Summary
在这里，我们开发所需的工具
Abstract
我们开发了一个系统，集成了实时成像的荧光标记物和小鼠胚胎神经上皮的培养切片。我们利用现有的鼠标线的遗传细胞谱系追踪：他莫昔芬诱导的Cre线和红色荧光蛋白的酶Cre记者表达Cre重组酶介导的重组后。通过使用他莫昔芬的相对较低的水平，我们能够在一个小数量的细胞以诱导重组，允许我们按照个别的细胞分裂。此外，我们观察到的转录反应刺猬（SHH）信号使用OLIG2-EGFP转基因株系1-3，我们监测纤毛的形成与病毒感染培养的片表达的纤毛标记，SSTR3-GFP 4。为了图像的神经上皮，我们收获胚胎E8.5，分离出神经管，安装在适当的培养条件下成神经切片成像室和执行时间推移共聚焦成像。我们的前活体内成像方法，使我们能够跟踪单细胞分裂，初级纤毛的形成和Shh响应有关生理的方式评估的相对时序。这种方法可以很容易地适应用不同的荧光标记物，并提供该字段，用以监测细胞行为的原产地和实时的工具。
Protocol
成年小鼠安乐死机械颈椎脱位。所有动物的程序批准由IACUC和埃默里大学生物安全委员会。
1。胚胎生成
- 过他莫昔芬诱导表达Cre重组酶行CAGGCreER，dsRedCre记者线（玻璃转化温度（CAG-BGEO的，红色荧光蛋白* MST）1Nagy）（ 图1）5,6。要监视的Shh的响应中的子细胞，跨CAGGCreER和DsRed的配合的OLIG2-eGFP的BAC转基因小鼠（Tg的（OLIG2-EGFP）EK23Gsat）（ 图1）7,8间的相对定时。
- 他莫昔芬100％的乙醇溶解，并执行到怀孕的女性在胚胎6.5（E6.5）腹腔注射2.5毫克每40克体重的他莫昔芬诱导Cre表达中的一小部分细胞和DsRed标记。
- 48小时后胚胎解剖，查明DsRed的阳性胚胎使用荧光显微镜，他们转移到培养皿中观测E单细胞分裂过程中体外成像（见下文）。
2。全小鼠胚胎文化
- 解剖E8.5胚胎在预热的的洗涤培养基中的DMEM/F12（1:1）中添加10％新生小牛血清和1％青霉素/链霉素（P / S）9。
- 直接解剖后，放置在37℃加热阶段的胚胎在荧光显微镜下识别GFP和/或DsRed的阳性（见下文）。
- 传输多达2个胚胎成500μl的预平衡补充L-谷氨酰胺的无酚红培养基中含有50％从只Sprague-Dawley雄性大鼠血清和50％的DMEM/F12（1:1）和1％的颗粒在0.85％NaCl和P / S 9 1 M HEPES。
- 涂抹薄薄的一层（0.1厘米）平衡过的轻质矿物油以防止蒸发，含有胚胎的培养皿转移到37℃，5％CO 2培养箱中在中。
3。病毒感染
- 在以神经上皮纤毛标签，添加5-10微升的SSTR3-GFP慢，约2万病毒颗粒，到500微升平衡下降培养基含有E8.5胚胎。
- 培养18小时后，感染的胚胎转移到几滴洗涤介质洗出病毒，并准备神经管片。
4。神经管片制备实时成像
- 解剖神经管预热的洗涤介质中，使用一个微型刀尺寸0.025毫米，在1％的琼脂涂层菜E8.5胚胎。
- 将孤立的神经管腹侧平衡培养基150μL降不含酚红35毫米的聚-L-赖氨酸镀膜玻璃底菜。
- 将少量的混合物（1:1）由100％纯凡士林和融化的蜡烛（蜡烛宜家）神经管周围安装，并轻轻按压，以一个狭窄的一块玻璃盖玻片固定样本。
- 量烹调平衡轻质矿物油（ 图2）有一薄层（约0.1厘米）。
5。实时成像和时间推移共聚焦显微镜
- 地方菜下尼康的A1R激光的扫描共聚焦显微镜倒置显微镜配备环境室调节温度，设定为37℃，5％CO2。
- 使用油浸物镜60X记录GFP标记的纤毛和DsRed的阳性细胞，而40倍的油浸物镜使用监控OLIG2 GFP和DsRed阳性细胞的。
- 打开NIS Elements软件成立时间推移成像条件。每10分钟获得的z叠至25μm，间隔为1.5μm（40倍物镜）和最多8微米，间距为0.4μm的（60倍物镜）。如果需要使用488和561 nm的激发波长和传输通道。收购512×512大小的图像。设置多个用户定义的int地区erest进行同步录制。
通过使用低激光强度（最多11％561 mCherry EGFP的488分之405高达4.5％），扫描速度1，线路2和平均大小的销孔（61获得最佳曝光的激光功率和图像的亮度的调整红色荧光蛋白微米，28.1微米为OLIG2; 72微米为SSTR3GFP;为红色荧光和SSTR3GFP的61.3微米，58微米DsRed和OLIG2的）。基因编码的荧光记者的使用使我们能够检测到的亮度与激光功率低。 - 分析记录的数据使用Imaris里三维重建软件。
6。免疫
- 修复胚胎或孤立的神经管在4％多聚甲醛/ 0.1 M磷酸缓冲液冰（4℃），在玻璃盘1小时。
- 洗净的样品2小时，在冰上在PBS（4℃）（变化PBS了几次），并把在30％蔗糖/ 0.1 M的磷酸盐缓冲液在夜间或直至胚胎下沉。
- 嵌入在华侨城，冻结干冰上并储存在-80°C。 Perform切片在低温恒温器（10毫米）。
- 洗10分钟，在洗涤溶液中含有1％热灭活的羊血清和0.1％的Triton X-100的PBS中的幻灯片。
- 后浓度稀释在洗涤溶液中的初级抗体：鼠单克隆抗RFP（5F8）1:200;兔抗血清1:1500 Arl13b和小鼠单克隆抗Arl13b 1:5（295B/54）;兔抗OLIG2中1:300;鼠标单克隆抗体，Shh和Nkx2.2所有1:10 PAX6和多克隆Ki67的1:500。新增约150微升平加湿室每张幻灯片，用封口膜覆盖，以避免干燥和遗留晚上，在4°C
- 洗三次，每次20分钟，在室温下在洗涤溶液中的幻灯片。
- 在洗涤解决方案1:200浓度稀释第二抗体的Alexa Fluor 488，568，350。使用赫斯特1:3,000或TO-PRO-3 1:500染色细胞核。每张幻灯片中加入150μl，离开1小时，在室温下避光加湿室。
- 在洗涤溶液总重量洗净幻灯片O次数，每次30分钟，在室温下。
- 安装滑动在80％，，延长黄金抗褪色试剂和视图的24小时内。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
在这里，我们进行体外实时成像单细胞分裂E8.5小鼠神经上皮内。要标记单个细胞，诱导Cre重组酶在细胞内含有一个的酶Cre记者行表达红色荧光蛋白重组后，5,6（ 图3A）的一个子集。因此，48小时后，我们能够观察到在体外成像（ 图4A-D）的单细胞分裂。随之而来的是，我们监测标记细胞成为嘘响应的包括修改BAC转基因OLIG2-EGFP线（ 图3C-D;图4G-N）1-3嘘转录记者。要观察纤毛的形成，我们产生SSTR3-GFP慢病毒感染培养的胚胎（ 图3B，图4A-D）4。免疫荧光法进行，以确认在体内的结果（ 图4E-F）。
时间圈记者dsRedCre表达OLIG2-EGFP的胚胎在体外培养期间与SSTR3-GFP慢或感染É共聚焦成像观察显示在图5 10。为了SSTR3-GFP的表达，我们使用可视化纤毛确保不会干扰任何潜在的生物学过程，我们佐证了我们的实时成像数据与固定野生型胚胎部分。因为我们发现了同样的百分比的异步纤毛形成和Shh响应，它表示的的SSTR3-GFP病毒并不会影响这些进程（ 图5A）。
图1。鼠标的最后交叉和tamoxi的流程图体外实时成像程序使用鼠标神经上皮。芬治疗描绘整个小鼠胚胎培养方法。表达荧光标记蛋白的胚胎挑选和准备实时成像。 点击这里查看大图 。
图2。神经管片编制实时成像。）E8.5千方百计胚胎的首次亮相体节对B）神经管解剖预热介质用微型刀。）神经管片安装倒在腹侧聚-L-赖氨酸涂布的玻璃底菜D）的量小，从凡士林油和蜡的混合物，应用神经管周围，轻轻地覆盖由一个缺rrow一块玻璃盖玻片。 点击这里查看大图 。
图3。可视化荧光标记的蛋白质在神经管活细胞共聚焦显微镜A）红色荧光蛋白标记B）的 SSTR3-GFP的慢病毒表达形式（黄色箭头）初级纤毛。CD）E8.5胚胎携带OLIG2-GFP单个细胞。显示GFP表达神经上皮内。酒吧（A，D）为30微米，15微米和1.5微米（C）（B）。
图4。纤毛形成监测和Shh信号在分裂的细胞发展神经管AD）单DsRed的阳性细胞分裂显示了一个女儿细胞纤毛形式在之前的其他细胞（C，白色箭头）。电影成像的一帧的速率，每10分钟，EF）免疫荧光法使用抗RFP在绿色（DsRed的谱系追踪）和红色Arl13b（纤毛）。盒装区（E），无赫斯特（F）。GN）扩大DsRed的阳性细胞进行分裂（IM）。该OLIG2-GFP的表达只有一个女儿（J，N）。在记录成像的一帧的每10分钟的速率。酒吧是5微米（AD），50微米（F），25微米（GN）。
图5。红色荧光蛋白阳性细胞纤毛和Shh的外观计数A）红色荧光蛋白的细胞进行分裂和纤毛本地化数。符号*表示，实时成像纤毛的形成是同步的。B）红色荧光蛋白和OLIG2-GFP阳性细胞进行分裂和Shh信号的数量。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
我们的体外系统，使我们在发展中的神经上皮实时直接观察单个细胞分裂。作为一个例子，我们研究小鼠胚胎神经管内的细胞分裂和监控无论是纤毛形成或嘘响应。我们确认我们的成像效果组（n = 24）与固定部分（N = 178），表明我们的技术提供有关生理数据的结果是一致的。
我们的技术依赖于被限制酶Cre诱导的细胞的一个子集，因此，他莫昔芬的剂量必须精确。我们制定了剂量单细胞标记。我们相信，这将是很容易有轻微的增加剂量的基础上初步分析，呈剂量依赖性反应，他莫昔芬6 CAGGcreER线标记小细胞克隆。此外，胚胎培养条件是至关重要的，因为如果出现发育异常的条件是关闭。我们证实，发展正常进行培养条件下我们使用，这是众所周知的工作至少36小时11。
诱导Cre重组酶Cre记者行我们使用的是公开可用的，所以使得这个技术相当适应各种问题的研究人员可以很容易获得。我们的技术的真正威力是在单细胞基因标记，我们的方法可以用来审问单细胞行为的许多现有的和未来的突变小鼠线。了解什么是真正的错在许多哺乳动物胚胎发育过程中的细胞内直接观察这些线已经得到了广泛的研究，这将是至关重要的。我们的基因编码的荧光记者incorporaton检测激光功率低亮度，提供了一个真正的优势，这样的观察。这是很容易想象荧光标记的蛋白质标记特定的细胞器或其他TRanscriptional记者集成的未来。
我们感兴趣的是相对初级纤毛的形成和Shh子细胞分裂细胞反应时间。但是，转基因株系，使我们能够监视响应的Shh表达OLIG2-eGFP的整个细胞质中，禁止我们看到在同一个细胞的的主要纤毛，SSTR3-GFP标记。因此，我们会大大受益于核限制OLIG2-EGFP或光谱上不同的的SSTR3荧光蛋白融合。
除了使用的针对性和转基因株系中，我们发现，我们的技术可以使用病毒结构调整，并感染神经上皮文化提供了有用的数据。这将是有用的调查提供了一个更快的方法比一代的转基因小鼠线。此外，该方法可以验证这样一条线的产生;的确，我们的数据认为一个跨基因线表达SSTR3-GFP将是很有用处的领域。
我们的方法提供了与该领域可以更直接监测细胞行为的工具。小鼠突变再加上丰富的资源，我们期望这个方法来检查数组原位细胞行为，尤其是强大的。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
该研究项目得到了一个的ARRA补充，5 R01 NS056380。通过病毒载体核心和埃默里大学神经科学NINDS核心设施补助，P30NS055077显微镜核心提供额外的支持。我们感谢埃默里大学的转基因小鼠和基因打靶核心的鼠标线从GENSAT的派生格雷格帕佐尔SSTR3-GFP的稳定IMCD3细胞株; SSTR3-GFP慢病毒布拉德利尤德构建。单克隆抗体从发展研究杂交瘤细胞银行，开发的的NICHD的主持下，获得和维护由美国爱荷华大学生物科学系，爱荷华州爱荷华市52242。所有动物的程序批准由IACUC和埃默里大学生物安全委员会。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J | Jackson Laboratory | 005438 | |
| Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd | MMRRC, | 010555-UCD | |
| CAGGCreER | Jackson Laboratory | 003724 | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| DMEM/F12 (1:1) | GIBCO | 21041-025 | |
| Newborn calf serum | Lonza | 14-416F | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Rat Serum SD male | Harlan Bioproducts | 4520 | |
| 1M Hepes | BioWhittaker | 17-737E | |
| L-Glutamine | GIBCO | 21041-025 | |
| Light mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Sstr3-GFP lentivirus | Emory Viral Core | ||
| Micro-knife, size 0.025 mm | Electron Microscopy Sciences | 62091 | |
| 35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish | MatTek | P35GC-0-10-C | |
| 100% Petroleum Jelly | Kroger | FL9958c | |
| A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope | Nikon | ||
| NIS Elements software | Nikon | ||
| Imaris 3D software | Bitplane AG | Imaris 7.2.3 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Parafolmaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffer | Lab made | ||
| Rat monoclonal anti-RFP (5F8) | Chromotek | 110411 | |
| Rabbit anti-Arl13b serum | NeuroMab | ||
| mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 | NeuroMab | ||
| Rabbit anti-Olig2 | Chemicon | AB9610 | |
| Mouse monoclonals Pax6 | Developmental Hybridoma Bank | Pax6 | |
| Mouse monoclonalsShh | Developmental Hybridoma Bank | 5E1 | |
| Mouse monoclonals Nkx2.2 | Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | |
| Rabbit polyclonal Ki67 | Abcam | AB15580 | |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 | Molecular Probes | A11031 | |
| Alexa Fluor 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| H–chst | Fisher | AC22989 | |
| TO-PRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36934 |
References
- Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the neural tube: motor neuron induction by diffusible factors from notochord and floor plate. Cell. 73, 673-686 (1993).
- Ericson, J., Muhr, J., Placzek, M., Lints, T., Jessell, T. M., Edlund, T. Sonic hedgehog induces the differentiation of ventral forebrain neurons: A common signal for ventral patterning within the neural tube. Cell. 81, 747-756 (1995).
- Briscoe, J. A. Homeodomain Protein Code Specifies Progenitor Cell Identity and Neuronal Fate in the Ventral Neural Tube. Cell. 101, 435-445 (2000).
- Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol. Biol. Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).
- Vintersten, K. Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals. Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).
- Hayashi, S., McMahon, A. P. Efficient recombination in diverse tissue by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse. Dev. Biol. 244 (2), 305-318 (2002).
- Gong, S., Zheng, C., Doughty, M. L., Losos, K., Didkovsky, N., Schambra, U. B., Nowak, N. J., Joyner, A., Leblanc, G., Hatten, M. E., Heintz, N. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
- Mukouyama, Y. S., Deneen, B., Lukaszewicz, A., Novitch, B. G., Wichterle, H., Jessell, T. M., Anderson, D. J. Olig2+ neuroepithelial motoneuron progenitors are not multipotent stem cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1551-1556 (2006).
- Jones, E. A. V., Crotty, D., Kulesa, P. M., Waters, C. W., Baron, M. H., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture. Genesis. 34, 228-235 (2002).
- Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. Live imaging of individual cell divisions in mouse neuroepithelium shows asymmetry in cilium formation and Sonic hedgehog response. Cilia. 1 (6), In Press (2012).
- Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. -K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods in Enzymology. 476, 351-377 (2010).
