清醒小鼠滴鼻的CNS药物治疗管理

Summary

目的针对脑清醒小鼠鼻内给药的方法，进行说明。这种方法允许重复给药，长期使用鼻腔给药的药物无需麻醉，并以最小的全身暴露的鼻子到大脑传递。

Abstract

鼻内给药是一种方法，治疗剂传递到中枢神经系统（CNS）。它是非侵入性的，不穿越血脑屏障进入中枢神经系统的允许大型分子。药物直接针对鼻腔给药的中枢神经系统，减少系统性风险，并因而不需要的全身性的副作用^1。从鼻子到交货的中枢神经系统一起发生在几分钟之内的嗅觉和三叉神经通路通过细胞外的路线和，不需要药物绑定到任何受体或轴突运输^2。鼻腔给药是一个广泛宣传的方法和目前正在使用的人体临床试验^，3。

药物在动物模型中允许鼻腔给药的药代动力学分布性和有效性的初步评估。与小鼠，它是可能的管理定期使用斯佩恰清醒（非麻醉）的动物的药物汉化鼻内抓地力。清醒交付是有益的，因为它允许长期慢性无需麻醉剂量，花费较少的时间比麻醉，很多人可以学习和做的，所以，团队，技术人员可以剂量的小鼠在短期内大量。以这种方式给小鼠鼻内给药的治疗效能已被证明在一些包括胰岛素在糖尿病小鼠模型^4-6和去铁胺在阿尔茨海默氏症小鼠模型的研究^。7,8

小鼠鼻腔的抓地力可以学习的，但是是不容易的，需要实践，技巧和精确的抓地力，有效的药物输送到大脑和避免对肺，胃引流。抑制小鼠用手举行的颈部与地板平行，而药物传递用移液器使用优势手使用的改性在非优势手的浮渣。它通常需要3-4周的驯化处理前小鼠可以保持这种握法无应激反应。我们准备了这份朱庇特的视频，，鼻腔给药技术使这更容易。

Protocol

1。驯化处理鼻内给药清醒小鼠

介绍

必须适应小鼠在发病前鼻内给药2至4个星期为一个周期的处理。驯化的处理是很重要的，因为它有助于确保正确的身体姿势清醒的鼻腔药物输送的最大效益。此外，服药后，小鼠没有得到很好的适应这个过程可以有一个严重的焦虑反应。小鼠应花费约2-3天在每个九个步骤进展到下一步骤之前，根据动物的舒适操作。鼠标的应力水平应作为衡量进展。这意味着，监测鼠标的移动，排尿，排便量/频率，浑身发抖，又咬。如果鼠标具有较高的应激反应，停留在这一步之前进展到下一个，直到响应减少。一个样品驯化SCHedule可以看出，在表1。驯化的小鼠的发展，应通过以下的一天一次的步骤。不止一次地执行这些步骤，在试图加快驯化，每天不推荐。

1. 将鼠标在手心一段时间的两到三分钟，不超过一英尺以上的笼顶，动物经常跳在此介绍的步骤。如果鼠标试图爬出来的手和简单起来一个人的手臂，抬起的鼠标基地的尾巴，把它在一个人的手。
2. 将鼠标在三分钟的手的手掌，轻轻的动物和宠物。宠物鼠标定向从头部到尾部，而让动物自由走动。
3. 将鼠标在手心的三分钟按摩耳朵后面（轻轻地捏在一起，脖子后面的皮肤上，用拇指和食指）。
4. 保持/李FT鼠标，它的脖子颈背，持续30秒，让鼠标停留在笼顶30秒，再重复之前保持。
5. 按住鼠标采用鼻内抓地力，这是第2节，但不要颠倒的动物（完成步骤2.4）。类似这样的动物为30秒的期间保持和释放回到笼顶部。重复第二次，后一分钟的休息时间。
6. 按住鼠标鼻内握在第2条中所描述的，颠倒的动物，所以它的腹侧面朝上朝天花板。请确保动物的脖子上是与地面平行。保持这个姿势30秒。重复后一分钟的休息时间，这是第二次。一些小鼠抵抗鼻内的抓地力比别人多，尤其是在第一时间反演在这一步中驯化。如果鼠标释放自己的抓地力，把鼠标上笼顶部和再握。如果需要，重复进行重新把持，但监测的鼠标的应力水平，并返回到笼如有必要。在这一点上失去了抓地力，在驯化过程中可以发挥作用的另一个因素是缺乏经验的驯兽员的鼻腔给药技术。
7. 按住鼠标鼻腔内的抓地力，反转，简单地将一个空尖移液器在每个鼻孔，并保持30秒的动物的位置。重复此步骤后一分钟的休息时间。
8. 鼻腔内的抓地力，按住鼠标反效果，和6μl的生理盐水滴鼻管理第3（通过步骤3.7）中描述的左，右纳雷。
9. 按住鼠标鼻腔内的抓地力，转化它，并两次将动物的左，右纳雷上笼顶之间，如在第3节6μl的生理盐水滴鼻管理。

2。鼻内握固定清醒小鼠

1. 将鼠标on的笼顶部。
2. 你的惯用手的拇指和食指按住鼠标的尾巴。用你的中指，无名指和小指的手指，轻轻地固定身体的下部笼顶（ 图1A）。让鼠标抓住的酒吧正如你轻轻地伸展鼠标，更好地抓住颈背。
3. 你非惯用的手，用拇指和中指捏住鼠标坚决的颈背后面的颈部和肩部多余的皮肤。松弛的皮肤向上拉一顶帐篷的皮肤在整个肩胛骨（ 图1B）。以尽可能的皮肤，但要小心，不要拉肌肉，因为这会引起不适感的鼠标。一定要谨慎，以免动物的肋骨或脊柱施加太大的压力。过度的压力或拉力的皮肤，可能会导致在某些情况下，呼吸抑制。
4. 你非惯用手的食指上快速地将鼠标的头尽可能靠近鼻子和在皮肤上（ 图1C，1D）拉回来。在同一时间，滑动朝向头部的最佳位置的拇指和中指。在理想的情况下，鼠标应该无法垂直或水平移动其头部。
5. 在保持抓地力的颈背，把鼠标到他的背部。鼠标的背部应该是在你的手掌。对你的手掌牢牢抓住老鼠的尾巴基地附近的最后两个手指（环和小指）稳定的鼠标，或者，整个下半身（ 图1E，1F），你可以换你的手指。
6. 在这一点上使确定鼠标的颈部和下巴是平的和平行于地板。下巴应该是接近180度的角度与颈部尽可能地协助鼻腔给药。角度的微小变化可能会导致药物，结束了在错误的网站。确保鼠标能够通过观察腹部呼吸。鼠标翔民联无法移动，但应该是舒适的，而不是在任何疼痛。如果你看到鼠标的脖子和下巴的“V”，那么你需要重新握。

3。清醒小鼠鼻腔给药的药物

介绍

使用鼻内的抓地力，每只小鼠被抑制两次，并持有与他们的颈部与地板平行，而20-30微升的液体的体积给药。体积小大小鼠是安全和有效的，我们通常使用24微升，并在本协议中所描述的。清醒鼻内可用于任何年龄的小鼠，例如在新生小鼠的发育神经科学的研究方法。在新生小鼠中，应使用一个较小的总体积（8微升）和液滴尺寸（1微升），以容纳更小的体积的鼻腔。药物通常是交付给两只老鼠一次，交替休息时间最有效地利用时间，并保持ØŇ时间表。 SET-UP会有一点点不同而有所不同，如果你安置给药组小鼠或单独饲养的小鼠。单独饲养的小鼠，将所有材料在防止老鼠从跨越到其他笼顶部网箱之间是有帮助的。随着组安置的小鼠，剂量只有从那个笼子。重要的是，一组安置笼中每个鼠标接收相同鼻内治疗，作为交叉污染的两个不同的治疗方法的潜在的存在由于药物到空气中或与皮肤接触的驱逐。我们强烈建议提前印刷，计量表，提醒技术人员的待遇分配，记录任何票据错过滴，要注意每个动物的健康，等

步骤

1. 设置笼子里，他们应该是定量给料，并成立了一个计量站（ 图2）。
2. 拔下鼠标从笼，继续用药笼顶部。
3. 拿起鼠标，使用鼻内第2条中所述的抓地力。
4. 用你的优势手，加载移液器与6μl的药物或车辆。将鼠标的左鼻孔中，通常会在一个45度的角度（ 图1G，1H）附近的填充移液器的前端。如果你有粘性的解决方案，您可能需要增加你的角度为90度，因为该药物可能会遇到的侧吸头，而不是下降。如果很粘稠，擦拭前，用纸巾吸头排出的液体可能会有帮助。慢慢地喷射药物，其中大约一半的体积（3微升），形成一个小的液滴。
5. 液滴足够应放置在靠近鼠标的鼻孔，使鼠标可吸入液滴。后立即这鼠标吸入小滴，弹出的移液管尖中的其余部分的药物，以形成为鼠标的另一个小液滴，通过相同的鼻孔约2-3秒购买吸入。一定要注意口。如果我任何液体在嘴里，下拉并没有使其完全进入鼻子和应注意这一点。
6. 按住鼠标在这个位置上，持续15秒。我们强烈建议使用一个定时器来规范这个15秒的保持。
7. 右鼻孔，重复步骤3.3 - 3.6。如果有任何下降哼了一声，那滴应该被替换，并注意到。
8. 鼠标放置回他的笼子的顶部上，持续2分钟。开始2分钟，重复整个过程。在分娩后的首次下降。这给出了鼠标4 6各1μl总计24μl的溶液滴。 表2中可以看出，在一次给药的一个或两个小鼠的样品时间表。
9. 鼠标已收到所有滴后，返回鼠标移动到它的笼子。

4。一般驯化和鼻腔给药的药物清醒小鼠的动物处理技术

每个驯化后或鼻腔给药会议的，老鼠应该是给NA治疗，积极强化，如切里奥或去皮葵花籽。零食作为奖励，并转移他们的注意力，可能会导致伤害自己摸自己的鼻子。当工作组设小鼠，足够的对待应该被丢弃的每个鼠标。在返回到笼子里的动物，一定要恢复到原来的状态巢，以减少压力。剂量组设动物时，必须更换手套之间剂量的笼子，不转让香味从笼笼殖民地的殖民地，因为他们将成为另一个积极的努力。

Representative Results

有几种方法，以确定疗效的药物输送。首先是要管理的染料，如印度墨水或亚甲基蓝和鼻内的嗅觉上皮细胞内的动物实施安乐死后和后大脑被移除时，通过筛板进入中枢神经系统的可视化的染料。第二是要测量的药物交付通过使用放射性标记的标记，或使用未标记的分子的ELISA检测。 Hanson 等人分布在中枢神经系统用药后药物清醒小鼠中可以找到一个很好的例子。2012年^7。我们预计在嗅球和三叉神经中含有高浓度的药物传递。在浓度为3.65μmol去铁胺鼻腔给药后30分钟，在三叉神经和嗅觉神经的浓度分别为29μM和13μM。药物浓度将是显而易见的，在整个大脑的所有区域（在这个例子中一个范围e为0.6微米到4.1微米）接收输入的嗅觉神经和三叉神经领域具有较高的浓度。例如，喙区域的皮层含有较高浓度比尾部的皮质及脑桥，中脑或延髓比将含有较高浓度。在脊髓中的下降的浓度梯度从宫颈腰椎通常观察（在这个例子中的梯度为1.5μM〜2.0μM）。鼻内给药也导致了高浓度的药物达到脑膜和颈部淋巴结肿大。第三条道路证明疗效的交付是衡量一个行为或生化反应的药物。例如，鼻内去铁胺治疗老年痴呆症的转基因小鼠的性能得以提高的空间记忆任务和磷酸化糖原合酶激酶3测试版^9。

日＃

日	行动
1	中号	保持〜2-3分钟
2	涂	保持〜2-3分钟
3	W	保持和宠物〜2-3分钟
4	钍	保持和宠物〜2-3分钟
5	F	轻轻捏或颈背
6	中号	轻轻捏或颈背
7	涂	颈背及升降机
8	W	颈背及升降机
9	钍	鼻内握
10	F	鼻内握
11	M </ TD>	鼻内（IN）握和反转
12	涂	鼻内（IN）握和反转
13	W	抓地力，反转，将吸管靠近鼻子尖
14	钍	抓地力，反转，将吸管靠近鼻子尖
15	F	抓地力，反转，提供1轮生理盐水每个纳雷
16	中号	抓地力，反转，提供1轮生理盐水每个纳雷
17	涂	抓地力，反转，提供2轮生理盐水每个纳雷
18	W	抓地力，反转，提供2轮生理盐水每个纳雷

表1中。驯化处理鼻内给药清醒小鼠的样本时间表。

时间（分：秒） 鼠标＃ 行动 0:00 1 第一组在左鼻孔滴* 0:15 第二套右鼻孔滴* 0:30 放置在笼子顶部 1:00 2 第一组在左鼻孔滴* 1:15 第二套右鼻孔滴* 1:30 放置在笼子顶部 2:00 1 第三组在左鼻孔滴* 2:15 第四组右鼻孔滴* 下午2时30分地点在笼子里的治疗 3:00 2 第三组在左鼻孔滴* 3:15 第四组右鼻孔滴* 3:30 地点在笼子里的治疗

*移液器加载一次与6μl，但管理，以鼠标为2×3微升滴。

表2中。样品时间轴加药一或两只老鼠。

图1。照片的不同阶段，不同角度的鼠标醒鼻腔给药的药物。1A）按住鼠标向下用力上笼上占主导地位的手离开的肩膀夹住皮肤暴露。1B）用拇指和中指非惯用手握住，并拉起皮肤背后的肩胛骨。1C）用食指向拇指和中指（前视图）从两眼中间拉皮肤。1D）同为1C（侧视图）。1E）按住鼠标上下颠倒使用无名指和/或淡红色的尾巴将底座固定在手心。鼠标的颈部应是水平的，1F）同为E，从另一侧。1G）管理药物与20微升移液器和凝胶装载移液管尖，1H）相同为1G，特写视图。

图2。一个完整的计量站，2个单独饲养小鼠的照片，包括鼠标的两笼之间有足够的距离保持的老鼠分开，移液管器的提示，提示使用的容器，一个计时器，计量表，给药后治疗（如葵花子或麦片），卫生湿巾，P20（P10）移液器，和将交付的药物。

Discussion

此方法显示如何小鼠可以给出针对脑无麻醉使用的常规剂量的滴鼻药。滴鼻药可以提供给大组小鼠长时间以最小的努力。一个组的20只小鼠可以鼻内视为由一个人在小于一小时。了大量的分子，包括小铁螯合剂间充质干细胞的生长因子，已被证明能够迅速针对CNS，并已显示出在啮齿类动物模型的疗效。建议直接交付机制，从鼻子到大脑外运输以及嗅觉和三叉神经和散流在血管周围的空间^1,10。鼻腔给药的中枢神经系统是一个特别有用的技术，因为它不仅是快速的，但它的目标是中枢神经系统，减少全身暴露量。例如，去铁胺对大鼠鼻腔给药导致高3-19倍concentrations的大脑区域低28倍，在血液中的浓度^11。在另一个例子中，鼻内给药胰岛素提高内存在阿尔茨海默氏症患者在15分钟之内，而不改变胰岛素或葡萄糖¹²的血浆水平。一个附加的优点是鼻腔给药技术的非侵袭性的。

这种方法是有一些限制。首先，药物递送限于约20-30微升在单次给药，所以在确定剂量限值的治疗中的溶解度将发挥作用。此外，药物制剂是重要的因素，如pH值和盐度会影响交货。大偏差的自然条件，如极端的pH值和盐度，可以损害呼吸和嗅觉上皮细胞的小鼠^。13,14此外，鼻腔内的非麻醉小鼠的剂量很难掌握，可能需要几个星期的训练鼻内“定量器“能够MINIM化“头回旋余地”，实现最佳鼻内给药的药物。不正确的给药技术，药物能漏到肺或胃，可以引入变异的药物到达大脑。种种迹象表明，这已经发生呼吸困难或可视化的液体在口给药后。如果可能的话，最好是限制新的鼻内“定量器”的对照组的几个星期或几个月前他们被批准剂量的药物，由专业教练提供盐水/车辆。最后，这是有限的清醒鼻内方法对小鼠，清醒大鼠和较大的动物不容易把持，并且可以倒持时过分强调。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
P20 pipettor set at 6 μl
Gel loading pipette tips
Timer
Waste receptacle for tips
Dosing sheet for notes
Pen
Drug and vehicle
Container to hold drug vials
Animals to be dosed
Spare gloves
Paper towels to wipe urine
Table 3. Materials Needed