Summary
Hier ontwikkelen we de instrumenten die nodig zijn voor de
Abstract
We ontwikkelden een systeem dat levende beeldvorming van fluorescente markers en het kweken plakjes embryonale muis neuroepithelium integreert. We hebben gebruik gemaakt van de bestaande muis lijnen voor genetische cell lineage tracing: een tamoxifen-induceerbare Cre lijn en een Cre reporter lijn expressie DsRed bij Cre-gemedieerde recombinatie. Door het gebruik van een relatief laag niveau van tamoxifen, waren we in staat om recombinatie te induceren in een klein aantal cellen, waardoor ons toe om individuele divisies cel volgen. Daarnaast zagen we de transcriptionele respons op Sonic Hedgehog (Shh) signalering met behulp van een Olig2-eGFP transgene lijn 1-3 en we gecontroleerd vorming van cilia door de gekweekte slice met virus dat de trilharen marker, Sstr3-GFP 4 infecteren. Om het imago van de neuro-epitheel, we geoogst embryo's in E8.5, geïsoleerd van de neurale buis, bevestigd de neurale schijfje in de juiste kweekomstandigheden in de beeldvorming kamer en deed time-lapse confocale beeldvorming. Onze exvivo live-imaging methode stelt ons in staat om enkele celdelingen traceren om de relatieve timing van primaire cilia vorming en Shh reactie in een fysiologisch relevante wijze kan worden gemeten. Deze methode kan eenvoudig worden aangepast met behulp van verschillende fluorescente markers en geeft het veld de instrumenten waarmee naar cel gedrag in situ en in real time te volgen.
Protocol
Volwassen muizen geëuthanaseerd mechanisch cervicale dislocatie. Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de IACUC en het Biosafety Comite aan de Emory University.
1. Embryo Generation
- Cross tamoxifen-induceerbare Cre lijn, CAGGCreER en dsRedCre reporter lijn (Tg (CAG-Bgeo,-DsRed * MST) 1Nagy) (Figuur 1) 5,6. Voor het bewaken van de relatieve timing van Shh respons in de dochtercellen, kruis CAGGCreER en DsRed lijn met de Olig2-eGFP BAC transgene muizen (Tg (Olig2-EGFP) EK23Gsat) (Figuur 1) 7,8.
- Ontbinden tamoxifen in 100% ethanol, en het uitvoeren van intraperitoneale injectie van 2,5 mg tamoxifen per 40 g lichaamsgewicht in zwangere vrouwtjes bij embryonale 6.5 (E6.5) naar Cre expressie en DsRed etikettering in een klein deel van de cellen te induceren.
- 48 uur later ontleden embryo's, identificeren DsRed positieve embryo's met behulp van de fluorescentie microscoop, overbrengen naar de cultuur schotel en waarneembaree enkele celdelingen tijdens ex vivo beeldvorming (zie hieronder).
2. Hele Mouse Embryo Cultuur
- Ontleden E8.5 embryo in voorverwarmde wasmedium met DMEM/F12 (1:1) aangevuld met 10% serum van pasgeboren kalveren en 1% penicilline / streptomycine (P / S) 9.
- Direct na sectie embryo plaats op 37 ° C verwarmingsstap onder de fluorescentiemicroscoop en identificeren als GFP en / of DsRed positief (zie hieronder).
- Overdracht tot 2 embryo's in een 500 ul druppel vooraf geëquilibreerd kweekmedium bevattende 50% serum van een rat Sprague-Dawley mannelijke en 50% DMEM/F12 (1:1) zonder fenolrood, aangevuld met L-glutamine en 1% 1 M HEPES in 0,85% NaCl en P / S 9.
- Breng een dun laagje (0,1 cm) van evenwicht lichte minerale olie op de middellange tot verdamping te voorkomen en de overdracht van de cultuur schotel met de embryo's om de 37 ° C, 5% CO 2 incubator.
3.Virale infectie
- Om label trilharen in de neuro-epitheel, voeg 5-10 ul van Sstr3-GFP lentivirus, circa 2 miljoen virusdeeltjes, een 500 pi evenwicht druppel kweekmedium met een E8.5 embryo.
- Na 18 uur van de cultuur, de overdracht geïnfecteerde embryo in verschillende druppels wasmedium te spoelen het virus en bereiden neurale buis slice.
4. Neurale buis Slice Voorbereiding voor Live Imaging
- Ontleden neurale buis van het E8.5 embryo in voorverwarmde wasmedium met een micro-mes size 0.025 mm, op een 1% agar gecoate schaal.
- Plaats de geïsoleerde neurale buis ventrale kant naar beneden in een 150 ul druppel evenwicht gebracht kweekmedium zonder fenol rood op de 35 mm poly-L-lysine gecoat glas onderste schaal.
- Zet kleine hoeveelheden van een 1:1 mengsel gemaakt van 100% pure vaseline en gesmolten kaarsvet (kaars van IKEA) rond de gemonteerde neurale buis, en zachtjes druk door een smal stuk glas dekglaasje omimmobiliseren van het monster.
- Bedek de schaal met een dunne laag (-0,1 cm) geëquilibreerd lichte minerale olie (figuur 2).
5. Wonen Imaging en Time-lapse confocale microscopie
- Plaats schotel onder de Nikon A1R laser scanning confocale microscoop Omgekeerde uitgerust met een klimaatkamer die temperatuur regelt, ingesteld op 37 ° C en 5% CO 2.
- Gebruik 60x olie-immersie objectief om GFP gelabelde cilia en DsRed positieve cellen op te nemen, terwijl de 40x olie-immersie objectief gebruiken om toezicht te houden Olig2-GFP en DsRed positieve cellen.
- Open de NOS Elements-software voor het opzetten van time-lapse imaging voorwaarden. Elke 10 min verwerven z-stapels tot 25 pm met een afstand van 1,5 urn (40x objectief) en tot 8 pm met een afstand van 0,4 urn (60x objectief). Gebruik 488 en 561 nm de excitatiegolflengten en verzonden kanaal indien nodig. Acquire beelden in 512 x 512 formaat. Instellen van meerdere door de gebruiker gedefinieerde gebieden van interest om gelijktijdig de opname uit te voeren.
Optimale blootstelling aan laservermogen en de helderheid van het beeld werd aangepast door gebruik lage laserintensiteit (tot 11% voor mCherry 561; maximaal 4,5% EGFP 405/488), scansnelheid 1, lijn 2 en de gemiddelde grootte van de pin hole (61 um voor DsRed; 28,1 micrometer voor Olig2; 72 micrometer voor SSTR3GFP; 61,3 micrometer voor DsRed en SSTR3GFP; 58 micrometer voor DsRed en Olig2). Het gebruik van genetisch gecodeerde fluorescerende reporters ons in staat om de helderheid aan te sporen met een laag laservermogen. - Analyseer geregistreerde gegevens met behulp Imaris 3D reconstructie software.
6. Immunofluorescentie
- Fix embryo of geïsoleerde neurale buizen in 4% paraformaldehyde / 0,1 M fosfaatbuffer op ijs (4 ° C) gedurende 1 uur in een glazen schaal.
- Wassen monsters 2 uur in PBS op ijs (4 ° C) (verandering PBS een paar keer) en in 30% sucrose / 0,1 M fosfaatbuffer in de nacht of tot embryo wastafel.
- Insluiten in oktober, bevriezing van droog ijs en op te slaan in -80 ° C. Perform snijden op cryostaat (10 mm).
- Wassen dia's voor 10 minuten in wasoplossing bevattende 1% hitte-geïnactiveerd serum schapen en 0,1% Triton X-100 in PBS.
- Verdunnen primaire antilichamen in wasoplossing bij volgende concentraties: Rat monoklonale anti-RFP (5F8,) 1:200; Rabbit anti-Arl13b serum 1:1500 en muis monoklonale anti-Arl13b 01:05 (295B/54); Rabbit anti-Olig2 1:300; Mouse monoklonalen PAX6, Shh en Nkx2.2-al 01:10, en Konijn polyclonaal Ki67 1:500. Voeg ongeveer 150 ul per dia in platte vochtige kamer, dek af met parafilm om te voorkomen uitdroging en laat over de nacht bij 4 ° C.
- Wassen dia in wasoplossing driemaal 20 min elke keer bij kamertemperatuur.
- Verdunnen secundaire antilichamen Alexa Fluor 488, 568, 350 in wassoppen bij 1:200 concentratie. Gebruik Hoechst 1:3000 of TO-PRO-3 1:500 tot kernen vlek. Voeg 150 ul per slide, laat 1 uur bij kamertemperatuur in vochtige kamer beschermd tegen licht.
- Was de dia's in wasoplossing two tijden, 30 min elke keer bij kamertemperatuur.
- Mount dia's in 80% ProLong Gold anti-fade reagens en uitzicht binnen 24 uur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier voerden we ex vivo live-beeldvorming van enkele cel verdeeldheid binnen de E8.5 muis neuroepithelium. Om individuele cellen te labelen, we geïnduceerde Cre recombinase in een subset van cellen met een Cre reporter lijn die uitgedrukt DsRed na recombinatie 5,6 (figuur 3A). Zo, 48 uur later waren we in staat om enkele celdelingen tijdens ex vivo beeldvorming (Figuren 4A-D) te observeren. Gelijktijdig, we gecontroleerd wanneer de gelabelde cellen werd Shh-responsieve door het opnemen van een Shh transcriptionele reporter bewerkt BAC transgene Olig2-eGFP lijn (Figuren 3C-D; Figuren 4G-N) 1-3. Tot vorming cilia zien we gegenereerd Sstr3-GFP lentivirus om embryo's in de cultuur besmetten (Figuur 3B; figuren 4A-D) 4. Immunofluorescentie werd uitgevoerd om na in vivo resultaten (Figuren 4E-F).
De tijd-rondene confocale beeldvorming observatie van de dsRedCre reporter embryo uitdrukken Olig2-eGFP of tijdens de in vitro kweek geïnfecteerd met Sstr3-GFP lentivirus worden getoond in Figuur 5 10. Om zeker te zijn dat de Sstr3-GFP expressie die we gebruikten om cilia visualiseren was niet bemoeien met eventuele onderliggende biologisch proces, bevestigd we onze live-imaging data met vaste wild-type embryo secties. Omdat we vonden hetzelfde percentage van asynchronie in cilia vorming en Shh reactie, het geeft de SSTR3-GFP virus niet deze processen (figuur 5A) beïnvloeden.
Figuur 1. Stroomschema van de ex vivo levende beeldvorming procedure met behulp van de muis neuroepithelium. De laatste muis kruis en tamoxifen behandeling zijn afgebeeld, gevolgd door de gehele muis embryo kweekmethode. Embryo uitdrukken fluorescent gelabelde eiwitten worden geselecteerd en voorbereid voor live-imaging. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Neurale buis slice voorbereiding voor live-imaging. A) E8.5 unturned embryo met de eerste verschijning van somiet paren. B) Neurale buis ontleed in voorverwarmde medium met behulp van een micro-mes. C) Neurale buis slice is beneden gemonteerd ventrale zijde op de poly-L-lysine beklede glazen onderste schaal. D) kleine hoeveelheid van een mengsel bestaande uit vaseline en was aangebracht rond de neurale buis en voorzichtig onder een naRROW stuk glas dekglaasje. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Visualiseren fluorescent gemerkte eiwitten in levende cellen van de neurale buis met confocale microscopie. A) DsRed labels individuele cellen. B) SSTR3-GFP lentivirus uitgedrukt in primaire cilia zij vorm (geel pijlpunten). CD) E8.5 embryo die Olig2-GFP toont GFP expressie binnen neuroepithelium. Bar is 30 urn (A, D), 15 urn (B) en 1,5 urn (C).
Figuur 4. Monitoring cilia vorming en Shh signalering in delende cellen van de zich ontwikkelende neurale buis. AD) Single DsRed positieve cel ondergaat divisie toont een cilium vormen in een dochter cel voorafgaand aan de andere cel (C, witte pijl). De film werd in beeld gebracht met een snelheid van een frame om de 10 minuten. EF) Immuunfluorescentie behulp van antilichamen tegen RFP in groen (voor DsRed lineage tracing) en Arl13b in het rood (voor cilia). Uitbreiding van boxed gebied (E), zonder Hoechst (F). GN) De DsRed positieve cel ondergaat divisie (IM). De Olig2-GFP wordt uitgedrukt in slechts een dochter (J, N). De opname werd afgebeeld met een snelheid van een frame per 10 minuten. Bar is 5 micrometer (AD), 50 pm (F), 25 pm (GN).
Figuur 5. Het tellen van DsRed positieve cel met trilhaartjes en Shh uitstraling. A) Aantal DsRed cellen ondergaan divisie en trilharen lokalisatie. Symbool * betekent door live-imaging trilharen formatie was synchroon. B) Aantal DsRed en Olig2-GFP-positieve cellen ondergaan divisie en Shh signalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onze ex vivo systeem stelt ons in staat om direct waar te nemen enkele cel verdeeldheid binnen de ontwikkeling neuroepithelium in real time. Als voorbeeld nemen we onderzocht celdelingen in de muis embryonale neurale buis en bewaakt ofwel cilium vorming of Shh respons. We bevestigden onze beeldvorming resultaten (n = 24) waren in overeenstemming met de resultaten uit vaste rubrieken (n = 178) met vermelding van onze techniek biedt fysiologisch relevante gegevens.
De techniek is gebaseerd op inductie Cre beperkt tot een subset van cellen, zodat de dosering van tamoxifen nauwkeurig zijn. Wij hebben gewerkt en de dosering voor het labelen van enkele cellen. Wij geloven dat het eenvoudig is om kleine klonen van cellen labelen met een lichte verhoging van de dosering op basis van de eerste analyse van de CAGGcreER lijn, die een dosis afhankelijke respons op tamoxifen 6 toonde. Bovendien, de embryo kweekomstandigheden zijn cruciaal omdat abnormale ontwikkeling plaatsvindt als de omstandigheden af.We bevestigden dat de ontwikkeling normaal verlopen onder de kweekomstandigheden we gebruiken, waarvan bekend is dat werk voor ten minste 36 uur 11.
De induceerbare Cre en Cre reporter lijnen we zijn publiekelijk beschikbaar dus gemakkelijk worden verkregen maken deze techniek zeer aanpasbaar onderzoekers met verschillende vragen. De echte kracht van onze techniek is dat genetisch labelen van enkele cellen, onze benadering kan worden gebruikt om cel gedrag in de vele bestaande en toekomstige mutant muislijnen ondervragen. Dit is essentieel om te begrijpen wat er werkelijk mis gaat in veel van deze lijnen als directe waarneming van cellen binnen de zoogdieren embryo tijdens de ontwikkeling is niet uitgebreid onderzocht. Onze incorporaton van genetisch gecodeerde fluorescerende reporters om helderheid te detecteren met een laag laservermogen biedt een groot voordeel voor een dergelijke observatie. Het is gemakkelijk om fluorescent gemerkte eiwitten markering specifieke cellulaire organellen of andere tr voorstellenanscriptional verslaggevers worden geïntegreerd in de toekomst.
We waren geïnteresseerd in de relatieve timing van de primaire cilium vorming en Shh reactie in de dochtercellen van een delende cel. Echter, de transgene lijn die ons in staat om Shh respons op te volgen uitgedrukt Olig2-eGFP gehele cytoplasma, ons verzet tegen het zien van de markering van de primaire cilium, Sstr3-GFP in dezelfde cel. Zo zouden we veel hebben geprofiteerd van zowel een nucleair beperkte Olig2-eGFP of een spectraal duidelijke Sstr3 fluorescerend eiwit fusie.
Naast het gebruik van gerichte en transgene lijn werd aangetoond dat onze techniek kan worden aangepast met behulp van virale constructen en infecteren van de neuro-epitheel in kweek verschaft nuttige data. Dit zal nuttig zijn om onderzoekers te zijn bij het verstrekken van een snellere methode dan de generatie van een genetisch gemodificeerde muis lijn. Bovendien kan de benadering van de vorming van dergelijke lijn valideren, inderdaad, de gegevens betogen een transgenic lijn uiten Sstr3-GFP zal van groot nut voor het gebied.
Onze methode biedt hulpmiddelen waarmee het veld kan meer direct monitoren cel gedrag. Gekoppeld aan de rijke bronnen van muismutanten verwachten we dat deze methode om vooral krachtig te zijn in de behandeling van een reeks van cellulaire gedrag in situ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door een ARRA Supplement, 5 R01 NS056380. Extra steun werd verleend via de virale vector Core en de Microscopie Kern van de Emory Neuroscience NINDS Core Facilities subsidie, P30NS055077. Wij danken de Emory Transgene muis en gene targeting Core voor het afleiden van de muis lijn van GENSAT; Greg Pazour voor de stabiele SSTR3-GFP IMCD3 cellijn, en Bradley Yoder voor de Sstr3-GFP lentivirale construct. Monoklonale antilichamen werden verkregen van de Developmental Studies Hybridoma Bank, ontwikkeld onder auspiciën van de NICHD, en onderhouden door de Universiteit van Iowa, Afdeling Biologische Wetenschappen, Iowa City, IA 52242. Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de IACUC en het Biosafety Comite aan de Emory University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J | Jackson Laboratory | 005438 | |
| Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd | MMRRC, | 010555-UCD | |
| CAGGCreER | Jackson Laboratory | 003724 | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| DMEM/F12 (1:1) | GIBCO | 21041-025 | |
| Newborn calf serum | Lonza | 14-416F | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Rat Serum SD male | Harlan Bioproducts | 4520 | |
| 1M Hepes | BioWhittaker | 17-737E | |
| L-Glutamine | GIBCO | 21041-025 | |
| Light mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Sstr3-GFP lentivirus | Emory Viral Core | ||
| Micro-knife, size 0.025 mm | Electron Microscopy Sciences | 62091 | |
| 35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish | MatTek | P35GC-0-10-C | |
| 100% Petroleum Jelly | Kroger | FL9958c | |
| A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope | Nikon | ||
| NIS Elements software | Nikon | ||
| Imaris 3D software | Bitplane AG | Imaris 7.2.3 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Parafolmaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffer | Lab made | ||
| Rat monoclonal anti-RFP (5F8) | Chromotek | 110411 | |
| Rabbit anti-Arl13b serum | NeuroMab | ||
| mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 | NeuroMab | ||
| Rabbit anti-Olig2 | Chemicon | AB9610 | |
| Mouse monoclonals Pax6 | Developmental Hybridoma Bank | Pax6 | |
| Mouse monoclonalsShh | Developmental Hybridoma Bank | 5E1 | |
| Mouse monoclonals Nkx2.2 | Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | |
| Rabbit polyclonal Ki67 | Abcam | AB15580 | |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 | Molecular Probes | A11031 | |
| Alexa Fluor 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| H–chst | Fisher | AC22989 | |
| TO-PRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36934 |
References
- Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the neural tube: motor neuron induction by diffusible factors from notochord and floor plate. Cell. 73, 673-686 (1993).
- Ericson, J., Muhr, J., Placzek, M., Lints, T., Jessell, T. M., Edlund, T. Sonic hedgehog induces the differentiation of ventral forebrain neurons: A common signal for ventral patterning within the neural tube. Cell. 81, 747-756 (1995).
- Briscoe, J. A. Homeodomain Protein Code Specifies Progenitor Cell Identity and Neuronal Fate in the Ventral Neural Tube. Cell. 101, 435-445 (2000).
- Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol. Biol. Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).
- Vintersten, K. Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals. Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).
- Hayashi, S., McMahon, A. P. Efficient recombination in diverse tissue by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse. Dev. Biol. 244 (2), 305-318 (2002).
- Gong, S., Zheng, C., Doughty, M. L., Losos, K., Didkovsky, N., Schambra, U. B., Nowak, N. J., Joyner, A., Leblanc, G., Hatten, M. E., Heintz, N. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
- Mukouyama, Y. S., Deneen, B., Lukaszewicz, A., Novitch, B. G., Wichterle, H., Jessell, T. M., Anderson, D. J. Olig2+ neuroepithelial motoneuron progenitors are not multipotent stem cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1551-1556 (2006).
- Jones, E. A. V., Crotty, D., Kulesa, P. M., Waters, C. W., Baron, M. H., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture. Genesis. 34, 228-235 (2002).
- Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. Live imaging of individual cell divisions in mouse neuroepithelium shows asymmetry in cilium formation and Sonic hedgehog response. Cilia. 1 (6), In Press (2012).
- Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. -K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods in Enzymology. 476, 351-377 (2010).
