Summary
Her udvikler vi de nødvendige redskaber til
Abstract
Vi udviklede et system, der integrerer levende billeder af fluorescerende markører og dyrkning skiver af embryonale muse neuroepithelium. Vi tog fordel af eksisterende muselinjer til genetisk celleafstamning sporing: a tamoxifen-inducerbar Cre linje og en Cre reporter linje udtrykker DsRed upon Cre-medieret rekombination. Ved hjælp af et relativt lavt niveau af tamoxifen, var vi i stand til at inducere rekombination i et lille antal celler, tillader os at følge individuelle celledelinger. Desuden har vi observeret transkriptionel respons på Sonic Hedgehog (Shh) signalering ved hjælp af en Olig2-eGFP transgene linje 1-3, og vi overvåget dannelsen af cilier ved at inficere den kultiverede skive med virus, der udtrykker cilia markør, Sstr3-GFP 4.. For at billedet neuroepithelium, vi høstede embryoner på E8.5, isoleret neuralrøret, monteret den neurale skive i ordentlig dyrkningsbetingelser i imaging kammeret og udførte time-lapse konfokal billedbehandling. Vores exvivo billeddannelse metode gør det muligt at spore en enkelt celledelinger at vurdere den relative timing af primær cilier dannelse og Shh respons i et fysiologisk relevant måde. Denne metode kan let tilpasses ved hjælp distinkte fluorescerende markører og giver marken de redskaber til at overvåge celle adfærd in situ og i realtid.
Protocol
Voksne mus aflives ved mekanisk cervikal dislokation. Alle dyreforsøg blev godkendt af IACUC og biosikkerhed udvalget på Emory University.
1.. Embryo Generation
- Cross tamoxifen-inducerbare Cre linje, CAGGCreER og dsRedCre reporter linje (Tg (CAG-Bgeo,-DsRed * MST) 1Nagy) (figur 1) 5,6. At overvåge den relative timing af Shh respons i datter celler, cross CAGGCreER og DsRed linje med Olig2-eGFP BAC transgene mus (Tg (Olig2-EGFP) EK23Gsat) (figur 1) 7,8.
- Opløs tamoxifen i 100% ethanol og udføre intraperitoneal injektion af 2,5 mg tamoxifen per 40 g legemsvægt i drægtige hunner med embryonale 6,5 (E6.5) for at inducere Cre udtryk og DsRed mærkning i en lille delmængde af celler.
- 48 hr senere dissekere embryoner identificere DsRed positive embryoner ved hjælp af fluorescerende mikroskop, overføre dem til kulturen parabol og obsere single celledelinger under ex vivo imaging (se nedenfor).
2.. Hele Mouse Embryo Culture
- Dissekere E8.5 embryoer i forvarmet vask medium indeholdende DMEM/F12 (1:1) suppleret med 10% serum fra nyfødt kalv og 1% penicillin / streptomycin (P / S) 9..
- Umiddelbart efter dissektion, sted embryoer på 37 ° C varme etape under fluorescerende mikroskop og identificere som GFP-og / eller DsRed positive (se nedenfor).
- Overfør op til 2 embryoner i en 500 pi dråbe af præ-ækvilibrerede dyrkningsmedier indeholdende 50% Rat Serum fra en Sprague-Dawley han og 50% DMEM/F12 (1:1) uden phenolrødt suppleret med L-Glutamin og 1% af 1 M HEPES i 0,85% NaCl og P / S 9..
- Påfør et tyndt lag (0,1 cm) af ækvilibreret let mineralolie over mediet for at forhindre fordampning og overføre kulturen skål indeholdende embryoner til 37 ° C, 5% CO2-inkubator.
3..Virusinfektion
- For at mærke cilier i neuroepithelium, tilsæt 5-10 ul Sstr3-GFP lentivirus, omkring 2 millioner virioner til en 500 pi ækvilibreret dråbe dyrkningsmedium indeholdende en E8.5 foster.
- Efter 18 timer af kultur, overføre inficerede embryo i flere dråber vask medium at udvaske virus og forberede neuralrøret skive.
4.. Neural Tube Slice Forberedelse til Live Imaging
- Dissekere neuralrøret af E8.5 embryoer i forvarmet vask medium ved hjælp af en mikro-kniv størrelse 0,025 mm, på en 1% agar belagt skålen.
- Placer isolerede neuralrøret ventrale nedad i en 150 ul dråbe ækvilibreret dyrkningsmedium uden phenolrødt på 35 mm poly-L-lysin belagt glas bund skålen.
- Put små mængder af en 1:1 blanding fremstillet af 100% ren vaseline og smeltet stearin (stearinlys fra IKEA) omkring monterede neuralrøret, og tryk forsigtigt med et smalt stykke dækglas for atimmobilisere prøven.
- Dæk skålen med et tyndt lag (~ 0,1 cm) af ækvilibreret let mineralolie (figur 2).
5.. Levende Imaging and Time-lapse konfokal mikroskopi
- Placer fadet under Nikon A1R laser konfokal inverteret mikroskop udstyret med et klimakammer, der regulerer temperaturen, indstilles til 37 ° C, og 5% CO2.
- Brug 60x olieimmersionsobjektiv at optage GFP mærket cilier og DsRed positive celler, mens 40x olieimmersionsobjektiv brug for at overvåge Olig2-GFP og DsRed positive celler.
- Åbn NIS Elements software til at oprette tidsudløbsdata imaging forhold. Hver 10 min erhverve z-stakke på op til 25 um med en afstand på 1,5 um (40x mål) og op til 8 um med en afstand på 0,4 um (60x objektiv). Brug 488 og 561 nm de excitationsbølgelængder og transmitteret kanal, hvis nødvendigt. Hente billeder på 512 x 512 størrelse. Oprette flere bruger-definerede områder af intpåløbne at udføre samtidig optagelse.
Optimal eksponering for laser magt og lysstyrken i billedet blev justeret ved brug lav laser intensitet (op til 11% for mCherry 561, op til 4,5% EGFP 405/488), scan hastighed 1, linje gennemsnit 2 og størrelsen af pin hul (61 um til DsRed, 28.1 um til Olig2, 72 um til SSTR3GFP; 61.3 um til DsRed og SSTR3GFP; 58 um til DsRed og Olig2). Anvendelsen af genetisk indkodede fluorescerende reportere muligt for os at spore lysstyrken med lav lasereffekt. - Analyser indspillede data ved hjælp Imaris 3D rekonstruktion software.
6.. Immunofluorescens
- Lave embryoner eller isolerede neurale rør i 4% paraformaldehyd / 0,1 M phosphatpuffer på is (4 ° C) i 1 time i en glasskål.
- Vask prøverne 2 timer i PBS på is (4 ° C) (ændre PBS et par gange) og sættes i 30% saccharose / 0,1 M phosphatpuffer over natten eller indtil embryoner vasken.
- Integrere i OLT fastfrysning af tøris og opbevares i -80 ° C. PForetag en sektionering på cryostat (10 mm).
- Vask slides i 10 minutter i vaskeopløsning indeholdende 1% varmeinaktiveret fåreserum og 0,1% Triton X-100 i PBS.
- Fortynd primære antistoffer i vaskeopløsning i følgende koncentrationer: Rotte monoklonalt anti-RFP (5F8,) 1:200, Kanin anti-Arl13b serum 1:1500 og mus monoklonalt anti-Arl13b 1:5 (295B/54) Kanin anti-Olig2 1:300, mus monoklonale Pax6, Shh og Nkx2.2-all 01:10, og kaninpolyklonalt Ki67 1:500. Tilføj omkring 150 pi per dias flad befugtet kammer, dække med parafilm at undgå udtørring og lade over natten over ved 4 ° C.
- Vask objektglassene i vaskeopløsning tre gange, 20 minutter hver gang ved stuetemperatur.
- Fortyndet sekundære antistoffer Alexa Fluor 488, 568, 350 i vaskeopløsninger på 1:200 koncentration. Brug Hoechst 1:3000 eller TO-PRO-3 1:500 til farvning kerner. Tilsæt 150 ul pr dias, lad 1 time ved stuetemperatur i fugtigt kammer beskyttet mod lys.
- Vask slides i vask-løsning two gange, 30 minutter hver gang ved stuetemperatur.
- Mount glider i 80% Forlæng Guld anti-fade reagens og billede inden 24 timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her udførte vi ex vivo levende billeddannelse af encellede splittelse i E8.5 musen neuroepithelium. At mærke individuelle celler, vi induceret Cre-rekombinase i en undergruppe af celler indeholdende en Cre reporter linje der udtrykte DsRed ved rekombination 5,6 (figur 3A). Således 48 timer senere var vi i stand til at observere en enkelt celledelinger under ex vivo imaging (4A-D). Samtidig har vi overvåges, når de mærkede celler blev Shh-responsiv ved at inkludere en Shh transcriptional reporter modificeret BAC transgene Olig2-eGFP linje (figur 3C-D Tal 4G-N) 1-3. At observere cilier formation vi genererede Sstr3-GFP lentivirus at inficere embryoner i kultur (figur 3B, 4A-D) 4.. Immunofluorescens blev udført for at bekræfte in vivo resultater (figur 4E-F).
Den tid-omgangee konfokal imaging observation af dsRedCre reporter embryoner udtrykker Olig2-eGFP eller inficeret med Sstr3-GFP lentivirus under in vitro kultur vist i figur 5 10. For at være sikker på, at Sstr3-GFP udtryk vi bruger til at visualisere cilier ikke var blande med nogen underliggende biologiske proces, vi bekræftet vores live billeddiagnostiske data med faste vildtype embryo sektioner. Fordi vi fandt den samme procentdel af asynkron i cilier dannelse og Shh respons, angiver det SSTR3-GFP virus påvirkede ikke disse processer (figur 5A).
Figur 1. Flow diagram af ex vivo levende imaging procedure ved hjælp af musen neuroepithelium. Den endelige muse cross og tamoxifen behandling er afbildet efterfulgt af hele museembryo dyrkningsmetode. Embryoner udtrykker fluorescens mærkede proteiner er udvalgt og forberedt til direkte billedvisning. Klik her for at se større figur .
Figur 2. Neuralrøret skive forberedelse til direkte billedvisning. A) E8.5 unturned embryo med første forekomst af somite par. B) neuralrøret dissekeret i forvarmet medium ved hjælp af en mikro-kniv. C) neuralrøret skive er monteret ventrale nedad poly-L-lysin belagt glas bund skålen. D) Lille mængde af en blanding fremstillet af vaseline og voks påføres omkring neuralrøret og forsigtigt dækket af en naRROW stykke dækglas. Klik her for at se større figur .
Figur 3. Visualisere fluorescens mærkede proteiner i levende celler i neuralrøret med konfokal mikroskopi. A) DsRed etiketter individuelle celler. B) SSTR3-GFP lentivirus udtrykt i primær cilier, som de form (gule pilespidser). CD) E8.5 embryo bærer Olig2-GFP viser GFP-ekspression i neuroepithelium. Bar er 30 um (A, D), 15 um (B) og 1,5 um (C).
Figur 4.. Overvågning cilier dannelse og Shh signalering i delende celler i udviklingslandene neuralrøret. AD) Single DsRed positive celle undergår division viser et cilium former i en datter celle før andre celler (C, hvid pil). Filmen blev afbildet med en hastighed på én ramme hver 10 min. EF) Immunofluorescence hjælp antistoffer mod RFP i grøn (for DsRed afstamning opsporing) samt Arl13b i rødt (for cilier). Udvidelsen af boxed område (E), uden Hoechst (F). GN) Den DsRed positive celle undergår division (IM). Den Olig2-GFP udtrykkes kun i en datter (J, N). Optagelsen blev afbildet med en hastighed på én ramme hver 10 min. Bar er 5 m (AD), 50 um (F), 25 um (GN).
Figur 5. Tælling af DsRed positive celle med cilier og Shh udseende. A) Antal DsRed celler undergår division og cilia lokalisering. Symbol * mener med levende billedbehandling cilia dannelse var synkrone. B) Antal DsRed og Olig2-GFP positive celler undergår division og Shh signalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vores ex vivo system gør det muligt for os at direkte iagttage enkelt celledelinger under udviklingen neuroepithelium i realtid. Som et eksempel har vi undersøgt celledelinger i muse embryonale neuralrøret og overvåges enten cilium dannelse eller Shh respons. Vi bekræftede vores imaging resultater (n = 24) var i overensstemmelse med resultaterne fra faste sektioner (n = 178) indikerer vores teknik giver fysiologisk relevante data.
Vor teknik bygger på Cre induktion er begrænset til en delmængde af celler, så dosis af tamoxifen skal være præcise. Vi arbejdede ud dosering til mærkning enkelte celler. Vi mener, det ville være nemt at mærke små kloner af celler med en svag stigning i dosis baseret på den indledende analyse af CAGGcreER linje, som viste en dosisafhængig respons på tamoxifen 6.. Derudover embryo dyrkningsbetingelserne er kritiske, så unormal udvikling sker, hvis betingelserne er slukket.Vi bekræftede, at udviklingen gik normalt under dyrkningsbetingelserne brugte vi, som er kendt for at arbejde i mindst 36 hr 11.
De inducerbare Cre og Cre reporter linjer vi anvender, er offentligt tilgængelige, så nemt kan indhente gøre denne teknik helt tilpasses til forskere med en bred vifte af spørgsmål. Den virkelige magt i vores teknik er, at i genetisk mærkning enkelte celler kan vores tilgang bruges til at afhøre enkelt celle adfærd i de mange eksisterende og fremtidige mutant mus linjer. Dette vil være afgørende for at forstå, hvad der virkelig går galt i mange af disse linjer som direkte observation af cellerne i pattedyr embryo under udvikling er ikke blevet grundigt undersøgt. Vores incorporaton af genetisk kodede fluorescerende journalister at opdage lysstyrken med lav laser magt giver en reel fordel for en sådan observation. Det er let at forestille sig, fluorescens mærkede proteiner mærkning specifikke cellulære organeller eller andre stanscriptional reportere integreres i fremtiden.
Vi var interesseret i den relative timing af primær cilium dannelse og Shh respons i afledte celler af en dividere celle. Men den transgene linje, der gjorde det muligt at overvåge Shh respons udtrykt Olig2-eGFP hele cytoplasmaet, udelukker os fra at se markør af den primære cilium, Sstr3-GFP i samme celle. Således vil vi i høj grad har nydt godt af enten en nuklear begrænset Olig2-eGFP eller et spektralt tydelig Sstr3 fluorescerende protein fusion.
Ud over at bruge målrettede og transgene linje viste vi, at vores teknik kan tilpasses ved hjælp af virale konstruktioner og at inficere neuroepithelium i kultur giver nyttige data. Det vil være nyttigt for efterforskere i at yde en hurtigere metode end generering af en genetisk modificeret mus linje. Derudover kan den tilgang validere generation af en sådan linje, ja, vores data argumentere en transfremkaldende line udtrykker Sstr3-GFP vil være til stor nytte for feltet.
Vores metode giver redskaber til marken kan mere umiddelbart overvåge celle adfærd. Koblet til de rige ressourcer af mus mutanter forventer vi denne metode til at være særligt stærke i behandlingen af en række cellulære adfærd in situ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette forskningsprojekt blev støttet af et arra Supplement, 5 R01 NS056380. Yderligere støtte blev ydet gennem Viral Vector Core og Microscopy Core af Emory Neuroscience NINDS Core Facilities tilskud, P30NS055077. Vi takker Emory transgene mus og Gene Targeting Core for at udlede musen linje fra GENSAT, Greg Pazour for den stabile SSTR3-GFP IMCD3 cellelinje, og Bradley Yoder for Sstr3-GFP lentivirusoprindelse konstruere. Monoklonale antistoffer blev opnået fra Developmental Studies Hybridoma Bank, udviklet i regi af NICHD, og vedligeholdes af The University of Iowa, Biologisk Institut, Iowa City, IA 52.242. Alle dyreforsøg blev godkendt af IACUC og biosikkerhed udvalget på Emory University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J | Jackson Laboratory | 005438 | |
| Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd | MMRRC, | 010555-UCD | |
| CAGGCreER | Jackson Laboratory | 003724 | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| DMEM/F12 (1:1) | GIBCO | 21041-025 | |
| Newborn calf serum | Lonza | 14-416F | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Rat Serum SD male | Harlan Bioproducts | 4520 | |
| 1M Hepes | BioWhittaker | 17-737E | |
| L-Glutamine | GIBCO | 21041-025 | |
| Light mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Sstr3-GFP lentivirus | Emory Viral Core | ||
| Micro-knife, size 0.025 mm | Electron Microscopy Sciences | 62091 | |
| 35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish | MatTek | P35GC-0-10-C | |
| 100% Petroleum Jelly | Kroger | FL9958c | |
| A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope | Nikon | ||
| NIS Elements software | Nikon | ||
| Imaris 3D software | Bitplane AG | Imaris 7.2.3 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Parafolmaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffer | Lab made | ||
| Rat monoclonal anti-RFP (5F8) | Chromotek | 110411 | |
| Rabbit anti-Arl13b serum | NeuroMab | ||
| mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 | NeuroMab | ||
| Rabbit anti-Olig2 | Chemicon | AB9610 | |
| Mouse monoclonals Pax6 | Developmental Hybridoma Bank | Pax6 | |
| Mouse monoclonalsShh | Developmental Hybridoma Bank | 5E1 | |
| Mouse monoclonals Nkx2.2 | Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | |
| Rabbit polyclonal Ki67 | Abcam | AB15580 | |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 | Molecular Probes | A11031 | |
| Alexa Fluor 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| H–chst | Fisher | AC22989 | |
| TO-PRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36934 |
References
- Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the neural tube: motor neuron induction by diffusible factors from notochord and floor plate. Cell. 73, 673-686 (1993).
- Ericson, J., Muhr, J., Placzek, M., Lints, T., Jessell, T. M., Edlund, T. Sonic hedgehog induces the differentiation of ventral forebrain neurons: A common signal for ventral patterning within the neural tube. Cell. 81, 747-756 (1995).
- Briscoe, J. A. Homeodomain Protein Code Specifies Progenitor Cell Identity and Neuronal Fate in the Ventral Neural Tube. Cell. 101, 435-445 (2000).
- Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol. Biol. Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).
- Vintersten, K. Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals. Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).
- Hayashi, S., McMahon, A. P. Efficient recombination in diverse tissue by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse. Dev. Biol. 244 (2), 305-318 (2002).
- Gong, S., Zheng, C., Doughty, M. L., Losos, K., Didkovsky, N., Schambra, U. B., Nowak, N. J., Joyner, A., Leblanc, G., Hatten, M. E., Heintz, N. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
- Mukouyama, Y. S., Deneen, B., Lukaszewicz, A., Novitch, B. G., Wichterle, H., Jessell, T. M., Anderson, D. J. Olig2+ neuroepithelial motoneuron progenitors are not multipotent stem cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1551-1556 (2006).
- Jones, E. A. V., Crotty, D., Kulesa, P. M., Waters, C. W., Baron, M. H., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture. Genesis. 34, 228-235 (2002).
- Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. Live imaging of individual cell divisions in mouse neuroepithelium shows asymmetry in cilium formation and Sonic hedgehog response. Cilia. 1 (6), In Press (2012).
- Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. -K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods in Enzymology. 476, 351-377 (2010).
