Summary
여기에서 우리는 필요한 도구를 개발
Abstract
우리는 형광 마커와 배아 마우스 neuroepithelium의 배양 조각의 라이브 영상을 통합하는 시스템을 개발했다. 우리는 추적 혈통 유전 셀에 대한 기존의 마우스 선을 이용했다 : 타목시펜 유도 크레 라인과 크레-매개 재조합에 DsRed를 표현하는 크레 기자 라인. 타목시펜의 상대적으로 낮은 수준을 사용함으로써, 우리는 우리가 각각의 세포 분열을 따르도록 허용하는 세포의 작은 수의 재조합을 유도 할 수 있었다. 또한, 우리는 Olig2-EGFP 유전자 변형 라인 1-3를 사용하여 소닉 고슴도치 (쉬) 신호에 대한 전사 반응을 관찰하고 우리는 섬모 마커, Sstr3-GFP 4를 표현 바이러스 배양 슬라이스를 감염시켜 섬모의 형성을 감시. 이미지 순서 neuroepithelium, 우리는 신경 튜브를 절연, E8.5에서 배아를 수확, 이미징 챔버에 적절한 배양 조건에서 신경 슬라이스를 장착 시간 경과 공 촛점 이미징을 수행 하였다. 우리의 예생체 라이브 영상 방식은 우리가 생리학 관련 방식으로 차 섬모 형성과 쉬 응답 상대 타이밍을 평가하기 위해 단일 세포 분열을 추적 할 수 있습니다. 이 방법은 쉽게 구별 형광 마커를 사용하여 적응하고 필드에게 현장에서 실시간으로 세포의 행동을 모니터링되는 도구를 제공 할 수 있습니다.
Protocol
성인 마우스는 기계 자궁 전위에 의해 안락사 있습니다. 모든 동물 절차 IACUC에 모리 대학의 바이오 안전성위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 배아 생성
- 크로스 타목시펜 유도 크레 라인 CAGGCreER 및 dsRedCre 기자 선 (전이 (CAG-Bgeo, -는 DsRed * MST) 1Nagy) (그림 1) 5,6. 딸 세포, 간 CAGGCreER 및 Olig2-EGFP BAC 형질 전환 생쥐 (전이 (Olig2-EGFP) EK23Gsat) (그림 1) 7,8과 DsRed를 줄 쉬 응답 상대 타이밍을 모니터링 할 수 있습니다.
- 100 % 에탄올에 타목시펜을 녹여 크레 발현과 세포의 작은 하위 집합에서 DsRed를 라벨을 유도하는 배아 6.5 (E6.5)에서 임신 여성에 체중 40g 당 2.5 밀리그램 타목시펜의 복강 내 주입을 수행합니다.
- 48 시간 나중에, 배아를 해부 형광 현미경을 사용하여 DsRed를 긍정적 인 배아를 식별 문화 접시로 전송하고 observ생체 이미징 동안 전자 단일 세포 분열 (아래 참조).
2. 전체 마우스 배아 문화
- 10 %의 신생아 송아지 혈청과 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S) 9로 보충 DMEM/F12 (1:1)를 포함하는 미리 예열 세척 매체에 E8.5 배아를 해부.
- 직접 형광 현미경 37 ° C 가열 무대에서 해부, 장소 배아 후와 GFP 및 / 또는 DsRed를 플러스 (아래 참조)로 식별합니다.
- L-글루타민과 보충 페놀 레드없이 50 %의 Sprague-Dawley 계 수컷에서 혈청 쥐와 50 %의 DMEM/F12 (1:1)를 포함하는 사전 평형 배지 500 μL 강하의 1 %에 2 배아까지 이동 0.85 % 염화나트륨 및 P / S 9 1 M의 HEPES.
- 증발을 방지하고 배양 접시는 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에 배아를 포함하는 전송 매체를 통해 평형 가벼운 미네랄 오일의 얇은 층 (0.1 cm)를 적용합니다.
3.바이러스 감염
- neuroepithelium의 레이블 섬모하기 위해서는, E8.5 배아를 포함하는 배양액 500 μL 평형 하락 Sstr3-GFP 렌티 5 ~ 10 μL, 약 2 백만 비리를 추가합니다.
- 문화의 18 시간 후, 바이러스를 씻어 내고 신경관 슬라이스를 준비하는 세척 매체의 몇 방울에 감염된 배아를 전송합니다.
4. 라이브 영상에 대한 신경 튜브 슬라이스 준비
- 1 %의 한천 코팅 접시에, 마이크로 칼 크기 0.025 mm를 사용하여 미리 예열 세척 매체 E8.5 태아의 신경관을 해부하다.
- 35mm 폴리-L-라이신 코팅 유리 바닥 접시에 페놀 레드 않고 평형 배양액 150 μL 드롭 고립 된 신경관 복부 측면을 놓습니다.
- 를 위해 유리 커버 슬립의 좁은 조각에 의해 100 % 순수 석유 젤리 및 장착 신경관 주위에 녹은 초 왁스 (IKEA에서 촛불) 부드럽게 눌러 만든 1:1 혼합물의 소량을 넣어샘플을 고정시킨다.
- 평형 가벼운 미네랄 오일의 얇은 층 (~ 0.1 cm) (그림 2)와 접시를 커버.
5. 이미징 및 시간 경과 공 촛점 현미경을 살고
- 온도 조절 환경 챔버를 갖추고 공 초점 거꾸로 현미경 스캐닝 니콘의 A1R 레이저 아래 장소 접시, 37으로 설정 ° C, 5 % CO 2.
- 40X 기름 침지 목적 사용 Olig2-GFP와 DsRed를 양성 세포를 모니터링하는 동안 GFP 표시 섬모와 DsRed를 양성 세포를 기록 60X 기름 침지 목표를 사용합니다.
- 시간 경과 이미징 조건을 설정하는 NIS 요소 소프트웨어를 엽니 다. 매 10 분 1.5 μm의 (40X 목적)와 0.4 μm의 (60X 목적)의 간격이 최대 8 ㎛의 간격으로 Z-스택에 25 μm의 최대를 획득. 필요한 경우 488와 561 nm의 여기 파장 및 전송 채널을 사용합니다. 512 X 512 사이즈로 이미지를 획득. INT의 여러 사용자 정의 영역을 설정erest 동시에 녹음을 수행 할 수 있습니다.
스캔 속도 1, 선 평균 2 및 핀 구멍의 크기 (61, 이미지의 레이저 전력 및 밝기 최적의 노출로 사용 낮은 레이저 강도 (4.5 %까지 EGFP 488분의 405 mCherry 561의 경우 최대 11 %)로 조정되었다 DsRed를위한 μM, Olig2 28.1 μM, SSTR3GFP 72 μm의, DsRed를하고 SSTR3GFP을위한 61.3 μm의, DsRed를하고 Olig2 위해 58 μm의). 유전자 인코딩 형광 기자의 사용은 우리가 낮은 레이저 파워의 밝기를 감지 할 수있었습니다. - Imaris 3D 재구성 소프트웨어를 사용하여 기록 된 데이터를 분석합니다.
6. 면역
- 유리 접시에 1 시간 동안 얼음에 4 % 파라 포름 알데히드 / 0.1 M 인산 버퍼 (4 ° C)에서 배아 또는 격리 된 신경 튜브를 고정합니다.
- 샘플에게 얼음에 PBS에서 2 시간 (4 ° C) (변경 PBS 몇 번)와 하룻밤 또는 배아 싱크까지 30 % 자당 / 0.1 M 인산 버퍼에 넣어 씻는다.
- -80에서 드라이 아이스 및 저장 ° C.에, 10 월에 동결을 포함 피그라 이오 스탯 (10 ㎜)에 단면을 erform.
- 1 % 열 - 불 활성화 된 양 혈청을 포함하는 세척 용액에 10 분간 0.1 % PBS에 트리톤 X-100에 대한 슬라이드를 씻으십시오.
- 농도를 다음에서 세척 용액에 기본 항체를 희석 : 쥐 단일 클론 항-RFP (5F8), 1:200, 토끼 반대로 Arl13b 혈청 1:1500 및 마우스 단클론 항-Arl13b 1시 5분 (295B/54) 토끼 반대로 Olig2 1:300, 마우스 monoclonals PAX6, 쉬와 Nkx2.2 모두 1:10과 Ki67 1:500 클론 토끼. 평면 가습 챔버 슬라이드 당 150 ㎕의 주위에 추가 건조 방지와 4에서 밤에 남겨 ° C로 파라 필름 (parafilm)와 커버
- 세 번, 20 분마다 상온에서 세척 용액에 슬라이드를 씻으십시오.
- 1:200 농도 세척 솔루션 차 항체 알렉사 플 루어 488, 568, 350 희석. 핵 얼룩 훽스트 1:3,000 또는 TO-PRO-3 1:500을 사용합니다. 슬라이드 당 150 μl를 추가, 빛으로부터 보호 가습 챔버 실온에서 1 시간을 둡니다.
- 세척 용액 TW에서 슬라이드를 씻으십시오오 시간, 실온에서 30 분마다.
- 마운트는 24 시간 내에 골드 안티 - 페이드 시약 및 뷰를 연장 80 %에 슬라이드.
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Representative Results
여기에서 우리는 E8.5 마우스 neuroepithelium 내에서 단일 세포 분열의 생체 라이브 영상을 시행 하였다. 개별 셀에 레이블을 지정하려면, 우리는 재조합 5,6 (그림 3A)에 DsRed를 표현 크레 기자 라인을 포함하는 셀의 하위 집합에 Cre 호텔 재조합을 유도. 따라서, 48 시간 후에 우리는 생체 이미징 (그림 4A-D) 중 하나의 세포 분열을 관찰 할 수 있었다. 1-3,라는 세포가 BAC 형질 전환 Olig2-EGFP 라인 (그림 4G-N 그림 3C-D) 수정 쉿 전사 기자를 포함하여 쉬 응답되었을 때 부수적으로, 우리는 감시. 섬모 형성을 관찰하기 위해 우리 문화의 태아를 감염 Sstr3-GFP lentivirus의 생성 (그림 3B, 그림 4A-D) 4. 면역은 생체 내 결과 (그림 4E-F)에서 확인을 위해 수행되었다.
시간 바퀴Olig2-EGFP을 표현하거나 체외 배양시 Sstr3-GFP의 lentivirus를 감염 dsRedCre 기자 배아의 전자 공 촛점 이미징 관찰은 그림 5에서 보여준 있습니다. 우리는 섬모를 시각화하기 위해 사용 된 Sstr3-GFP 발현은 어떤 근본적인 생물학적 과정에 방해되지 않도록하기 위해서는, 우리는 고정 된 야생 형 배아 부분으로 우리의 라이브 영상 데이터를 뒷받침. 우리는 섬모 형성과 쉬의 질문에 답변 비동기의 동일한 비율을 찾을 수 있기 때문에 SSTR3-GFP 바이러스는 이러한 프로세스 (그림 5A)를 영향을주지 않았다 나타냅니다.
그림 1. 마우스 neuroepithelium를 사용하여 생체 라이브 이미징 절차의 흐름도. 최종 마우스 십자가 tamoxi펜 처리는 전체 마우스 배아 배양 방법에 의해 다음에 그려져있다. 찬란 태그 단백질을 표현 배아를 선택하고 라이브 영상에 대한 준비가되어 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 라이브 이미징을위한 신경관 슬라이스 준비.) 체절 쌍 첫 등장과 E8.5 돌리지 않은 배아. B) 예열 매체 해부 신경 튜브 마이크로 칼을 사용. C)이 신경 튜브 슬라이스에 복부 측면을 탑재 신경 튜브의 주위에 적용하고 부드럽게 NA에 의해 보호 석유 젤리 왁스로 만들어진 혼합물의 폴리-L-라이신 코팅 유리 바닥 요리. D) 작은 양유리 커버 슬립의 RROW의 조각. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. 공 촛점 현미경과 신경 튜브의 살아있는 세포에서 찬란 태그 단백질을 시각화.은)는 DsRed 라벨 개별 셀. 그들은 양식 (노란색 화살촉)와 같은 기본 속눈썹 표현 B) SSTR3-GFP의 렌티. CD) Olig2-GFP를 들고 E8.5의 배아 neuroepithelium에서 GFP 발현을 보여줍니다. 바 30 μm의 (A, D), 15 μm의 수 있습니다 (B)와 1.5 μm의 (C).
그림 4. 분열을 겪고있는 개발 신경 튜브의 세포 분열에서 모니터링 섬모 형성과 쉬 신호. AD) 싱글 DsRed를 긍정적 인 셀은 이전에 다른 세포 (C, 흰색 화살표) 한 딸 세포의 섬모 양식을 보여줍니다. 영화는 10 분 간격 한 프레임의 속도로 몇 군데 있었다. EF) 면역 형광은 녹색 RFP (DsRed를 계보 추적 용) 및 빨간색 Arl13b (속눈썹 용)에 대한 항체를 사용하여. 훽스트 (F). GN)없이 박스 영역 (E)의 확대는 DsRed를 긍정적 인 세포 분열 (IM)를 겪는다. Olig2-GFP는 하나의 딸 (J, N)로 표시됩니다. 녹음 한 프레임마다 10 분의 속도로 몇 군데 있었다. 바 5 μm의 (AD), 50 μm의 (F), 25 μm의 (GN)입니다.
그림 5. 섬모와 쉬 외관 DsRed를 긍정적 셀의 계산. 분열과 속눈썹 현지화를 진행 DsRed를 세포) 번호. 라이브 영상 섬모 형성 동기였다가 기호 * 의미합니다. B) DsRed를하고 분열과 쉬 신호를 겪고 Olig2-GFP 양성 세포의 수.
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Discussion
우리 전직 생체 시스템은 우리가 직접 실시간으로 개발 neuroepithelium 내에서 단일 세포 분열을 관찰 할 수 있습니다. 예를 들어 우리는 마우스 배아 신경관에서 세포 분열을 검토하고 섬모 형성이나 쉬 응답 중 하나를 감시. 우리는 우리의 기술 생리 학적으로 관련 데이터를 제공 나타내는 고정 부분 (n은 = 178)의 결과와 일치 하였다 우리의 이미징 결과 (N = 24)을 확인했다.
우리의 기술은 타목시펜의 용량이 정확해야하므로 크레 유도는 세포의 하위 집합으로 제한되는에 의존합니다. 우리는 하나의 세포를 라벨에 대한 투약을했다. 우리는 타목시펜 6 농도 의존적 반응을 보였다 CAGGcreER 라인의 초기 분석에 따라 용량에 약간의 증가와 세포의 작은 클론을 레이블 쉬울 것이다 생각합니다. 조건이 꺼져있는 경우 비정상적인 발달이 발생할 때 또한, 배아 배양 조건은 중요하다.우리는 개발에 적어도 36 시간 11 작동하는 것으로 알려진 우리가 사용하는 배양 조건 하에서 정상적으로 진행 함을 확인 하였다.
우리가 사용하는 유도 크레과 크레 기자 라인은 공개적으로 사용할 수 있도록 쉽게 질문의 다양한 연구자들에게이 기술은 매우 융통성 만들기를 얻을 수 있습니다. 우리의 기술의 진정한 힘은 유전자 단일 세포를 라벨에 우리의 접근 방식은 많은 기존 및 향후 돌연변이 마우스 라인에 하나의 세포 행동을 심문하는 데 사용될 수 있다는 것입니다. 이건 정말 개발하는 동안 포유 동물의 배아에서 세포의 직접 관찰 이러한 라인의 많은에서 잘못된 것입니다 것은 광범위하게 조사되지 않은 것을 이해 중요합니다. 낮은 레이저 파워와 밝기를 감지하는 유전자 인코딩 형광 기자의 우리의 incorporaton은 관찰 진정한 이점을 제공합니다. 그것은 특정 세포 소기관을 표시 찬란 태그 단백질이나 다른 TR을 상상하기 쉽다anscriptional 기자는 미래에 통합되고있다.
우리는 차 섬모 형성과 분열 세포의 딸 세포에서 쉬 반응의 상대적인 타이밍에 관심이 있었다. 그러나 우리가 쉬 응답을 모니터링 할 수있게 유전자 변형 라인은 동일한 셀의 기본 섬모, Sstr3-GFP의 마커를 보는 우리를 배제, 세포질 전반에 걸쳐 Olig2-EGFP을 표현했다. 따라서, 우리는 크게 핵 제한된 Olig2-EGFP 또는 스펙트럼 별개의 Sstr3 형광 단백질 융합 하나에서 혜택을 것입니다.
대상 및 유전자 변형 라인을 사용하는 것 외에도, 우리는 우리의 기술은 바이러스 구조를 사용하여 적응 및 문화 neuroepithelium를 감염하는 유용한 데이터를 제공하는 할 수있는 것으로 나타났다. 이 유전자 변형 마우스 라인의 세대보다 더 빠른 방법을 제공하는 연구자에게 도움이 될 것입니다. 또한, 방법은 같은 라인의 생성을 확인할 수 있습니다 실제로, 우리의 데이터는 트랜스 주장Sstr3-GFP를 표현 제닉 라인은 필드에 큰 도움이 될 것입니다.
우리의 방법은 필드가 더 즉시 세포 행동을 모니터링 할 수있는 도구를 제공합니다. 마우스 돌연변이의 풍부한 자원에 결합 된 우리는이 방법을 현장에서 세포 행동의 배열을 검사 특히 강력한 것으로 예상.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구 프로젝트는 ARRA 보충, 5 R01 NS056380에 의해 지원되었다. 추가 지원은 바이러스 성 벡터 코어와 모리 신경 NINDS 핵심 시설 보조금, P30NS055077의 현미경 코어를 통해 제공되었다. 안정 SSTR3-GFP IMCD3 세포 라인에 대한 그렉 Pazour; 우리는 GENSAT에서 마우스 선을 파생시키기위한 모리 형질 전환 마우스 및 유전자 타겟팅 코어를 감사하고 Sstr3-GFP 렌티 바이러스에 대한 브래들리 Yoder는 구성. 단일 클론 항체는 NICHD의 후원하에 개발 된 발달 연구 브리 도마 은행에서 얻은 아이오와 대학교 생물 과학부, 아이오와 시티, 아이오와 52242에 의해 유지되었다. 모든 동물 절차 IACUC에 모리 대학의 바이오 안전성위원회에 의해 승인되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J | Jackson Laboratory | 005438 | |
| Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd | MMRRC, | 010555-UCD | |
| CAGGCreER | Jackson Laboratory | 003724 | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| DMEM/F12 (1:1) | GIBCO | 21041-025 | |
| Newborn calf serum | Lonza | 14-416F | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Rat Serum SD male | Harlan Bioproducts | 4520 | |
| 1M Hepes | BioWhittaker | 17-737E | |
| L-Glutamine | GIBCO | 21041-025 | |
| Light mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Sstr3-GFP lentivirus | Emory Viral Core | ||
| Micro-knife, size 0.025 mm | Electron Microscopy Sciences | 62091 | |
| 35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish | MatTek | P35GC-0-10-C | |
| 100% Petroleum Jelly | Kroger | FL9958c | |
| A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope | Nikon | ||
| NIS Elements software | Nikon | ||
| Imaris 3D software | Bitplane AG | Imaris 7.2.3 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Parafolmaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffer | Lab made | ||
| Rat monoclonal anti-RFP (5F8) | Chromotek | 110411 | |
| Rabbit anti-Arl13b serum | NeuroMab | ||
| mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 | NeuroMab | ||
| Rabbit anti-Olig2 | Chemicon | AB9610 | |
| Mouse monoclonals Pax6 | Developmental Hybridoma Bank | Pax6 | |
| Mouse monoclonalsShh | Developmental Hybridoma Bank | 5E1 | |
| Mouse monoclonals Nkx2.2 | Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | |
| Rabbit polyclonal Ki67 | Abcam | AB15580 | |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 | Molecular Probes | A11031 | |
| Alexa Fluor 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| H–chst | Fisher | AC22989 | |
| TO-PRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36934 |
References
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