Summary
Hier entwickeln wir die notwendigen Werkzeuge für
Abstract
Wir entwickelten ein System, das Echtzeit-Bildgebung von fluoreszierenden Markern und Kultivierung von embryonalen Maus Scheiben Neuroepithel integriert. Wir nutzten vorhandene Mauslinien für genetische Zelllinie Tracing: eine Tamoxifen-induzierbare Cre Linie und einer Linie, die Cre-Reporter auf Cre-vermittelte Rekombination dsRed. Durch die Verwendung einer relativ niedrigen Tamoxifen, waren wir in der Lage, um eine Rekombination in einer kleinen Anzahl von Zellen zu induzieren, was uns erlaubt, einzelne Zellteilungen folgen. Darüber hinaus beobachtet man die transkriptionelle Reaktion auf Sonic Hedgehog (Shh) Signal mit einer Olig2-eGFP transgenen Linie 1-3 und man überwacht Bildung von Zilien mittels Infektion des kultivierten Scheibe mit Virus, das die Wimpern Marker SSTR3 4-GFP. Um das Bild Neuroepithel wir geerntet Embryonen bei E8.5, isoliert das Neuralrohr, montiert die neurale Scheibe in der richtigen Kulturbedingungen in die Kammer und Bildgebung durchgeführt Zeitraffer-konfokale Bildgebung. Unsere exLive vivo-Bildgebungsverfahren ermöglicht es uns, einzelne Zellteilungen zu verfolgen, um die relative Timing Hauptwimpern Bildung und Shh Antwort in einem physiologisch relevanten Weise zu beurteilen. Dieses Verfahren kann leicht angepasst werden, mit unterschiedlichen fluoreszierenden Markern und bietet das Feld die Werkzeuge, mit denen das Verhalten der Zelle in situ und in Echtzeit zu überwachen.
Protocol
Erwachsene Mäuse werden durch mechanische Genickbruch getötet. Alle tierischen Verfahren wurden vom IACUC und der Kommission für Biosicherheit an der Emory University genehmigt.
1. Embryo-Generation
- Kreuz Tamoxifen-induzierbare Cre Linie, CAGGCreER und dsRedCre Reporter Linie (Tg (CAG-Bgeo,-DsRed * MST) 1Nagy) (Abbildung 1) 5,6. Um die relative Timing der Shh Reaktion in den Tochterzellen, kreuz und CAGGCreER dsRed Einklang mit dem Olig2-eGFP BAC transgenen Mäusen (Tg (Olig2-EGFP) EK23Gsat) (Abbildung 1) 7,8 überwachen.
- Auflösen Tamoxifen in 100% Ethanol, und führen intraperitoneale Injektion von 2,5 mg Tamoxifen pro 40 g Körpergewicht in schwangeren Frauen an embryonalen 6.5 (E6.5) bis Cre Expression und dsRed Kennzeichnung in einer kleinen Untergruppe von Zellen zu induzieren.
- 48 Stunden später sezieren Embryonen zu identifizieren dsRed positive Embryonen mit Hilfe der Fluoreszenz-Mikroskop, übertragen Sie sie auf der Kulturschale und Beobachtere einzelne Zellteilungen in ex-vivo-Bildgebung (siehe unten).
2. Whole Embryo Culture Maus
- Präparieren E8.5 Embryonen in vorgewärmten Waschmedium mit DMEM/F12 (1:1) mit 10% Neugeborenen-Kälberserum und 1% Penicillin / Streptomycin (P / S) 9 ergänzt.
- Direkt nach der Präparation erfolgt Embryonen auf 37 ° C Heizstufe unter dem Fluoreszenzmikroskop und zu identifizieren, wie GFP und / oder dsRed positive (siehe unten).
- Übertragen Sie bis zu 2 Embryonen in einem 500 ul Tropfen voräquilibriert Nährböden mit 50% Serum Ratte aus einer Sprague-Dawley männlichen und 50% DMEM/F12 (1:1) ohne Phenolrot mit L-Glutamin ergänzt und 1% 1 M HEPES in 0,85% NaCl und P / S 9.
- Tragen Sie eine dünne Schicht (0,1 cm) von äquilibriert leichtes Mineralöl mittelfristig um Verdunstung zu verhindern und übertragen die Kulturschale mit den Embryonen in die 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator.
3.Viral Infection
- Um Etikett Flimmerhärchen in den Neuroepithel, fügen 5-10 ul SSTR3-GFP lentivirus, rund 2 Millionen Virionen zu einer 500 ul äquilibriert Tropfen Kulturmedium, das eine E8.5 Embryo.
- Nach 18 h der Kultur, übertragen infizierten Embryos in mehrere Tropfen waschen Medium zum Auswaschen des Virus und bereiten Neuralrohrdefekten Scheibe.
4. Neuralrohr Scheibe Vorbereitung für Live-Imaging
- Präparieren Neuralrohr des E8.5 Embryo in vorgewärmten Waschmedium mit einem Mikro-Messergröße 0,025 mm, auf einem 1% Agar beschichtete Schale.
- Legen Sie die Neuralrohrdefekte isolierten ventralen Seite nach unten in einer 150 ul Tropfen äquilibriert Kulturmedium ohne Phenolrot auf die 35 mm Poly-L-Lysin beschichteten Glasboden Gericht.
- Setzen geringe Mengen eines 1:1-Gemisches aus 100% reiner Vaseline und geschmolzen Kerzenwachs (Kerze aus IKEA) um den montierten Neuralrohr und vorsichtig auf ein schmales Stück Deckglas hergestellt, umImmobilisierung der Probe.
- Decken Sie die Schüssel mit einer dünnen Schicht (~ 0,1 cm) von äquilibriert leichtem Mineralöl (Abbildung 2).
5. Live-Imaging und Zeitraffer-konfokale Mikroskopie
- Platz Gericht unter dem Nikon A1R Lasermikroskop Inverses Mikroskop mit einer Klimakammer, die Temperatur reguliert ausgestattet, auf 37 ° C und 5% CO 2.
- Verwenden 60x Ölimmersionsobjektiv zu GFP-markierten Zilien und dsRed positiven Zellen aufzeichnen, während die 40x Ölimmersionsobjektiv Verwendung Olig2-GFP und dsRed positiven Zellen zu überwachen.
- Öffnen Sie die NIS Elements Software zum Einrichten Zeitreihenaufnahmen Bedingungen. Alle 10 min erwerben z-Stapel von bis zu 25 um mit einem Abstand von 1,5 um (40x) und bis zu 8 um mit einem Abstand von 0,4 um (60x Objektiv). Mit 488 und 561 nm die Anregungswellenlängen und übermittelt Kanal, wenn nötig. Erwerben Sie Bilder mit 512 x 512 Größe. Richten Sie mehrere benutzerdefinierte Regionen intERest zu erfüllen gleichzeitig die Aufnahme.
, Scan-Geschwindigkeit 1, Zeile 2 und durchschnittliche Größe der Lochblende (61; optimale Belichtung zu Laserleistung und Helligkeit des Bildes wurde durch Verwendung niedriger Laserintensität (bis zu 4,5% EGFP 405/488 bis zu 11% für mCherry 561) eingestellt um für dsRED; 28,1 um für Olig2; 72 um für SSTR3GFP; 61,3 um für dsRED und SSTR3GFP; 58 um für dsRED und Olig2). Die Verwendung von genetisch kodierten fluoreszierenden Reporter ermöglichte es uns, die Helligkeit mit geringen Laserleistung zu erkennen. - Analysieren aufgezeichneten Daten mit 3D-Rekonstruktion Imaris Software.
6. Immunfluoreszenz
- Fix Embryonen oder isolierten neuronalen Rohre in 4% Paraformaldehyd / 0,1 M Phosphat-Puffer auf Eis (4 ° C) für 1 Stunde in einer Glasschale.
- Waschen Proben 2 h in PBS auf Eis (4 ° C) (Änderung PBS ein paar Mal) und in 30% Saccharose / 0,1 M Phosphat-Puffer über Nacht oder bis Embryonen Waschbecken.
- Einbetten in OCT, Einfrieren auf Trockeneis und Speicher in -80 ° C. Perform Schneiden auf Kryostaten (10 mm).
- Den Objektträger für 10 min in Waschlösung, enthaltend 1% Hitze-inaktiviertes Schafserum und 0,1% Triton X-100 in PBS.
- Verdünnen Primärantikörper in Waschlösung bei folgenden Konzentrationen: Ratte monoklonalen anti-RFP (5F8,) 1:200; Rabbit anti-Arl13b Serum 1:1500 und monoklonalen Maus-anti-Arl13b 1:5 (295B/54); Rabbit anti-Olig2 1:300; Maus monoklonalen Pax6, Shh und Nkx2.2-all 1,10; und Kaninchen polyklonalen Ki67 1:500. In rund 150 ul pro Folie in flachen befeuchteten Kammer, mit Parafilm abdecken Austrocknen zu vermeiden und lassen Sie über Nacht bei 4 ° C.
- Waschen Sie gleitet in Waschlösung dreimal jeweils 20 min bei Raumtemperatur.
- Verdünnen Sekundärantikörper Alexa Fluor 488, 568, 350 in Waschlösungen bei 1:200 Konzentration. Verwenden Hoechst 1:3.000 oder TO-PRO-3 1:500 bis Kerne färben. In 150 ul pro Folie, lassen Sie 1 Stunde bei Raumtemperatur in feuchten Kammer vor Licht geschützt.
- Waschen Sie gleitet in Waschlösung two mal jeweils 30 Minuten bei Raumtemperatur.
- Berg rutscht in 80% ProLong Gold-anti-fade Reagenz und Ansicht innerhalb von 24 Stunden.
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Representative Results
Hier führten wir ex vivo Echtzeit-Bildgebung von einzelnen Zellteilungen im E8.5 Maus Neuroepithel. Um einzelne Zellen markieren, induziert wir Cre-Rekombinase in einer Untergruppe von Zellen, die ein Cre-Reporter Linie, die bei der Rekombination 5,6 (3A) dsRed ausgedrückt. So, 48 Stunden später waren wir in der Lage, einzelne Zellteilungen während ex-vivo-Bildgebung (4A-D) zu beobachten. Begleitend überwacht wir, wenn die markierten Zellen wurde Shh-responsive, indem ein Shh Transkriptions Reporter modifizierten BAC transgenen Olig2-eGFP Linie (3C-D; Figuren 4G-N) 1-3. Um Zilien Bildung beobachten wir erzeugt SSTR3-GFP lentivirus Embryonen in Kultur infizieren (3B; 4A-D) 4. Immunfluoreszenz wurde durchgeführt, um in vivo-Ergebnisse (4E-F) bestätigen durchgeführt.
Die Zeit-Rundene konfokale Abbildung Beobachtung der dsRedCre Reporter Embryonen exprimiert Olig2-eGFP infiziert oder mit SSTR3-GFP Lentivirus während der in vitro Kultur werden in 5 10 gezeigt. Um sicher zu sein, dass die GFP-Expression-SSTR3 wir mit den Zilien visualisieren wurden nicht stören zu Grunde liegenden biologischen Prozess, bestätigt wir unsere Live-Bilddaten mit festen Wildtyp-Embryo Abschnitte. Weil wir den gleichen Prozentsatz an Asynchronität in Zilien Bildung und Shh Antwort gefunden, zeigt es die SSTR3-GFP-Virus hatte keinen Einfluss auf diese Prozesse (Abbildung 5A).
Abbildung 1. Flussdiagramm der ex vivo Live-Bildgebungsverfahren mit der Maus Neuroepithel. Die endgültige Maus Kreuz und tamoxifen Behandlung dargestellt, gefolgt von der ganzen Maus-Embryo-Kultur-Methode. Embryonen exprimieren fluoreszierend markierten Proteine werden ausgewählt und vorbereitet für die Live-Bildgebung. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 2. Neuralrohr Scheibe Vorbereitung für Live-Aufnahmen. A) E8.5 unturned Embryo mit dem ersten Auftritt von Somitenpaare. B) Neuralrohr in vorgewärmten Medium seziert mit Hilfe eines Mikro-Messer. C) Neuralrohr Slice Bauchseite down montiert auf der Poly-L-Lysin beschichteten Glasboden Gericht. D) Kleine Menge einer Mischung aus Vaseline und Wachs um den Neuralrohrdefekten aufgebracht und sanft von einem na abgedecktRROW Stück Deckglas. Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 3. Visualisieren fluoreszent markierte Proteine in lebenden Zellen des neuronalen Rohr mit konfokaler Mikroskopie. A) DsRed Etiketten einzelnen Zellen. B) SSTR3-GFP Lentivirus in Hauptwimpern wie sie Form (gelb Pfeilspitzen) ausgedrückt. CD) E8.5 Embryos mit Olig2-GFP zeigt GFP-Expression innerhalb Neuroepithel. Bar ist 30 um (A, D), 15 um (B) und 1,5 um (C).
Abbildung 4. Überwachung Zilien Bildung und Shh Signalisierung in sich teilenden Zellen des sich entwickelnden Neuralrohr. AD) Einzelzimmer dsRed positive Zelle durchläuft Teilung zeigt eine Cilium Formen in eine Tochter Zelle vor der anderen Zelle (C, weißer Pfeil). Der Film wurde mit einer Rate von einem Frame abgebildet alle 10 min. EF) Immunfluoreszenz unter Verwendung von Antikörpern gegen RFP in grün (für dsRed Linie Tracing) und Arl13b in rot (für Zilien). Erweiterung der boxed Bereich (E), ohne Hoechst (F). GN) Die dsRed positive Zelle erfährt Teilung (IM). Die Olig2-GFP wird nur in eine Tochter (J, N) ausgedrückt. Die Aufnahme wurde mit einer Rate von einem Rahmen alle 10 min bebildert. Bar beträgt 5 um (AD), 50 um (F), 25 um (GN).
Abbildung 5. Zählen von dsRed positive Zelle mit Zilien und Shh Aussehen. A) Anzahl der Zellen, die eine Teilung dsRed und Zilien Lokalisierung. Symbol * bedeutet bei Live-Imaging Zilien Bildung war synchron. B) Anzahl der dsRed und Olig2-GFP positive Zellen, die eine Teilung und Shh-Signalisierung.
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Discussion
Unsere Ex-vivo-System ermöglicht es uns, direkt beobachten einzelne Zelle Spaltungen innerhalb der Entwicklung Neuroepithel in Echtzeit. Als Beispiel haben wir untersucht Zellteilungen im embryonalen Neuralrohrdefekten und überwacht entweder Cilium Bildung oder Shh Antwort. Wir bestätigten unsere Imaging-Ergebnisse (n = 24) waren konsistent mit den Ergebnissen aus festen Abschnitten (n = 178), die unsere Technik bietet physiologisch relevanten Daten.
Unsere Technik beruht auf Cre Induktion an eine Untergruppe von Zellen begrenzt, so dass die Dosis von Tamoxifen muss präzise. Wir arbeiteten die Dosierung für die Kennzeichnung einzelner Zellen. Wir glauben, es wäre einfach zu klein Klonen von Zellen mit einer leichten Erhöhung der Dosis auf die erste Analyse der CAGGcreER Linie, die eine dosisabhängige Reaktion auf Tamoxifen 6 zeigte Label. Darüber hinaus sind die Embryo Kulturbedingungen kritisch, abnorme Entwicklung auftritt, wenn die Bedingungen ausgeschaltet sind.Wir haben bestätigt, dass die Entwicklung in der Regel verlief unter den Bedingungen, die wir Kultur verwendet, von denen bekannt ist, für mindestens 36 Stunden 11 arbeiten.
Die induzierbare Cre und Cre Reporter Linien wir benutzen, sind öffentlich zugänglich, so leicht erhalten werden, wodurch diese Technik sehr anpassungsfähig an Forscher mit einer Vielzahl von Fragen. Die wirkliche Macht unserer Technik ist, dass bei genetisch Kennzeichnung einzelner Zellen, unser Ansatz verwendet werden, um einzelne Zelle Verhalten in den vielen bestehenden und künftigen Mutante Mauslinien verhören werden. Dies wird entscheidend sein, zu verstehen, was ist wirklich los in vielen dieser Zeilen als direkte Beobachtung der Zellen innerhalb der Säugetierembryo während der Entwicklung falsch wurde nicht umfassend untersucht. Unsere incorporaton von genetisch kodierten fluoreszierenden Reporter Helligkeit mit geringen Laserleistung erkennen bietet einen echten Vorteil für eine solche Beobachtung. Es ist leicht, fluoreszent markierte Proteine Markierung spezifischen zellulären Organellen oder anderen tr vorstellenanscriptional Reportern in der Zukunft integriert.
Wir waren in der relativen Timing der primären Zilien Bildung und Shh Reaktion in den Tochterzellen einer sich teilenden Zelle interessiert. Allerdings äußerten die transgene Linie, die uns zu Shh Reaktion überwachen aktiviert Olig2-eGFP gesamten Zytoplasma, entgegensteht uns vom Sehen der Marker der primären Zilien, SSTR3-GFP in der gleichen Zelle. So würden wir uns sehr entweder von einem nuklearen eingeschränkten Olig2-eGFP oder einem spektral unterschiedlichen fluoreszierenden Proteins SSTR3 Fusion profitiert haben.
Neben der Verwendung von gezielten und transgene Linie haben wir gezeigt, dass unsere Technik angepasst werden mittels viraler Konstrukte werden kann und dass die Infektion der Neuroepithel in Kultur liefert nützliche Daten. Dies kann hilfreich sein, um die Ermittler in die eine schnellere Methode als die Erzeugung eines genetisch veränderten Maus Linie. Darüber hinaus kann der Ansatz validieren die Erzeugung einer solchen Linie, ja argumentieren unsere Daten eine transgene Linie Ausdruck SSTR3-GFP wird von großem Nutzen, um dem Feld sein.
Unsere Methode bietet Werkzeuge, mit denen das Feld mehr unmittelbar überwachen kann das Verhalten der Zelle. Gekoppelt an die reichen Ressourcen von Mausmutanten wir erwarten, dass diese Methode als besonders leistungsfähig in der Prüfung eine Reihe von zellulären Verhaltens in situ.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Dieses Forschungsprojekt wurde von einem ARRA Supplement, 5 R01 NS056380 unterstützt. Zusätzliche Unterstützung wurde durch den viralen Vektor-Core und der Mikroskopie Kern der Emory Neuroscience NINDS Core Facilities Grant, P30NS055077 vorgesehen. Wir danken der Emory Transgene Maus und Gene Targeting-Core für die Ableitung der Maus Linie von GENSAT; Greg Pazour für die stabile SSTR3-GFP IMCD3 Zelllinie; und Bradley Yoder für den SSTR3-GFP lentiviralen Konstrukt. Monoklonale Antikörper wurden aus dem Developmental Studies Hybridoma Bank unter der Schirmherrschaft des NICHD entwickelt, erhalten und gepflegt von der University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. Alle tierischen Verfahren wurden vom IACUC und der Kommission für Biosicherheit an der Emory University genehmigt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J | Jackson Laboratory | 005438 | |
| Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd | MMRRC, | 010555-UCD | |
| CAGGCreER | Jackson Laboratory | 003724 | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| DMEM/F12 (1:1) | GIBCO | 21041-025 | |
| Newborn calf serum | Lonza | 14-416F | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Rat Serum SD male | Harlan Bioproducts | 4520 | |
| 1M Hepes | BioWhittaker | 17-737E | |
| L-Glutamine | GIBCO | 21041-025 | |
| Light mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Sstr3-GFP lentivirus | Emory Viral Core | ||
| Micro-knife, size 0.025 mm | Electron Microscopy Sciences | 62091 | |
| 35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish | MatTek | P35GC-0-10-C | |
| 100% Petroleum Jelly | Kroger | FL9958c | |
| A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope | Nikon | ||
| NIS Elements software | Nikon | ||
| Imaris 3D software | Bitplane AG | Imaris 7.2.3 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Parafolmaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffer | Lab made | ||
| Rat monoclonal anti-RFP (5F8) | Chromotek | 110411 | |
| Rabbit anti-Arl13b serum | NeuroMab | ||
| mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 | NeuroMab | ||
| Rabbit anti-Olig2 | Chemicon | AB9610 | |
| Mouse monoclonals Pax6 | Developmental Hybridoma Bank | Pax6 | |
| Mouse monoclonalsShh | Developmental Hybridoma Bank | 5E1 | |
| Mouse monoclonals Nkx2.2 | Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | |
| Rabbit polyclonal Ki67 | Abcam | AB15580 | |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 | Molecular Probes | A11031 | |
| Alexa Fluor 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| H–chst | Fisher | AC22989 | |
| TO-PRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36934 |
References
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