Summary
Здесь мы разрабатываем инструменты, необходимые для
Abstract
Мы разработали систему, которая интегрирует живых изображений флуоресцентных маркеров и культивирования эмбриональных ломтиками нейроэпителия мыши. Мы воспользовались существующими линиями мышей клетки для генетической отслеживания клонов: тамоксифен индуцируемых Cre и линии репортер экспрессирующих Cre DsRed на Cre-опосредованной рекомбинации. Используя относительно низкий уровень тамоксифен, мы были способны индуцировать рекомбинации в небольшое число клеток, что позволяет нам следовать отдельных клеточных делений. Кроме того, мы наблюдали транскрипционный ответ на Еж Соник (Тсс) сигнализации использованием Olig2-EGFP трансгенной линии 1-3 и мы провели мониторинг формирования ресничек путем заражения культурный срез с вирусом выражающие реснички маркером, Sstr3-GFP 4. Для того, чтобы изображение нейроэпителии, мы собрали эмбрионов на E8.5, изолированный нервной трубки, смонтированные нейронных ломтик в надлежащих условиях культивирования в изображения камеры и выполнена покадровой конфокальной микроскопии. Наши бывшиеестественных изображений живых метод позволяет проследить одну клеточных делений оценить относительные сроки формирования первичной реснички и Тсс ответ в физиологически соответствующие образом. Этот способ может быть легко адаптирован использованием различных флуоресцентных маркеров и обеспечивает поле инструментами для контроля поведения клеток на месте и в режиме реального времени.
Protocol
Взрослых мышей усыпляют механические смещения шейных позвонков. Все животные процедуры были одобрены IACUC и комитета по биобезопасности в университете Эмори.
1. Эмбрион поколения
- Крест тамоксифен индуцируемых Cre линии, CAGGCreER и dsRedCre репортер линии (Tg (CAG-BGEO,-DsRed * MST) 1Nagy) (рис. 1) 5,6. Для контроля относительной синхронизации Тсс ответ в дочерние клетки, поперечного и CAGGCreER DsRed соответствии с Olig2-EGFP BAC трансгенных мышей (Tg (Olig2-EGFP) EK23Gsat) (рис. 1) 7,8.
- Растворить тамоксифен в 100% этаноле, а также выполнять внутрибрюшинной инъекции 2,5 мг тамоксифена на 40 г веса тела в беременных самок в эмбриональных 6,5 (E6.5), чтобы вызвать Cre экспрессии и DsRed маркировки в небольшой части клеток.
- 48 час спустя рассекают эмбрионов, выявить положительные DsRed эмбрионов с использованием флуоресцентного микроскопа, перенесите их в чашку с культурой и наблюдаемыеэлектронной одного клеточного деления во время бывших естественных изображений (см. ниже).
2. Всего культуры эмбрионов мыши
- Рассеките E8.5 эмбрионов в предварительно нагретой среде, содержащей стирки DMEM/F12 (1:1) с добавлением 10% сыворотки новорожденного теленка и 1% пенициллина / стрептомицина (P / S) 9.
- Сразу после вскрытия, место эмбрионов на 37 ° C стадии нагревания под флуоресцентным микроскопом и определить как GFP и / или DsRed положительный (см. ниже).
- Передача до 2 эмбрионов в 500 мкл каплей, предварительно уравновешенную культуральной среде, содержащей 50% сыворотки крыс от Sprague-Dawley мужских и 50% DMEM/F12 (1:1) без фенолового красного дополнены L-глутамина и 1% 1 М HEPES в 0,85% NaCl и P / S 9.
- Наносится тонким слоем (0,1 см) уравновешенной светлых нефтепродуктов в среднесрочной для предотвращения испарения и передачи культуры блюдо с эмбрионами на 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора.
3.Вирусные инфекции
- Для того, чтобы этикетка реснички в нейроэпителии, добавляют 5-10 мкл Sstr3-GFP лентивирусов, примерно 2000000 вирионов в 500 мкл уравновешенной капли культуральной среде, содержащей E8.5 эмбрионов.
- Через 18 часов культуры, передачи инфицированной эмбриона в несколько капель Воша, чтобы смыть вирусы и подготовить нейронных кусочек трубки.
4. Нейронные Подготовка Slice труб для живых изображений
- Рассеките нервной трубки из E8.5 эмбрионов в предварительно нагретом стирки среды с использованием микро-нож размером 0,025 мм, на 1% агара покрытием чашке.
- Поместите изолированной нервной трубки вентральной стороной вниз в 150 мкл каплю уравновешенной культуральной среде без фенола красного на 35 мм поли-L-лизин покрытием блюдо со стеклянным дном.
- Положите небольшое количество смеси 1:1 изготовлены из 100% чистого вазелина и расплавленный воск свечи (свечи от IKEA) вокруг нервной трубки установлены, и плавно нажмите узким кусок стекла покровные для того, чтобыиммобилизации образца.
- Накройте блюдо с тонким слоем (~ 0,1 см) уравновешенной светлых нефтепродуктов (рис. 2).
5. Живая съемка и покадровой конфокальной микроскопии
- Место блюдо под Nikon A1R лазерной сканирующей конфокальной Перевернутый Микроскоп оснащен климатической камеры, регулирующий температуру, установить до 37 ° С и 5% СО 2.
- Используйте 60x нефтью погружения цели записывать GFP помечены ресничек и DsRed положительных клеток, в то время как 40-кратный нефтью погружения цели использовать для мониторинга Olig2-GFP и DsRed положительных клеток.
- Открытое программное обеспечение NIS Elements, чтобы установить максимально допустимое время условия покадровой съемки. Каждые 10 мин приобретать г-стеки до 25 мкм с шагом 1,5 мкм (40x цель) и до 8 мкм с шагом 0,4 мкм (60x цель). Использование 488 и 561 нм длин волн возбуждения и передаваемый канал, если необходимо. Получение изображений в 512 х 512 размер. Настройка нескольких пользовательских регионах ИНТересть одновременно выполнять запись.
Оптимальная экспозиция для питания лазера и яркость изображения была скорректирована за счет использования низкой интенсивности лазера (до 11% для mCherry 561, до 4,5% EGFP 405/488), скорость сканирования 1, строка 2 средних и размер отверстия штыря (61 мкм для DsRed; 28,1 мкм для Olig2; 72 мкм для SSTR3GFP; 61,3 мкм для DsRed и SSTR3GFP; 58 мкм для DsRed и Olig2). Использование генетически кодируемых флуоресцентные журналистам позволило выявить яркость с низким энергопотреблением лазера. - Анализ записанных данных с помощью 3D-реконструкции Imaris программного обеспечения.
6. Иммунофлюоресценция
- Исправить эмбрионов или изолированных труб в нейронных 4% параформальдегиде / 0,1 М фосфатного буфера на льду (4 ° С) в течение 1 часа в стеклянной посуде.
- Вымойте образцов 2 ч в PBS на льду (4 ° С) (изменить PBS несколько раз) и положить в 30% сахарозы / 0,1 М фосфатного буфера в течение ночи или до раковины эмбрионов.
- Вставить в ОСТ, замораживание на сухом льду и хранят в -80 ° С. Perform срезов на криостат (10 мм).
- Мытье слайдов в течение 10 мин в промывном растворе, содержащем 1% инактивированной нагреванием сыворотки овец и 0,1% Тритон Х-100 в PBS.
- Развести первичных антител в промывочного раствора в следующих концентрациях: крысиных моноклональных анти-RFP (5F8,) 1:200; Кролик анти-Arl13b сыворотки 1:1500 и моноклональных антител мыши Arl13b 1:5 (295B/54); Кролик анти-Olig2 1:300; мышиных моноклональных антител Рах6, тсс и все-Nkx2.2 1:10, и кроличьи поликлональные Ki67 1:500. Добавить около 150 мкл на слайде в плоских влажной камере, залить парафином, чтобы избежать высыхания и оставить на ночь при 4 ° C.
- Мытье слайдов в промывочный раствор три раза, 20 мин каждый раз при комнатной температуре.
- Развести вторичными антителами Alexa Fluor 488, 568, 350 в моющих растворов в концентрации 1:200. Используйте Hoechst 1:3000 или TO-PRO-3 1:500 для окрашивания ядер. Добавить 150 мкл на слайде, оставьте 1 часа при комнатной температуре во влажной камере защищенном от света месте.
- Вымойте слайдов в промывочного раствора TWо раз, 30 мин каждый раз при комнатной температуре.
- Горы скользит в 80% продлить Золотая анти-исчезать реагента и вида в пределах 24 часов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы провели бывших естественных живых изображений одного клеточного деления в E8.5 нейроэпителия мыши. Маркировать отдельные клетки, мы индуцированных Cre рекомбиназу в субпопуляции клеток, содержащих линии Cre репортера, которые выразили DsRed при рекомбинации 5,6 (рис. 3А). Таким образом, 48 часов спустя мы могли наблюдать одну клеточных делений во время бывшие естественных изображений (рис. 4A-D). Одновременно мы провели мониторинг, когда меченые клетки стали ШХ-отзывчивым, включив Тсс транскрипционные репортер изменение BAC трансгенных Olig2-EGFP линии (рис. 3C-D; Цифры 4G-N) 1-3. Для наблюдения реснички образование мы получили Sstr3-GFP лентивирус заразить эмбрионов в культуре (рис. 3В, 4А-D) 4. Иммунофлуоресценции проводили для подтверждения результатов в естественных условиях (фиг. 4E-F).
Время-круговэлектронной конфокальной микроскопии наблюдение dsRedCre эмбрионов репортер выразил Olig2-EGFP или инфицированных Sstr3-GFP лентивирус в процессе культивирования пробирке показали на рисунке 5 10. Для того, чтобы быть уверенным, что Sstr3-GFP выражения мы использовали для визуализации реснички не мешала любой основной биологический процесс, мы подтвердили наши данные в реальном времени изображения с фиксированным дикого типа разделов эмбриона. Потому что мы нашли такой же процент асинхронности в формировании ресничек и Тсс ответ, это означает, SSTR3-GFP вирус не повлияли эти процессы (рис. 5а).
Рисунок 1. Схема экс естественных условиях живой процедура визуализации с использованием мыши нейроэпителия. Окончательный крест и мыши tamoxiфенов лечения изображены сопровождаемые всей метод культивирования эмбрионов мыши. Эмбрионы выразив флуоресцентной меченных белков выбраны и подготовлены для живого изображения. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 2. Нейронные подготовки срез трубки для живого изображения.) E8.5 эмбрионов на камне с первым появлением сомита пар. Б) нервной трубки расчлененные в предварительно нагретой среде с помощью микро-нож. C) нейронных кусочек трубы монтируется вентральной стороной вниз на поли-L-лизином блюдо стеклянным дном. D) малого количества смеси из вазелин и воск применяется вокруг нервной трубки и осторожно покрыта паrrow кусок стекла покровное. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 3. Визуализация флуоресцентной меченных белков в живых клетках нервной трубки с конфокальной микроскопии.) DsRed этикетках отдельных ячеек. B) SSTR3-GFP лентивирус выраженное в первичные реснички, как они форму (желтые стрелки). CD) E8.5 эмбрионов проведения Olig2-GFP показывает GFP выражение в нейроэпителия. Бар составляет 30 мкм (A, D), 15 мкм (Б) и 1,5 мкм (С).
Рисунок 4. Мониторинг формирования ресничек и Тсс сигнализации в делящихся клетках развивающейся нервной трубки. Н.э.) Одноместный DsRed позитивных клеток проходит разделение показывает реснички форм в одной дочерней клетки до другой клетки (С, белая стрелка). Фильм удалось сфотографировать в размере одного кадра каждые 10 мин. EF) иммунофлуоресценции с использованием антител против RFP в зеленый (для DsRed отслеживания клонов) и Arl13b в красном (ресничек). Расширение области коробку (E), без Hoechst (F). GN) DsRed положительные клетка претерпевает деление (IM). Olig2-GFP выражается только одна дочь (J, N). Запись была отображаемого в размере одного кадра каждые 10 мин. Бар 5 мкм (AD), 50 мкм (F), 25 мкм (GN).
Рисунок 5. Подсчет DsRed положительные клетки с ресничками и Тсс внешний вид.) Количество DsRed клеток, подвергающихся разделения ресничек и локализации. Символ * означает, живыми изображениями формирования ресничек было синхронным. Б) количество и DsRed Olig2 GFP-положительных клеток, подвергающихся разделения и Тсс сигнализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наши бывшие естественных условиях система дает нам возможность непосредственно наблюдать одну клеточных делений в развивающемся нейроэпителия в реальном времени. В качестве примера мы рассмотрели клеточные деления в мышиных эмбриональных нервной трубки и контролируется либо реснички образование или Тсс ответа. Мы подтвердили наши результаты визуализации (N = 24) согласуются с результатами от фиксированных секций (N = 178), указывающий наша техника обеспечивает физиологически соответствующих данных.
Наша методика основана на индукции Cre ограничиваясь подмножество ячеек, так что доза тамоксифена должно быть точным. Мы разработали дозирования для маркировки отдельных клеток. Мы считаем, что это будет легко для обозначения небольших клонов клеток с небольшим увеличением дозы на основе первоначального анализа линии CAGGcreER, который показал зависимость реакции от дозы тамоксифена в 6. Кроме того, условия культивирования эмбрионов имеют решающее значение, так как неправильное развитие происходит, если условия не горят.Мы подтвердили, что развитие шло нормально при условиях культивирования мы использовали, который, как известно, работает, по крайней мере 36 часа 11.
Индуцибельным Cre Cre и репортер линий мы используем общедоступные поэтому могут быть легко получены делает эта техника вполне применима для исследователей с различными вопросами. Настоящая сила нашей техники является то, что у генетически маркировки отдельных клеток, наш подход может быть использован для опроса одного поведение ячейки в многих существующих и будущих мутантных линий мышей. Это будет иметь решающее значение в понимании того, что действительно происходит не так во многих из этих линий, как непосредственное наблюдение клеток внутри эмбриона млекопитающих в процессе разработки широко не рассмотрены. Наши incorporaton генетически кодируемых флуоресцентные журналистам обнаружить яркость с низким энергопотреблением лазер обеспечивает реальные преимущества для таких наблюдений. Легко представить себе, флуоресцентной маркировки метками белков специфических клеточных органелл или других TRanscriptional журналистам интеграции в будущем.
Мы были заинтересованы в относительной синхронизации формирования первичной реснички и Тсс ответ в дочерние клетки делящейся клетки. Тем не менее, трансгенной линии, что позволило нам контролировать Тсс ответ выразил Olig2-EGFP по всей цитоплазме, исключающих нам видеть маркер первичная ресничка, Sstr3-GFP в одной камере. Таким образом, мы бы принесли большую пользу либо ограниченного ядерного Olig2-EGFP или спектрально различных Sstr3 люминесцентные слитого белка.
В дополнение к использованию целевых и трансгенные линии, мы показали, что наша методика может быть адаптирована с использованием вирусных конструкций и что заражение нейроэпителии в культуре предоставляет полезные данные. Это будет полезно для исследователей в обеспечении более быстрого метода, чем поколение генетически модифицированных мышей линии. Кроме того, этот подход может проверить генерации таких линии, более того, наши данные утверждают, трансгенного выражения линии Sstr3-GFP будет весьма полезным для области.
Наш метод предоставляет инструменты, с которой поле может более непосредственно контролировать поведение клеток. В сочетании с богатыми ресурсами мыши мутантов мы ожидаем, что этот метод был особенно мощным в изучении клеточного массива поведения на месте.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Этот исследовательский проект был поддержан Дополнение ARRA, 5 R01 NS056380. Дополнительная поддержка была оказана в рамках основной вирусный вектор и микроскопии Ядро Эмори Neuroscience NINDS Основные средства гранта, P30NS055077. Мы благодарим Эмори трансгенных мышей и генного таргетинга для получения основной линии мышей от GENSAT; Грег Pazour для стабильного SSTR3-GFP IMCD3 клеточной линии, и Брэдли Yoder для Sstr3-GFP лентивирусный построить. Моноклональные антитела были получены из исследований развития гибридом банка, разработанный под эгидой NICHD, и поддерживается Университет Айовы, Отделение биологических наук, Iowa City, IA 52242. Все животные процедуры были одобрены IACUC и комитета по биобезопасности в университете Эмори.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J | Jackson Laboratory | 005438 | |
| Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd | MMRRC, | 010555-UCD | |
| CAGGCreER | Jackson Laboratory | 003724 | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| DMEM/F12 (1:1) | GIBCO | 21041-025 | |
| Newborn calf serum | Lonza | 14-416F | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Rat Serum SD male | Harlan Bioproducts | 4520 | |
| 1M Hepes | BioWhittaker | 17-737E | |
| L-Glutamine | GIBCO | 21041-025 | |
| Light mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Sstr3-GFP lentivirus | Emory Viral Core | ||
| Micro-knife, size 0.025 mm | Electron Microscopy Sciences | 62091 | |
| 35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish | MatTek | P35GC-0-10-C | |
| 100% Petroleum Jelly | Kroger | FL9958c | |
| A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope | Nikon | ||
| NIS Elements software | Nikon | ||
| Imaris 3D software | Bitplane AG | Imaris 7.2.3 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Parafolmaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffer | Lab made | ||
| Rat monoclonal anti-RFP (5F8) | Chromotek | 110411 | |
| Rabbit anti-Arl13b serum | NeuroMab | ||
| mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 | NeuroMab | ||
| Rabbit anti-Olig2 | Chemicon | AB9610 | |
| Mouse monoclonals Pax6 | Developmental Hybridoma Bank | Pax6 | |
| Mouse monoclonalsShh | Developmental Hybridoma Bank | 5E1 | |
| Mouse monoclonals Nkx2.2 | Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | |
| Rabbit polyclonal Ki67 | Abcam | AB15580 | |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 | Molecular Probes | A11031 | |
| Alexa Fluor 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| H–chst | Fisher | AC22989 | |
| TO-PRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36934 |
References
- Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the neural tube: motor neuron induction by diffusible factors from notochord and floor plate. Cell. 73, 673-686 (1993).
- Ericson, J., Muhr, J., Placzek, M., Lints, T., Jessell, T. M., Edlund, T. Sonic hedgehog induces the differentiation of ventral forebrain neurons: A common signal for ventral patterning within the neural tube. Cell. 81, 747-756 (1995).
- Briscoe, J. A. Homeodomain Protein Code Specifies Progenitor Cell Identity and Neuronal Fate in the Ventral Neural Tube. Cell. 101, 435-445 (2000).
- Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol. Biol. Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).
- Vintersten, K. Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals. Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).
- Hayashi, S., McMahon, A. P. Efficient recombination in diverse tissue by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse. Dev. Biol. 244 (2), 305-318 (2002).
- Gong, S., Zheng, C., Doughty, M. L., Losos, K., Didkovsky, N., Schambra, U. B., Nowak, N. J., Joyner, A., Leblanc, G., Hatten, M. E., Heintz, N. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
- Mukouyama, Y. S., Deneen, B., Lukaszewicz, A., Novitch, B. G., Wichterle, H., Jessell, T. M., Anderson, D. J. Olig2+ neuroepithelial motoneuron progenitors are not multipotent stem cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1551-1556 (2006).
- Jones, E. A. V., Crotty, D., Kulesa, P. M., Waters, C. W., Baron, M. H., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture. Genesis. 34, 228-235 (2002).
- Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. Live imaging of individual cell divisions in mouse neuroepithelium shows asymmetry in cilium formation and Sonic hedgehog response. Cilia. 1 (6), In Press (2012).
- Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. -K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods in Enzymology. 476, 351-377 (2010).
