Summary
Werkwijze voor intranasaal toedienen drugs wakker muizen voor de targeting van de hersenen beschreven. Deze methode zorgt voor een herhaalde dosering gedurende een lange periode met behulp van intranasale toediening van het geneesmiddel zonder verdoving, en de neus-tot-brein levering met minimale systemische blootstelling.
Abstract
Intranasale toediening is een methode afgeven van therapeutische middelen aan het centrale zenuwstelsel (CNS). Het is niet-invasief en kunnen grote moleculen die niet de bloed-hersenbarrière toegang tot het CNS. Drugs zijn direct gericht op het centrale zenuwstelsel met intranasale toediening, het verminderen van de systemische blootstelling en dus ongewenste systemische bijwerkingen 1. Levering van de neus tot het CNS wordt binnen enkele minuten langs zowel de geur en trigeminale zenuwbanen via een extracellulair route en vereist geen drug te binden aan een receptor of axonale transport 2. Intranasale toediening is een ruime bekendheid methode en wordt momenteel gebruikt in klinische proeven op mensen 3.
Intranasale toediening van geneesmiddelen in diermodellen maakt eerste evaluatie van farmacokinetische verdeling en werkzaamheid. Met muizen, is het mogelijk om medicijnen toe te wekken (niet geanesthetiseerde) dieren regelmatig met een speciaseerde intranasale grip. Awake levering voordelig is omdat het mogelijk maakt voor de lange termijn chronische toediening zonder verdoving, het minder tijd kost dan bij anesthesie, en kan worden geleerd en gedaan door veel mensen, zodat teams van technici kan de dosis van grote aantallen muizen in korte tijd. Werkzaamheid van therapeutische intranasaal toegediend op deze wijze muizen is aangetoond in een aantal studies waaronder insuline in diabetische muismodellen 4-6 en deferoxamine in muizen Alzheimer's models. 7,8
De intranasale grip voor muizen kan worden geleerd, maar is niet eenvoudig en vereist oefening, vaardigheid, en een precieze grip om effectief medicijn te leveren aan de hersenen en voorkomen drainage naar de longen en de maag. Muizen worden beïnvloed door de hand met behulp van een gemodificeerde nekvel in de niet-dominante hand met de nek die evenwijdig aan de vloer, terwijl geneesmiddel wordt geleverd met een pipet met behulp van de dominante hand. Het duurt meestal 3-4 weken van acclimatiseren voor het hanteren van vóór muizenkan worden gehouden met deze grip zonder stress respons. We hebben dit Jove video om deze intranasale toediening techniek meer toegankelijk.
Protocol
1. Acclimatisatie aan Handeling voor intranasale dosering te Awake Muizen
Introductie
Muizen worden geacclimatiseerd behandeling gedurende twee tot vier weken voor het begin van intranasale toediening. Acclimatisatie aan behandeling is belangrijk, omdat het helpt zorgen voor een juiste lichaamshouding voor een maximale doeltreffendheid van wakker intranasale toediening van medicijnen. Bovendien kunnen muizen die niet goed gewend aan dit proces een ernstige angst reactie na toediening. Muizen moet besteden ongeveer 2-3 dagen op elk van negen stappen alvorens naar de volgende stap, afhankelijk van het comfort van het dier te hanteren. De muis stress worden gebruikt als een maat voor de voortgang. Dit betekent dat het toezicht op de muis de bewegingen, de hoeveelheid / frequentie van het plassen, ontlasting, beven, en bijten. Als een muis heeft een hoge stress respons, blijf op die stap voor doorgaat naar de volgende totdat de respons wordt verminderd. Een voorbeeld van een acclimatisatie schedule te zien in Tabel 1. Acclimatisering van de muizen, moet worden door de volgende keer per dag stappen. Deze stappen meerdere keren per dag, in een poging om de acclimatisering versnellen, wordt niet aanbevolen.
- Plaats de muis in de palm van de hand gedurende twee tot drie minuten niet meer dan een voet boven de kooi top aangezien dieren vaak springen tijdens deze inleidende stap. Als de muis probeert te kruipen van de hand en up one's arm, gewoon de muis optillen door de basis van de staart en plaats het terug in de hand.
- Plaats de muis in de palm van de hand gedurende drie minuten en huisdier het dier voorzichtig. Pet de muis directioneel van het hoofd naar de staart, terwijl het dier zich vrij bewegen.
- Plaats de muis in de palm van de hand gedurende drie minuten tijdens het masseren achter de oren (licht knijpen samen de huid op de rug van de nek met behulp van de duim en wijsvinger).
- Hold / lift de muis door het nekvel van de nek voor 30 sec, waardoor de muis rusten op de top kooi gedurende 30 seconden voordat men het ruim weer.
- Houd de muis met behulp van de intranasale grip, die is beschreven in hoofdstuk 2, maar niet omgekeerd het dier (in te vullen tot 2,4 stappen). Houd het dier zoals deze gedurende 30 sec en laat terug naar de kooi top. Herhaal voor de tweede keer na een minuut rust periode.
- Houd de muis met de intranasale grip, zoals beschreven in hoofdstuk 2, met inbegrip van het omkeren van de dieren, zodat de buikzijde naar boven naar het plafond. Zorg ervoor dat het dier hals is parallel aan de grond. Houd deze positie gedurende 30 sec. Herhaal dit een tweede keer na een minuut rust periode. Sommige muizen tegen de intranasale grip dan andere, vooral bij gebruik voor het eerst met inversie bij deze stap in de acclimatisering. Als de muis bevrijdt zich van de greep, zet de muis op de kooi boven-en re-grip. Herhaal de re-grip indien nodigMaar bewaken het spanningsniveau van de muis en de kooi eventueel terugkeren. Een andere factor die een rol kan spelen in het verliezen van de greep op dit punt in de acclimatisering proces is onervarenheid van de dierverzorgers met de intranasale levering techniek.
- Houd de muis met de intranasale grip, omkeren, kort plaats een pipet met een lege tip over elk neusgat, en houd de dieren positie gedurende 30 sec. Herhaal dit na een minuut rust periode.
- Houd de muis met de intranasale grip, omkeren, en intranasaal 6 pi van zoutoplossing te beheren in het linker en rechter nare zoals beschreven in paragraaf 3 (tot en met stap 3.7).
- De muis met de intranasale grip, invertsuiker, en intranasaal 6 pi zoutoplossing toe in de linker en rechter nare tweemaal plaatsen het dier weer op de kooi top daartussen zoals beschreven in sectie 3.
2. De intranasale Grip op Awake Muizen Immobiliseer
- Plaats de muis on de kooi top.
- Met de duim en wijsvinger van je dominante hand, houd de muisknop bij de staart. Gebruik uw midden ring en pink, licht pin het onderste gedeelte van het lichaam om de kooi top (Figuur 1A). Laat de muis grijpen op de bars als je licht rekken van de muis uit en beter pak de nekvel.
- Met behulp van de duim en middelvinger op de niet-dominante hand, stevig knijpen met de muis op het nekvel (overtollige huid) achter de nek en schouders. Trek de losse huid van een tent van de huid aan de overkant van de schouderbladen (Figuur 1B) te maken. Neem zo zoveel mogelijk de huid, maar wees voorzichtig niet te trekken de spieren, omdat dit zal ongemak voor de muis veroorzaken. Wees voorzichtig om niet te veel druk op borstkas van het dier of de ruggengraat van toepassing zijn. Overdruk of trekken van de huid kan leiden tot remming van de ademhaling in sommige gevallen.
- Plaats snel de wijsvinger van uw niet-dominante hand op het hoofd van de muis alsdicht bij de neus mogelijk en trek op de huid (figuur 1C, 1D). Tegelijkertijd schuift de duim en middelvinger naar de richting optimale positie. Idealiter zou de muis niet in staat zijn haar hoofd te bewegen verticaal of horizontaal.
- Met behoud van de greep op de nekvel, zet u de muis op zijn rug. De muis is terug moeten zijn in de palm van je hand. Stevig vast met de muis de staart (in de buurt van de basis) tegen je handpalm met je laatste twee vingers (ring en pink) om de muis te stabiliseren, of u kunt uw vingers over het onderlichaam (figuur 1E, 1F).
- Op dit punt ervoor zorgen dat de muis de nek en de kin zijn plat en parallel aan de vloer. De kaak moet dicht bij een 180 graden hoek met de hals zoveel mogelijk te helpen met intranasale afgifte. Kleine veranderingen in de hoek zal drug om op de verkeerde plaats. Controleer of de muis is in staat om te ademen door te kijken naar de buik. De muis should niet kunnen bewegen, maar moet comfortabel en op geen enkele pijn. Als u met de muis de nek en kin het maken van een "V", dan moet je opnieuw grip.
3. Intranasale toediening van geneesmiddelen aan Awake Muizen
Introductie
Met de intranasale grip wordt elke muis tweemaal beperkt en daar met hun nek parallel aan de grond, terwijl een volume van 20-30 gl vloeistof toegediend. Dit volume is veilig en effectief voor kleine-grote muizen, we gebruiken meestal 24 ul, en dat wordt beschreven in dit protocol. De intranasale wakker methode kan worden gebruikt in muizen van elke leeftijd, bijvoorbeeld in pasgeboren muizen ontwikkeling neurowetenschappelijk onderzoek. In pasgeboren muizen, moet een kleinere totale volume (8 pl) en druppelgrootte (1 ul) worden gebruikt om de kleinere volume van de neusholte tegemoet. Geneesmiddel wordt meestal geleverd met twee muizen op een moment, afwisselend rusttijden naar de meest efficiënte gebruik van tijd te maken en o te houdenn schema. Set-up zal een beetje anders, afhankelijk van of u de dosering groepsgewijs worden gehuisvest, muizen of individueel gehuisveste muizen. Met de individueel gehuisveste muizen, is het nuttig om al uw materialen te plaatsen in tussen de kooien om muizen te voorkomen dat de oversteek naar de andere kooi top. Met de groep gehuisvest muizen, dosis van die kooi alleen. Het is belangrijk dat elke muis in een groep ondergebracht kooi dezelfde intranasale behandeling ontvangt als mogelijke kruisbesmetting van twee verschillende behandelingen bestaat door drugs uitzetting in de lucht of huidcontact. Het is sterk aanbevolen dat een dosering vel worden afgedrukt op voorhand, om technici van de behandeling opdrachten te herinneren, tot alle notities van gemiste druppels op te nemen, om de algemene gezondheid van elk dier, enz. Opmerking
Stappen
- Stel kooien waar ze moeten zijn voor het doseren, en het opzetten van een doseerstation (figuur 2).
- Verwijder de muis uit kooi en blijf op de kooi van boven tijdens het doseren.
- Pak de muis met behulp van de intranasale greep beschreven in hoofdstuk 2.
- Met behulp van uw dominante hand, plaatst u de pipet met 6 pi van drugs of voertuig. Plaats de punt van de pipet vol nabij de muis linker neusgat, doorgaans bij een hoek van 45 graden (figuur 1G, 1H). Als je een viskeuze oplossing die u nodig heeft om uw hoek te verhogen tot 90 graden, omdat de drug kan lopen op de zijkant van de pipetpunt in plaats van het maken van een druppel. Als zeer visceus is, kan het afvegen van de pipetpunt met een tissue voor het verdrijven van vloeistof te helpen. Langzaam uitwerpen het medicijn aan een kleine druppel vormen met ongeveer de helft van het volume (3 pi).
- De druppel moet worden geplaatst dicht genoeg bij neusgat de muis, zodat de muis kan de druppel inhaleren. Onmiddellijk na de muis deze kleine druppel inhaleert, verwijdert de rest van het geneesmiddel in de pipetpunt om een kleine druppel van de muis te vormen later inhaleren door hetzelfde neusgat ongeveer 2-3 sec. Zorg ervoor dat u de mond te kijken. Als er is geen vloeistof in de mond, heeft de daling niet volledig maken in de neus en dit dient te worden opgemerkt.
- Houd de muis in deze positie gedurende 15 sec. Het is sterk aanbevolen dat een timer worden gebruikt om deze 15 sec wacht te standaardiseren.
- Herhaal de stappen 3,3 tot 3,6 voor het rechter neusgat. Als er druppels worden gesnoven out, moet die daling worden vervangen en genoteerd.
- Plaats de muis op de top van zijn kooi gedurende 2 minuten. Herhaal het hele proces begint 2 minuten. na aflevering van de eerste druppel. Dit geeft de muis vier druppels van 6 pl per totaal 24 ul oplossing. Een monster schema voor dosering een of twee muizen tegelijkertijd te zien in Tabel 2.
- Nadat de muis heeft alle druppels, de terugkeer van de muis zijn kooi.
4. Algemene Animal Handling Technieken voor acclimatisatie en intranasale toediening van het geneesmiddel aan Awake Muizen
Na elke acclimatisatie of intranasale toediening sessie moet worden geven muizenna, te behandelen, zoals een Cheerio of geschild zonnebloemzaad als positieve versterking. Treats worden gegeven als een beloning en om hen af te leiden van krabben hun neus, mogelijk schade toebrengen aan zichzelf. Bij het werken met groepsgewijs worden gehuisvest, muizen, zou voldoende traktaties worden gedropt voor elke muis. Alvorens terug te keren dieren naar de kooien moet u nesten te herstellen in hun oorspronkelijke staat om de stress te verminderen. Bij dosering groep gehuisveste dieren, moeten handschoenen worden gewijzigd tussen toediening van de kooien, zodat er geen geur te dragen van kooi naar kooi kolonie kolonie, want zij zullen worden agressief naar elkaar toe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Er zijn verschillende manieren om de effectiviteit van geneesmiddel levering. De eerste is intranasaal toedienen van een kleurstof, zoals inkt of India methyleenblauw en de kleurstof zichtbaar na euthanasie van het dier in de reukepitheel en na de hersenen worden verwijderd, die het CNS door de zeefplaat. De tweede is het meten van het geneesmiddel ofwel geleverd door een radioactief gelabelde tag of met ELISA-detectie van de gemerkte molecuul. Een goed voorbeeld van de distributie van medicijnen in het CNS na toediening aan muizen wakker vindt in Hanson et al.. 2012 7. We verwachten dat de reukkwab en driehoekszenuw een hoge concentratie van de geleverde geneesmiddel bevatten. 30 min na intranasale toediening van 3,65 umol deferoxamine concentraties in de driehoekszenuw en reukzenuw waren 29 uM en 13 uM respectievelijk. Geneesmiddelconcentraties duidelijk zal zijn in alle gebieden van de hersenen (in dit voorbeeld een range van 0,6 uM tot 4,1 pM werd gemeten) met hogere concentraties in gebieden neemt de inbreng van de reuk-en trigeminale zenuw. Bijvoorbeeld, rostrale delen van de cortex bevatten hogere concentraties dan caudale cortex en de pons bevat hogere concentraties dan de middenhersenen en medulla. In het ruggenmerg een afnemende concentratiegradiënt van cervicale lumbale wervelkolom het algemeen wordt (in dit voorbeeld een gradiënt van 1,5 pM tot 2,0 pM). Intranasale toediening resulteert ook in hoge concentraties geneesmiddel bereiken van de hersenvliezen en cervicale lymfeknopen. De derde manier om de werkzaamheid van de levering is het meten van een gedrags-of biochemische reactie op de toegediende geneesmiddel. Bijvoorbeeld, intranasale deferoxamine behandeling van Alzheimer transgene muizen resulteerde in verbeterde prestatie in een ruimtelijke geheugentaak 7 en fosforylering van glycogeen synthase kinase 3 beta 9.
| Dag | Actie | |
| 1 | M | Houd voor ~ 2-3 min |
| 2 | Tu | Houd voor ~ 2-3 min |
| 3 | W | Hold en pet ~ 2-3 min |
| 4 | Th | Hold en pet ~ 2-3 min |
| 5 | F | Licht snuifje of scruff |
| 6 | M | Licht snuifje of scruff |
| 7 | Tu | Nekvel en lift |
| 8 | W | Nekvel en lift |
| 9 | Th | Intranasale Grip |
| 10 | F | Intranasale Grip |
| 11 | M </ Td> | Intranasale (IN) Grip en omkeren |
| 12 | Tu | Intranasale (IN) Grip en omkeren |
| 13 | W | IN Grip, omkeren, plaatst u pipetpunt buurt van de neus |
| 14 | Th | IN Grip, omkeren, plaatst u pipetpunt buurt van de neus |
| 15 | F | IN Grip, omkeren, leveren een ronde zoutoplossing aan elke Nare |
| 16 | M | IN Grip, omkeren, leveren een ronde zoutoplossing aan elke Nare |
| 17 | Tu | IN Grip, omkeren, leveren 2 rondes zoutoplossing om elke Nare |
| 18 | W | IN Grip, omkeren, leveren 2 rondes zoutoplossing om elke Nare |
Tabel 1. Voorbeeld Schema voor Acclimatisering aan Handeling voor intranasale dosering te Awake Muizen.
* De pipet wordt eenmaal geladen met 6 pl, maar toegediend aan muizen als 2 x 3 pl druppels.
Tabel 2. Voorbeeld Tijdlijn voor het doseren van een of twee muizen.
Figuur 1. Foto's van verschillende stadia en de hoeken van het houden van een muis voor wakker intranasale toediening van het geneesmiddel. 1A) Houd de muis stevig op de kooi top met de dominante hand het verlaten van de schouders blootgesteld aan de huid vast te grijpen. 1B) Gebruik de duim en middelvingervan de niet-dominante hand te grijpen en trek je huid net achter de schouderbladen. 1C) de wijsvinger gebruiken om terug te trekken huid van tussen de ogen in de richting van de duim en middelvinger (vooraanzicht). 1D) Zelfde als 1C (kant view). 1E) Houd de muis om met de ringvinger en / of pink aan de basis van de staart op de palm van de hand te waarborgen. De hals van de muis moet horizontaal. 1F) Hetzelfde als E, vanaf de andere zijde. 1G) medicijn toedienen met een 20 ul pipet en gel geladen pipetpunt. 1H) Zelfde als 1G, close-up.
Figuur 2. Een foto van een volledige doseerstation voor 2 muizen afzonderlijk gehuisvest. Inbegrepen zijn de twee muis kooien met voldoende afstand tussen om de afzonderlijke muizen een pipettor met tips, een container voor gebruikte tips, een timer, doseren blad, een post-dosering te behandelen (zoals zonnebloempitten of Cheerios), sanitaire doekjes, een P20 (of P10) pipet, en het geneesmiddel te leveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze methode toont hoe muizen vaste dosis intranasale geneesmiddel aan de hersenen richten zonder de toepassing van anesthesie worden gegeven. Intranasale geneesmiddel worden geleverd aan grote groepen muizen gedurende langere tijd met een minimale inspanning. Een groep van 20 muizen intranasaal worden behandeld door een persoon in minder dan een uur. Een breed scala van moleculen, van kleine ijzerchelatoren aan groeifactoren mesenchymale stamcellen zijn aangetoond snel richten op de CNS en zijn werkzaamheid getoond bij knaagdieren modellen. Voorgestelde mechanismen van directe levering vanuit de neus naar de hersenen zijn extracellulaire transport langs de olfactorische en trigeminus zenuwen en bulk flow binnen de perivasculaire ruimten 1,10. Intranasale toediening aan het CZS is een nuttige techniek omdat het niet alleen snel, maar richt de CNS verminderen systemische blootstelling. Bijvoorbeeld intranasale toediening van deferoxamine aan ratten resulteerde in 3-19 maal hoger concentrations in hersengebieden met 28 keer lagere concentraties in het bloed 11. In een ander voorbeeld intranasaal toegediend insuline verbetert geheugen Alzheimer patiënten binnen 15 min zonder de plasma niveaus van insuline of glucose 12. Een bijkomend voordeel is de niet-invasieve intranasale toediening van de techniek.
Er zijn verschillende beperkingen aan deze methode. Eerst wordt drug delivery beperkt tot ongeveer 20-30 ul in een enkele toediening, zodat de oplosbaarheid van therapeutische een rol spelen in de dosislimieten. Ook de geneesmiddelformulering is belangrijk aangezien factoren zoals pH en zoutgehalte kunnen de productietijd. Grote afwijkingen van natuurlijke omstandigheden, zoals extreme pH en zoutgehalte, kan schade aan de luchtwegen en het olfactorische epitheel van muizen. 13,14 Verder intranasale dosering van niet-verdoofde muizen kan moeilijk zijn te beheersen, en kan een aantal weken van training te nemen voor intranasale "doseermachines "kunnen minimize "head-speelruimte" en het bereiken van een optimale intranasale dosering van het geneesmiddel. Onjuiste dosering techniek kan het geneesmiddel af in de long of de maag, die variabiliteit introduceren in drug de hersenen bereikt. Aanwijzingen dat deze zich heeft voorgedaan worden ademhalingsmoeilijkheden of visualisatie van de vloeistof in de mond na toediening. Indien mogelijk, is het raadzaam om nieuwe intranasale "doseermachines" aan het leveren van zout / voertuig met controlegroepen gedurende enkele weken of maanden voordat ze worden goedgekeurd dosis drug door deskundige trainers te beperken. Tenslotte wordt deze wakker intranasale wijze beperkt tot muizen, wakkere ratten en grotere dieren niet zo eenvoudig gegrepen en kan overdreven worden benadrukt ondersteboven worden gehouden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de HealthPartners Institutionele Animal Care bedanken en Comite Gebruik bij Regio's Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P20 pipettor set at 6 μl | |||
| Gel loading pipette tips | |||
| Timer | |||
| Waste receptacle for tips | |||
| Dosing sheet for notes | |||
| Pen | |||
| Drug and vehicle | |||
| Container to hold drug vials | |||
| Animals to be dosed | |||
| Spare gloves | |||
| Paper towels to wipe urine | |||
| Table 3. Materials Needed | |||
References
- Dhuria, S. V., Hanson, L. R., Frey, W. H. 2nd Intranasal delivery to the central nervous system: mechanisms and experimental considerations. J. Pharm Sci. 99, 1654-1673 (2010).
- Thorne, R. G., Pronk, G. J., Padmanabhan, V., Frey, W. H. 2nd Delivery of insulin-like growth factor-I to the rat brain and spinal cord along olfactory and trigeminal pathways following intranasal administration. Neuroscience. , 127-481 (2004).
- Benedict, C., et al. Intranasal insulin as a therapeutic option in the treatment of cognitive impairments. Exp. Gerontol. 46, 112-115 (2011).
- Francis, G. J., et al. Intranasal insulin prevents cognitive decline, cerebral atrophy and white matter changes in murine type I diabetic encephalopathy. Brain. 131, 3311-3334 (2008).
- Francis, G., et al. Intranasal insulin ameliorates experimental diabetic neuropathy. Diabetes. 58, 934-945 (2009).
- Marks, D. R., Tucker, K., Cavallin, M. A., Mast, T. G., Fadool, D. A. Awake intranasal insulin delivery modifies protein complexes and alters memory, anxiety, and olfactory behaviors. J. Neurosci. 29, 6734-6751 (2009).
- Hanson, L., et al. Intranasal delivery of deferoxamine reduces spatial memory loss in APP/PS1 mice. Drug Delivery and Translational Research. 2, 160-168 (2012).
- Danielyan, L., et al. Protective effects of intranasal losartan in the APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer disease. Rejuvenation Research. 13, 195-201 (2010).
- Fine, J. M., et al. Intranasal deferoxamine improves performance in radial arm water maze, stabilizes HIF-1alpha, and phosphorylates GSK3beta in P301L tau transgenic mice. Exp. Brain Res. 219, 381-390 (2012).
- Lochhead, J. J., Thorne, R. G. Intranasal delivery of biologics to the central nervous system. Adv. Drug Deliv. Rev. 64 (11), 614-628 (2012).
- Hanson, L. R., et al. Intranasal deferoxamine provides increased brain exposure and significant protection in rat ischemic stroke. J. Pharmacol. Exp Ther. 330, 679-686 (2009).
- Reger, M. A., et al. Effects of intranasal insulin on cognition in memory-impaired older adults: modulation by APOE genotype. Neurobiol. Aging. 27, 451-458 (2006).
- Kim, C. H., Song, H. yun, M, E. unA. hn, Lee, Y., G, J., Yoon, J. H. Effect of hypo-, iso- and hypertonic saline irrigation on secretory mucins and morphology of cultured human nasal epithelial cells. Acta Otolaryngol. 125, 1296-1300 (2005).
- Greiff, L., Andersson, M., Wollmer, P., Persson, C. G. Hypertonic saline increases secretory and exudative responsiveness of human nasal airway in vivo. Eur. Respir. J. 21, 308-312 (2003).
