og overføre kulturen skål som inneholder embryoene til 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
3.Viral infeksjon
- For å etiketten flimmerhårene i neuroepithelium, legge 5-10 mL av Sstr3-GFP lentivirus, ca 2 millioner virions, til en 500 mL equilibrated dråpe kultur medium som inneholder en E8.5 embryo.
- Etter 18 timer av kultur, overføre infiserte embryo inn flere dråper vask medium for å vaske ut virus og forberede nevralrøret skive.
4. Neural Tube Slice Forberedelse for Live Imaging
- Dissekere nevralrøret av E8.5 embryo i forvarmet vask medium ved hjelp av en mikro-kniv størrelse 0.025 mm, på en 1% agar belagt parabolen.
- Plasser den isolerte nevralrøret ventral side ned i en 150 mL dråpe av likevekt kultur medium uten fenol rødt på 35 mm poly-L-lysin belagt glassbunn parabolen.
- Sett små mengder av en 1:1 blanding laget av 100% ren vaselin og smeltet stearin (stearinlys fra IKEA) rundt montert nevralrøret, og trykk forsiktig av en smal stykke glass dekkglass for åimmobilisere prøven.
- Dekk formen med et tynt lag (~ 0,1 cm) ekvilibrert med lett mineralolje (figur 2).
5. Leve Imaging and Time-lapse konfokalmikroskopi
- Sted rett under Nikon A1R Laser Scanning Confocal Inverted mikroskop utstyrt med en miljømessig kammer som regulerer temperatur, satt til 37 ° C, og 5% CO 2.
- Bruk 60x olje-immersion mål å spille GFP merket flimmerhårene og DsRed positive celler, mens 40x olje-nedsenking objektiv bruk for å overvåke Olig2-GFP og DsRed positive celler.
- Åpne NIS Elements programvare for å sette opp tidsinnstilte avbildning forhold. Hvert 10. min erverve z-stabler på opptil 25 mikrometer med en avstand på 1,5 mikrometer (40x objektiv) og opp til 8 um med en avstand på 0,4 pm (60x objektiv). Bruk 488 og 561 nm de eksitasjonsbølgelengdene og overført kanal hvis nødvendig. Hente bilder på 512 x 512 størrelse. Sett opp flere brukerdefinerte områder av interest å utføre samtidig opptak.
Optimal eksponering for laser makt og lysstyrken på bildet ble justert ved bruk lav laser intensitet (opp til 11% for mCherry 561, opptil 4,5% EGFP 405/488), skanne en fart, linje gjennomsnitt to og størrelsen på hullet (61 mikrometer for DsRed, 28,1 mikrometer for Olig2, 72 mikrometer for SSTR3GFP; 61,3 mikrometer for DsRed og SSTR3GFP, 58 mikrometer for DsRed og Olig2). Bruk av genetisk kodet fluorescerende reportere gjorde oss i stand til å registrere lysstyrken med lav laser makt. - Analysere registrerte data ved hjelp Imaris 3D rekonstruksjon programvare.
6. Immunfluorescens
- Fix embryo eller isolerte nevrale rør i 4% paraformaldehyde / 0,1 M fosfatbuffer på is (4 ° C) for en time i et glassfat.
- Vask prøvene 2 hr i PBS på is (4 ° C) (endring PBS et par ganger) og satt i 30% sukrose / 0,1 M fosfatbuffer over natten eller til embryoer vasken.
- Bygge inn i oktober, fryse på tørris og butikk i -80 ° C. Perform seksjonering på cryostat (10 mm).
- Vask objektglass i 10 minutter i vaske-løsning inneholdende 1% varme-inaktivert sau serum og 0,1% Triton X-100 i PBS.
- Fortynne primære antistoffer i vask løsning på følgende konsentrasjoner: Rat monoklonalt anti-RFP (5F8,) 1:200; Rabbit anti-Arl13b serum 1:1500 og monoklonalt anti-Arl13b 01:05 (295B/54); Rabbit anti-Olig2 1:300; Mus monoclonals Pax6, Shh og Nkx2.2-all 01:10, og Rabbit polyclonal Ki67 1:500. Legg rundt 150 mL per lysbilde i flat fuktet kammer, dekk med parafilm for å unngå uttørking og la over natten ved 4 ° C.
- Vask objektglass i vaskeoppløsningen tre ganger, 20 minutter hver gang ved romtemperatur.
- Fortynne sekundære antistoffer Alexa 488 Fluor, 568, 350 i vask løsninger på 1:200 konsentrasjon. Bruk Hoechst 1:3,000 eller TO-PRO-3 1:500 å farge kjerner. Tilsett 150 pl pr lysbilde, lar en time ved romtemperatur i fuktet kammer beskyttet mot lys.
- Vask lysbilder i vask løsning two ganger, 30 minutter hver gang ved romtemperatur.
- Mount lysbilder i 80% forlenge Gold anti-fade reagens og utsikt innenfor 24 timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her har vi utført ex vivo direkte avbildning av encellete divisjoner innenfor E8.5 mus neuroepithelium. Å merke individuelle celler, indusert vi Cre recombinase i en undergruppe av celler som inneholder en Cre reporter linje som uttrykt DsRed ved rekombinasjon 5,6 (figur 3A). Således 48 timer senere var vi i stand til å observere enkelt celledelinger i løpet av ex vivo avbildning (figurene 4A-D). Samtidig, overvåket vi når de merkede cellene ble Hysj-responsive ved å inkludere en Hysj transkripsjonell reporter endret BAC transgen Olig2-eGFP linje (figur 3C-D; Tall 4G-N) 1-3. Å observere flimmerhårene formasjon vi generert Sstr3-GFP lentivirus å infisere embryo i kultur (Figur 3B; Tall 4A-D) 4. Immunfluorescens ble utført for å bekrefte in vivo resultater (figur 4E-F).
Klokka-rundere confocal bildebehandling observasjon av dsRedCre reporter embryoer uttrykker Olig2-eGFP eller infisert med Sstr3-GFP lentivirus under in vitro kultur er viste i figur 5 10. For å være sikker på at Sstr3-GFP uttrykk vi bruker for å visualisere flimmerhårene ikke var i konflikt med noen underliggende biologiske prosessen, bekreftet vi vår live imaging data med faste vill type embryo seksjoner. Fordi vi fant det samme prosentandel av asynchrony i flimmerhårene dannelse og Hysj respons, betyr det at SSTR3-GFP viruset ikke påvirke disse prosessene (figur 5A).
Figur 1. Flytskjema over ex vivo direkte avbildning prosedyre ved hjelp av musen neuroepithelium. Den endelige mus kryss og tamoxifen behandling er avbildet fulgt av hele museembryo dyrkningsmetode. Embryoer uttrykker fluorescently merkede proteiner er valgt og forberedt for live imaging. Klikk her for å se større figur .
Figur 2. Nevralrøret skive forberedelse for live imaging. A) E8.5 unturned embryo med første opptreden av somitt par. B) Neural tube dissekert i forvarmet medium ved hjelp av en mikro-kniv. C) Neural tube skive er montert ventral side ned på poly-L-lysin-belagt glass nederste tallerken. D) en rest av en blanding fremstilt av vaselin og voks påføres rundt det nevrale rør og forsiktig dekket av en narrow stykke glass dekkglass. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. Visualisere fluorescently merkede proteiner i levende celler av nevralrøret med konfokalmikroskopi. A) DsRed etiketter individuelle celler. B) SSTR3-GFP lentivirus uttrykt i primær flimmerhårene som de form (gule pilspisser). CD) E8.5 embryo bærer Olig2-GFP viser GFP uttrykk innen neuroepithelium. Bar er 30 um (A, D), 15 um (B) og 1,5 mikrometer (C).
Figur 4. Overvåking cilia dannelse og Hysj signalering i dele celler i å utvikle nevralrøret. AD) Enkeltrom DsRed positiv celle gjennomgår divisjonen viser en cilium former i en datter celle før den andre cellen (C, hvit pil). Filmen ble fotografert med en hastighet på én ramme hvert 10 min. EF) Immunfluorescens bruker antistoffer mot RFP i grønt (for DsRed avstamning sporing) og Arl13b i rødt (flimmerhårene). Utvidelse av eske området (E), uten Hoechst (F). GN) Den DsRed positive celle gjennomgår divisjon (IM). Den Olig2-GFP uttrykkes bare i én datter (J, N). Opptaket ble fotografert med en hastighet på én ramme hvert 10 min. Bar er 5 mikrometer (AD), 50 mikrometer (F), 25 mikrometer (GN).
Figur 5. Opptelling av DsRed positiv celle med flimmerhårene og Hysj utseende. A) Antall DsRed cellene gjennomgår divisjon og flimmerhårene lokalisering. Symbolet * betyr av levende avbildning flimmerhårene formasjonen var synkron. B) Antall DsRed og Olig2-GFP positive celler gjennomgår divisjon og Hysj signalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår ex vivo-systemet gjør oss i stand til å direkte observere encellete divisjoner innenfor utvikling neuroepithelium i sanntid. Som et eksempel undersøkte vi celledelinger i løpet av musen embryonale nevralrøret og overvåkes enten cilium formasjon eller Hysj respons. Vi bekreftet våre bildebehandling resultater (n = 24) var i samsvar med resultatene fra faste seksjoner (n = 178) som indikerer vår teknikk gir fysiologisk relevante data.
Vår teknikk er avhengig av Cre induksjon å være begrenset til en undergruppe av celler, slik at dosen av tamoksifen må være nøyaktig. Vi jobbet ut dosering for merking av enkeltceller. Vi tror det ville være lett å merke små kloner av celler med en svak økning av dosen basert på den innledende analyse av CAGGcreER linje, som viste en doseavhengig respons på tamoksifen seks. I tillegg er fosteret kultur forholdene er kritiske, som unormal utvikling oppstår hvis forholdene er av.Vi bekreftet at utviklingen fortsatte normalt under kultur forholdene vi brukte, som er kjent for å jobbe i minst 36 hr 11.
De induserbar Cre og Cre reporter linjene vi bruker er offentlig tilgjengelig så kan lett skaffes gjør denne teknikken ganske tilpasningsdyktig til forskere med en rekke spørsmål. Den virkelige kraften i teknikken vår er at i genetisk merking enkeltceller, kan vår tilnærming brukes til å avhøre én celle atferd i de mange eksisterende og fremtidige muterte mus linjer. Dette vil være avgjørende i å forstå hva som virkelig går galt i mange av disse linjer som direkte observasjon av celler i pattedyr embryo under utvikling ikke har blitt grundig undersøkt. Vår incorporaton av genetisk kodet fluorescerende journalister å oppdage lysstyrke med lav laser makt gir en reell fordel for en slik observasjon. Det er lett å forestille seg fluorescently tagget proteiner merking spesifikke cellulære organeller eller andre stanscriptional journalister blir integrert i fremtiden.
Vi var interessert i den relative timing av primære cilium dannelse og Hysj respons i datteren cellene i en dele celle. Imidlertid uttrykte den transgene linjen som gjorde oss i stand til å overvåke Hysj respons Olig2-eGFP hele cytoplasma, utelukker oss fra å se markør av den primære cilium, Sstr3-GFP i samme celle. Dermed vil vi ha stor nytte av enten en kjernefysisk begrenset Olig2-eGFP eller en spectrally tydelig Sstr3 fluorescerende protein fusion.
I tillegg til å bruke målrettet og transgene linjer, viste vi at vår teknikk kan tilpasses ved hjelp av viral konstruerer og at infisere neuroepithelium i kultur gir nyttige data. Dette vil være nyttig for undersøkere i å gi en raskere metode enn generering av en genetisk modifisert mus linje. I tillegg kan tilnærmingen validere genereringen av en slik linje, ja, våre data hevder en transgenic linjen uttrykker Sstr3-GFP vil være av stor nytte for feltet.
Vår metode gir verktøy som feltet kan mer umiddelbart overvåke celle atferd. Koblet til de rike ressursene i mus mutanter forventer vi denne metoden til å være spesielt kraftig i behandlingen av en rekke cellulære atferd i situ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette forskningsprosjektet ble støttet av en Arra Supplement, 5 R01 NS056380. Ekstra støtte ble gitt gjennom Viral Vector Core og den Mikroskopi Kjernen i Emory Neuroscience ninds Kjerne utstyr stipend, P30NS055077. Vi takker Emory transgene mus og Gene Targeting Kjerne for å utlede musen linje fra GENSAT; Greg Pazour for stallen SSTR3-GFP IMCD3 cellelinje, og Bradley Yoder for Sstr3-GFP lentiviral konstruere. Monoklonale antistoffer ble innhentet fra Developmental Studies hybridom Bank, utviklet i regi av NICHD og vedlikeholdes av The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, 52242 IA. Alle dyr prosedyrene ble godkjent av IACUC og biosikkerhet Committee ved Emory University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J | Jackson Laboratory | 005438 | |
| Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd | MMRRC, | 010555-UCD | |
| CAGGCreER | Jackson Laboratory | 003724 | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| DMEM/F12 (1:1) | GIBCO | 21041-025 | |
| Newborn calf serum | Lonza | 14-416F | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Rat Serum SD male | Harlan Bioproducts | 4520 | |
| 1M Hepes | BioWhittaker | 17-737E | |
| L-Glutamine | GIBCO | 21041-025 | |
| Light mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Sstr3-GFP lentivirus | Emory Viral Core | ||
| Micro-knife, size 0.025 mm | Electron Microscopy Sciences | 62091 | |
| 35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish | MatTek | P35GC-0-10-C | |
| 100% Petroleum Jelly | Kroger | FL9958c | |
| A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope | Nikon | ||
| NIS Elements software | Nikon | ||
| Imaris 3D software | Bitplane AG | Imaris 7.2.3 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Parafolmaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffer | Lab made | ||
| Rat monoclonal anti-RFP (5F8) | Chromotek | 110411 | |
| Rabbit anti-Arl13b serum | NeuroMab | ||
| mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 | NeuroMab | ||
| Rabbit anti-Olig2 | Chemicon | AB9610 | |
| Mouse monoclonals Pax6 | Developmental Hybridoma Bank | Pax6 | |
| Mouse monoclonalsShh | Developmental Hybridoma Bank | 5E1 | |
| Mouse monoclonals Nkx2.2 | Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | |
| Rabbit polyclonal Ki67 | Abcam | AB15580 | |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 | Molecular Probes | A11031 | |
| Alexa Fluor 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| H–chst | Fisher | AC22989 | |
| TO-PRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36934 |
References
- Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the neural tube: motor neuron induction by diffusible factors from notochord and floor plate. Cell. 73, 673-686 (1993).
- Ericson, J., Muhr, J., Placzek, M., Lints, T., Jessell, T. M., Edlund, T. Sonic hedgehog induces the differentiation of ventral forebrain neurons: A common signal for ventral patterning within the neural tube. Cell. 81, 747-756 (1995).
- Briscoe, J. A. Homeodomain Protein Code Specifies Progenitor Cell Identity and Neuronal Fate in the Ventral Neural Tube. Cell. 101, 435-445 (2000).
- Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol. Biol. Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).
- Vintersten, K. Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals. Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).
- Hayashi, S., McMahon, A. P. Efficient recombination in diverse tissue by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse. Dev. Biol. 244 (2), 305-318 (2002).
- Gong, S., Zheng, C., Doughty, M. L., Losos, K., Didkovsky, N., Schambra, U. B., Nowak, N. J., Joyner, A., Leblanc, G., Hatten, M. E., Heintz, N. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
- Mukouyama, Y. S., Deneen, B., Lukaszewicz, A., Novitch, B. G., Wichterle, H., Jessell, T. M., Anderson, D. J. Olig2+ neuroepithelial motoneuron progenitors are not multipotent stem cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1551-1556 (2006).
- Jones, E. A. V., Crotty, D., Kulesa, P. M., Waters, C. W., Baron, M. H., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture. Genesis. 34, 228-235 (2002).
- Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. Live imaging of individual cell divisions in mouse neuroepithelium shows asymmetry in cilium formation and Sonic hedgehog response. Cilia. 1 (6), In Press (2012).
- Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. -K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods in Enzymology. 476, 351-377 (2010).
