Summary
כאן אנו מפתחים את הכלים הדרושים ל
Abstract
פיתחנו מערכת המשלבת הדמיה חיה של סמני ניאון ופרוסות של culturing neuroepithelium עכבר העוברי. אנחנו ניצל את קווי עכבר קיים לתא גנטי שושלת התחקות: קו Cre טמוקסיפן מושרה וקו כתב Cre מביע DsRed על רקומבינציה Cre בתיווך. על ידי שימוש ברמה נמוכה יחסית של טמוקסיפן, היינו יכול לגרום לרקומבינציה במספר קטן של תאים, המאפשר לנו לעקוב חלוקות תא בודדות. בנוסף, צפו את תגובת תעתיק לקיפוד איתות קולי (ששש) באמצעות Olig2-eGFP מהונדס קו 1-3 ואנחנו במעקב היווצרות של ריסים על ידי הדבקת הפרוסה התרבותית בווירוס המבטאת את סמן הריסים, Sstr3-GFP 4. כדי תמונת neuroepithelium מסקנו עוברים בE8.5, בודד את הצינור העצבי,, רכוב על הפרוסה העצבית בתנאי culturing נכונים לתוך חדר ההדמיה וביצע הדמיה confocal זמן לשגות. האקס שלנושיטת ההדמיה vivo החי מאפשרת לנו לעקוב אחר חלוקות תא בודדות כדי להעריך את התזמון היחסי של היווצרות ראשונית ריסים ותגובה ששש באופן רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. ניתן להתאים שיטה זו בקלות באמצעות סמני ניאון ברורים ומספקת בתחום הכלים שבם כדי לפקח על התנהגות תא באתר ובזמן אמת.
Protocol
עכברים בוגרים מורדמים על ידי נקע בצוואר רחם מכאני. נהלי כל החיה שאושר על ידי ועדת IACUC והבטיחות הביולוגית באוניברסיטת אמורי.
1. דור עובר
- קרוס טמוקסיפן מושרה Cre קו, CAGGCreER, וקו כתב dsRedCre (TG (CAG-Bgeo, DsRed *-MST) 1Nagy) (איור 1) 5,6. כדי לפקח על התזמון היחסי של תגובה ששש בתאי הבת, צלב CAGGCreER וקו DsRed עם BAC Olig2-eGFP המהונדס העכברים (TG EK23Gsat (Olig2-EGFP)) (איור 1) 7,8.
- ממיסים בטמוקסיפן 100% אתנול, ולבצע זריקת intraperitoneal של 2.5 מ"ג לטמוקסיפן 40 גרם של משקל גוף לנשים בהריון בעוברי 6.5 (E6.5) כדי לגרום לביטוי Cre וסימון DsRed בקבוצה קטנה של תאים.
- 48 שעות מאוחר יותר לנתח עוברים, לזהות עוברים חיוביים dsRed באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, להעביר אותם לצלחת התרבות וobservדואר חלוקות תא יחידה במהלך לשעבר vivo ההדמיה (ראה להלן).
2. תרבות העובר עכבר כולו
- לנתח E8.5 עוברים במדיום לשטוף מחומם מראש המכיל DMEM/F12 (1:1) בתוספת 10% בסרום יילוד עגל ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (P / S) 9.
- מייד לאחר הנתיחה, עובר מקום על 37 מעלות צלזיוס מתחת שלב חימום מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולזהות כGFP ו / או DsRed חיובי (ראה בהמשך).
- העברה של עד 2 עובר לירידת 500 μl של תקשורת בתרבות מראש equilibrated המכיל 50% עכברוש סרום מזכר ספראג-Dawley ו -50% DMEM/F12 (1:1) בלי פנול אדום בתוספת L-גלוטמין ו -1% של 1 HEPES ז 0.85% NaCl ו-P / S 9.
- למרוח שכבה דקה (0.1 ס"מ) שמן מינרלי אור equilibrated של למעלה מ בינונית על מנת למנוע אידוי ולהעביר את צלחת התרבות המכילה את העוברים ל37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור.
3.זיהום ויראלי
- כדי ריסי תווית בneuroepithelium, להוסיף μl 5-10 של Sstr3-GFP lentivirus, כ -2 מיליון virions, לירידת equilibrated μl 500 של מדיום התרבות המכילה E8.5 עובר.
- לאחר 18 שעות של התרבות, חזרת עוברים נגועים לכמה טיפות של מדיום לשטוף לשטוף את הווירוס ולהכין פרוסה צינור עצבית.
4. הכנה פורסים צינור עצבית עבור הדמית חיה
- לנתח צינור עצבי של עובר E8.5 במדיום לשטוף מחומם מראש באמצעות מ"מ מיקרו סכין גודל 0.025, על צלחת מצופה אגר 1%.
- הנח את צד הצינור העצבי המבודד הגחון למטה בירידת 150 μl של מדיום תרבות equilibrated ללא פנול אדום על צלחת 35 מ"מ פולי-L-ליזין המצופה הזכוכית התחתונה.
- שים כמויות קטנות של תערובת 01:01 עשויים 100% טהורים וזלין ושעוות נר נמס (נר מאיקאה) סביב הצינור העצבי רכוב, ולחץ בעדינות על ידי פיסה צרה של coverslip זכוכית כדילשתק את המדגם.
- מכסה את התבנית בשכבה דקה (~ 0.1 ס"מ) שמן מינרלי אור equilibrated של (איור 2).
5. חי הדמיה ומיקרוסקופיה confocal זמן לשגות
- מניחים צלחת תחת ניקון A1R לייזר סריקת מיקרוסקופ הפוך Confocal מצויד בחדר סביבתי המווסת את הטמפרטורה, שנקבעה ל -37 מעלות צלזיוס, ו 5% CO 2.
- השתמש מטרת נפט הטבילה 60x להקליט ריסי שכותרת GFP ותאים חיוביים dsRed, תוך שימוש מטרת נפט הטבילה 40x לעקוב אחר תאים חיוביים dsRed Olig2-GFP ו.
- פתח את תוכנת שקל האלמנטים להגדיר תנאי הדמיה זמן לשגות. כל 10 דקות לרכוש Z-ערימות של עד 25 מיקרומטר עם מרווח של 1.5 מיקרומטר (אובייקטיבי 40X) ועד 8 מיקרומטר עם מרווח של 0.4 מיקרומטר (60x אובייקטיבי). השתמש 488 561 ננומטר ואת אורכי גל העירור וערוץ משודר במידת צורך. לרכוש תמונות בגודל 512 x 512. הגדרת אזורים מרובים למשתמש מוגדר של interest לבצע בו זמנית הקלטה.
חשיפה אופטימלית לכוח לייזר ובהירות של התמונה הותאמה על ידי שימוש בעוצמה נמוכה לייזר (עד 11% לmCherry 561; עד 4.5% EGFP 405/488), סריקה מהירות 1, 2 קו ממוצע וגודל של חור סיכה (61 מיקרומטר לDsRed; 28.1 מיקרומטר עבור Olig2; 72 מיקרומטר לSSTR3GFP; 61.3 מיקרומטר עבור DsRed וSSTR3GFP; 58 מיקרומטר לDsRed וOlig2). השימוש בכתבי ניאון מקודדים גנטי אפשרו לנו לזהות את הבהירות עם כוח לייזר נמוך. - לנתח את הנתונים שנרשמו באמצעות תוכנת שחזור 3D Imaris.
6. Immunofluorescence
- תקן את העוברים או צינורות עצביים מבודדים בparaformaldehyde 4% / מאגר M 0.1 פוספט על קרח (4 מעלות צלזיוס) במשך שעה 1 בצלחת זכוכית.
- לשטוף דגימות שעה 2 בPBS על קרח (4 מעלות צלזיוס) (שינוי PBS כמה פעמים) ולשים בסוכרוז 30% / מאגר M 0.1 פוספט על הלילה או עד שכיור עוברים.
- שבץ באוקטובר, הקפאת קרח יבש וחנות ב-80 ° C. Perform חתך בcryostat (10 מ"מ).
- לשטוף שקופיות למשך 10 דקות בתמיסה המכילות 1% לשטוף סרום כבשים חום מומת ו0.1% טריטון X-100 ב PBS.
- לדלל נוגדנים עיקריים בפתרון לשטוף בבעקבות ריכוזים: העכברוש (5F8,) 1:200 אנטי RFP חד שבטי; ארנב נגד Arl13b סרום 1:1500 ועכבר חד שבטיים אנטי Arl13b 01:05 (295B/54); ארנב נגד Olig2 1:300; monoclonals עכבר Pax6, ששש וכל Nkx2.2-01:10; וארנב polyclonal Ki67 1:500. הוסף סביב 150 μl לכל שקופית בתא humidified שטוח, לכסות עם parafilm כדי למנוע התייבשות ולהשאיר על הלילה ב 4 ° C.
- לשטוף שקופיות בפתרון לשטוף שלוש פעמים, 20 דקות בכל פעם בטמפרטורת חדר.
- לדלל המשני נוגדני אלקסה פלואוריד 488, 568, 350 בפתרונות לשטוף ב1:200 ריכוז. השתמש Hoechst 1:3,000 או TO-PRO-3 1:500 להכתים גרעינים. הוסף 150 μl לכל שקופית, להשאיר שעה 1 בטמפרטורת חדר בתא humidified המוגן מפני אור.
- לשטוף שקופיות בפתרון לשטוף TWפעמים O, 30 דקות בכל פעם בטמפרטורת חדר.
- הר מחליק ב80% להאריך מגיב אנטי לדעוך זהב ותצוגה בתוך 24 שעות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן אנו ביצע הדמיה לחיות vivo לשעבר של חלוקות תא בודדות בתוך neuroepithelium העכבר E8.5. לתייג תאים בודדים, אנחנו מושרה Cre recombinase בתת קבוצה של תאים המכילים שורת כתב Cre שהביע DsRed על רקומבינציה 5,6 (איור 3 א). כך, 48 שעות מאוחר יותר היינו מסוגל להתבונן חלוקות תא בודדות במהלך לשעבר vivo ההדמיה (איורים 4 א-D). במקביל, אנחנו במעקב כאשר התאים שכותרתו הפכו לשש, מגיבים על ידי כולל כתב ששש תעתיק שונה קו Olig2-eGFP BAC המהונדס (איורים 3C-D: דמויות 4G-N) 1-3. כדי לצפות היווצרות ריסינו נוצרו Sstr3-GFP lentivirus להדביק עוברים בתרבות (איור 3; דמויות 4A-D) 4. Immunofluorescence בוצע כדי לאשר בתוצאות vivo (איורים 4E-F).
בזמן הקפותתצפית ההדמיה confocal דואר של עוברי כתב dsRedCre להביע Olig2-eGFP או נגועים בlentivirus Sstr3-GFP במהלך בתרבות חוץ גופית הם הראו באיור 5 10. על מנת להיות בטוח שביטוי Sstr3-GFP היינו באמצעות לדמיין ריסים לא היה מפריע לכל תהליך ביולוגי בסיסי, אנחנו מאששים נתוני ההדמיה לחיות שלנו עם קטעי עובר פראי מסוג קבוע. כי מצאנו אותו אחוז של asynchrony במבנה ריסים ותגובה ששש, זה מצביע על וירוס SSTR3-GFP לא ישפיע על תהליכים אלה (איור 5 א).
איור 1. תרשים זרימה של הליך ההדמיה vivo לשעבר החי באמצעות neuroepithelium עכבר. עכבר הצלב וtamoxi הסופיטיפול פן מתואר ואחריו את כל שיטת תרבות עובר העכבר. עוברים המבטאים חלבונים מתויגים fluorescently נבחרים ומוכנים להדמיה לחיות. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. הכנת פרוסה צינור עצבית להדמיה לחיות. פרוסת צינור עצבית) עובר הופכין E8.5 עם הופעתו הראשונה של זוגות somite. ב ') בצינור עצבי גזור במדיום מראש חימם באמצעות מיקרו סכין. C) היא רכוב על צד הגחון מנה פולי-L-ליזין מצופה הזכוכית תחתונה. ד ') כמות קטנה של תערובת עשויה מהשעווה ווזלין מיושמת סביב הצינור העצבי ובעדינות מכוסות על ידי Naחתיכת rrow של זכוכית coverslip. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 3. חזותי fluorescently חלבונים מתויגים בתאים חיים של הצינור העצבי עם מיקרוסקופיה confocal.) תוויות DsRed תאים בודדים. ב ') lentivirus SSTR3-GFP הביע בריסים העיקריים כפי שהם יוצרים (ראשי חץ צהובים). תקליטור) E8.5 עובר נושא Olig2-GFP ניתן לראות ביטוי של GFP בתוך neuroepithelium. בר הוא 30 מיקרומטר (A, D), 15 מיקרומטר (ב ') ו1.5 מיקרומטר (C).
איור 4. היווצרות ניטור ריסים ואיתות ששש בחלוקת תאים של הצינור העצבי מתפתח. לספירה) תא חיובי DsRed בודד עובר החלוקה מציג צורות cilium באחד בת של תא לפני התא האחר (C, חץ לבן). הסרט היה צילמו בשיעור של פריים אחד בכל 10 דקות. EF) Immunofluorescence באמצעות נוגדנים נגד RFP בירוק (לDsRed השושלת Tracing) וArl13b באדום (לריסים). הגדלה של אזור התאגרף (E), ללא Hoechst (F). GN) התא החיובי DsRed עובר חילוק (IM). Olig2-GFP בא לידי ביטוי רק בתו אחד (J, N). ההקלטה הייתה צילמו בשיעור של פריים אחד בכל 10 דקות. בר הוא 5 מיקרומטר (AD), 50 מיקרומטר (F), 25 מיקרומטר (GN).
איור 5. ספירה של תא חיובי DsRed עם ריסים ומראה ששש. מספר) של תאי dsRed עוברים חלוקה ולוקליזציה ריסים. סמל * פירושו על ידי יצירת ריסי הדמיה חיה הייתה סינכרוני. ב ') מספר DsRed והתאים החיוביים Olig2-GFP עוברים חטיבה ואיתות ששש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מערכת vivo לשעבר שלנו מאפשרת לנו להתבונן חלוקות תא בודדות ישירות בתוך neuroepithelium הפיתוח בזמן אמת. כדוגמה נבחנו חלוקות תא בתוך הצינור העצבי העוברי בעכבר והפיקוח או היווצרות cilium או תגובה ששש. אנחנו אישר את תוצאות ההדמיה שלנו (n = 24) עלינו בקנה אחד עם תוצאות מסעיפים קבועים (n = 178) המצביעים על הטכניקה שלנו מספקת נתונים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית.
הטכניקה שלנו מסתמכת על האינדוקציה Cre להיות מוגבלת לקבוצת משנה של תאים ולכן המינון של טמוקסיפן חייב להיות מדויק. אנחנו עבדנו את המינון לתיוג תאים בודדים. אנחנו מאמינים שזה יהיה קל לתייג שיבוטים קטנים של תאים עם עלייה קלה במינון המבוססת על הניתוח הראשוני מקו CAGGcreER, אשר הראה תגובה תלויה מינון עד 6 טמוקסיפן. בנוסף, תנאי תרבות העובר הם קריטיים, כהתפתחות לא תקינה מתרחשת כאשר מתקיימת התנאים כבויים.אנו מאשרים כי הפיתוח המשיך בדרך כלל בתנאי התרבות שבם השתמשו, אשר ידוע לעבודה במשך לפחות 36 11 שעות.
את קווי כתב Cre וCre המושרים אנו משתמשים הם זמינים לציבור, כך שניתן להשיג בקלות מה שהופך את הטכניקה הזו די להתאמה לחוקרים עם מגוון רחב של שאלות. כוח האמיתי של הטכניקה שלנו הוא שבאופן גנטי תיוג תאים בודדים, ניתן להשתמש בגישה שלנו לחקור את התנהגות תא בודדת בקווי העכבר הרבים הקיימים ועתידיים שעברו מוטציה. זה יהיה קריטי בהבנה מה באמת השתבש ברבים מן הקווים האלה כמו תצפית ישירה של תאים בתוך העובר היונקים במהלך התפתחות לא נבחן בהרחבה. incorporaton של כתבי ניאון מקודדים גנטי שלנו לזהות בהירות עם כוח לייזר נמוך מספק יתרון אמיתי להתבוננות כזאת. קל לדמיין את חלבונים מתויגים fluorescently סימון האברונים סלולריים ספציפיים או אחר trכתבי anscriptional להיות משולבים בעתיד.
אנחנו היו מעוניינים בעיתוי היחסי של היווצרות cilium העיקרית ותגובה ששש בתאי הבת של תא להתחלק. עם זאת, הקו המהונדס, שאפשרו לנו לעקוב אחר תגובה ששש הביע Olig2-eGFP לאורך ציטופלסמה, לא ניתן לנו לראות את הסמן של cilium הראשוני, Sstr3-GFP באותו התא. לפיכך, היינו נהנה מאוד משני Olig2-eGFP מוגבל גרעיני או היתוך חלבון פלואורסצנטי ספקטרלית ברור Sstr3.
בנוסף לשימוש בקו ממוקד ומהונדס, שהראינו כי הטכניקה שלנו יכולה להיות מותאמת באמצעות בונה ויראליות שהדבקת neuroepithelium בתרבות מספקת מידע שימושי. זה יהיה שימושי לחוקרים במתן שיטה מהירה יותר מדור של קו עכבר מהונדס גנטי. בנוסף, הגישה יכולה לאמת את הדור של קו כזה, ואכן, הנתונים שלנו טוענים טרנסקו genic להביע Sstr3-GFP יהיה שימוש רב בתחום.
השיטה שלנו מספקת כלים שבה השדה יכול לפקח על התנהגות תא יותר באופן מיידי. מצמידים את המשאבים העשירים של מוטציות עכבר אנו מצפים בשיטה זו כדי להיות חזקה במיוחד בבחינת מערך של התנהגויות הסלולר באתרו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
פרויקט מחקר זה נתמך על ידי מוסף ערה, 5 R01 NS056380. תמיכה נוספת מסופקת באמצעות וקטור ויראלי הליבה והליבה מיקרוסקופית של אמורי Neuroscience NINDS Core מתקני המענק, P30NS055077. אנו מודים לעכבר המהונדס אמורי וCore מיקוד גן הנובע מקו עכבר GENSAT; גרג Pazour לשורת התאים היציב SSTR3-GFP IMCD3; ובראדלי Yoder לlentiviral Sstr3-GFP לבנות. נוגדנים חד שבטיים, התקבלו ממחקרי Hybridoma הבנק התפתחותית, שפותח בחסות NICHD, ומתוחזק על ידי אוניברסיטת איווה, מחלקה למדעי ביולוגיה, איווה סיטי, IA 52242. נהלי כל החיה שאושר על ידי ועדת IACUC והבטיחות הביולוגית באוניברסיטת אמורי.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J | Jackson Laboratory | 005438 | |
Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd | MMRRC, | 010555-UCD | |
CAGGCreER | Jackson Laboratory | 003724 | |
Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
DMEM/F12 (1:1) | GIBCO | 21041-025 | |
Newborn calf serum | Lonza | 14-416F | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
Rat Serum SD male | Harlan Bioproducts | 4520 | |
1M Hepes | BioWhittaker | 17-737E | |
L-Glutamine | GIBCO | 21041-025 | |
Light mineral oil | Sigma | M8410 | |
Sstr3-GFP lentivirus | Emory Viral Core | ||
Micro-knife, size 0.025 mm | Electron Microscopy Sciences | 62091 | |
35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish | MatTek | P35GC-0-10-C | |
100% Petroleum Jelly | Kroger | FL9958c | |
A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope | Nikon | ||
NIS Elements software | Nikon | ||
Imaris 3D software | Bitplane AG | Imaris 7.2.3 | |
OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
Cryostat | Leica | CM1850 | |
Heat-inactivated sheep serum | Invitrogen | 16210-072 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
Parafolmaldehyde | Sigma | P6148 | |
Phosphate Buffer | Lab made | ||
Rat monoclonal anti-RFP (5F8) | Chromotek | 110411 | |
Rabbit anti-Arl13b serum | NeuroMab | ||
mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 | NeuroMab | ||
Rabbit anti-Olig2 | Chemicon | AB9610 | |
Mouse monoclonals Pax6 | Developmental Hybridoma Bank | Pax6 | |
Mouse monoclonalsShh | Developmental Hybridoma Bank | 5E1 | |
Mouse monoclonals Nkx2.2 | Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | |
Rabbit polyclonal Ki67 | Abcam | AB15580 | |
Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | |
Alexa Fluor 568 | Molecular Probes | A11031 | |
Alexa Fluor 350 | Molecular Probes | A11046 | |
H–chst | Fisher | AC22989 | |
TO-PRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
ProLong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36934 |
References
- Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the neural tube: motor neuron induction by diffusible factors from notochord and floor plate. Cell. 73, 673-686 (1993).
- Ericson, J., Muhr, J., Placzek, M., Lints, T., Jessell, T. M., Edlund, T. Sonic hedgehog induces the differentiation of ventral forebrain neurons: A common signal for ventral patterning within the neural tube. Cell. 81, 747-756 (1995).
- Briscoe, J. A. Homeodomain Protein Code Specifies Progenitor Cell Identity and Neuronal Fate in the Ventral Neural Tube. Cell. 101, 435-445 (2000).
- Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol. Biol. Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).
- Vintersten, K. Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals. Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).
- Hayashi, S., McMahon, A. P. Efficient recombination in diverse tissue by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse. Dev. Biol. 244 (2), 305-318 (2002).
- Gong, S., Zheng, C., Doughty, M. L., Losos, K., Didkovsky, N., Schambra, U. B., Nowak, N. J., Joyner, A., Leblanc, G., Hatten, M. E., Heintz, N. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
- Mukouyama, Y. S., Deneen, B., Lukaszewicz, A., Novitch, B. G., Wichterle, H., Jessell, T. M., Anderson, D. J. Olig2+ neuroepithelial motoneuron progenitors are not multipotent stem cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1551-1556 (2006).
- Jones, E. A. V., Crotty, D., Kulesa, P. M., Waters, C. W., Baron, M. H., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture. Genesis. 34, 228-235 (2002).
- Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. Live imaging of individual cell divisions in mouse neuroepithelium shows asymmetry in cilium formation and Sonic hedgehog response. Cilia. 1 (6), In Press (2012).
- Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. -K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods in Enzymology. 476, 351-377 (2010).