Summary
תאר הוא תהליך תיוג שני שלבי שימוש (β-GT) β-glucosyltransferase להעביר תזיד-גלוקוז ל5-HMC, ואחרי לחץ כימיה להעביר מקשר ביוטין להעשרה קלה וצפיפות בלתי תלויה. שיטת תיוג יעילה וספציפית זו מאפשרת העשרה של 5-HMC עם רקע נמוך ביותר ומיפוי epigenomic תפוקה גבוהה באמצעות רצף של הדור הבא.
Abstract
5-methylcytosine (5-MC) מהווה ~ 2-8% מכלל cytosines בהדנ"א הגנומי אדם ומשפיע על מגוון רחב של תפקודים ביולוגיים, כולל ביטוי גנים, שמירה על שלמות הגנום, החתמה הורית, איון כרומוזום ה-X, רגולציה של פיתוח, הזדקנות וסרטן 1. לאחרונה, הנוכחות של חומץ 5-MC, 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC), התגלתה בתאי יונקים, ובעיקר בתאי גזע עובריים (ES) ותאים עצביים 2-4. 5-HMC נוצר על ידי חמצון של 5-MC קטליזאטור ידי ט משפחת הברזל (ב ') / dioxygenases α-ketoglutarate התלוי 2, 3. 5-HMC מוצע להיות מעורב בתחזוקה של תא גזע עוברי (MES), hematopoiesis וממאירויות הרגילים, והזיגוטה פיתוח 2, 5-10. כדי להבין טוב יותר את התפקוד של 5-HMC, מערכת רצף אמינה וישירה היא חיונית. רצף יסולפיט מסורתי לא מבחין בין 5-5-HMC מMC 11 12.
כאן אנו מתארים הליך פשוט שני שלבים לתיוג כימי סלקטיבית של 5-HMC. בשלב התיוג 1, 5-HMC בהדנ"א הגנומי מתויג עם קטליזאטור 6-יזיד-גלוקוז על ידי β-GT, glucosyltransferase מbacteriophage T4, באופן שמעביר את 6-תזיד-גלוקוז ל5-HMC מ העדכון cofactor, UDP-6-N3-GLC (6-N3UDPG). בצעד, biotinylation השני, מקשר ביוטין דיסולפיד מצורף לקבוצה יזיד ידי לחץ כימיה. שני פעולות ספציפיות ויעילות ביותר, שמובילות לתיוג להשלים ללא קשר לשפע של 5-HMC באזורים גנטיים ונותנים רקע נמוך ביותר. בעקבות biotinylation של 5-HMC, שברי 5-DNA המכיל HMC אז הם כבשו סלקטיביבאמצעות חרוזי streptavidin באופן עצמאי בצפיפות. שברי 5-HMC מועשרי DNA המתקבלים יכולים לשמש עבור ניתוחים במורד זרם, כוללים רצף של הדור הבא.
התיוג סלקטיבית שלנו ופרוטוקול לכידה מקנים רגישות גבוהה, החלה על כל מקור של הדנ"א הגנומי עם שכיחות משתנית / 5-HMC מגוון. אמנם המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא יישומה במורד הזרם (כלומר., הדור הבא של רצף למפות את התפלגות 5-HMC בגנום), זה תואם עם מולקולה בודדה, SMRT (DNA) רצף בזמן אמת, שהוא מסוגל לספק רזולוצית רצף יחיד בסיס של 5-HMC.
Protocol
1. פיצול הדנ"א הגנומי
הדנ"א הגנומי בר באמצעות sonication לטווח גודל רצוי מתאים לפלטפורמת רצף הגנום כולו. (בדרך כלל אנחנו sonicate ל ~ 300 נ"ב.) ודא התפלגות הגודל של הדנ"א הגנומי המקוטע ב% agarose ג'ל 1 (1 איור).
2. הכנת דנ"א
לקבוע את הסכומים המבוססים על דנ"א החל השפע של 5-HMC בהדנ"א הגנומי. מאז רמות 5-HMC להשתנות באופן משמעותי בסוגי רקמות שונים, כמויות DNA החל תלויות ברמות 5-HMC של הדגימות. אנא עיין בטבלת המס '1 לדוגמאות.
3. תגובה מזורז β-GT (תגובת העברת גלוקוז)
- מערבבים ידי pipetting את התערובת כמפורטת בטבלת 2 ולדגור ב° C אמבט מים במשך 37 שעות 1.
- לאחר דגירה, לנקות תגובה עם ערכה להסרת נוקלאוטיד QIAquick, באמצעות 10 מיקרוגרם של ה-DNA לעמודה. Elute עם מי μl 30 לעמודה ולשלב.
4. תגובת Biotinylation (לחץ כימיה)
- הוסף פתרון עובד הצמוד DBCO-SS-PEG3-ביוטין (מ"מ 1) בפתרון ה-DNA eluted (משלב 3) לריכוז סופי של 150 מיקרומטר (כלומר, 5 μl של עובד פתרון לפתרון דנ"א 30 μl).
- מערבבים ידי pipetting ולדגור ב° C אמבט מי 37 עבור 2 שעות.
- לנקות תגובה עם ערכה להסרת נוקלאוטיד QIAquick. הנפח הכולל elution האידיאלי הוא 100 μl.
- לכמת את כמות הדנ"א שנמצא באמצעות ספקטרופוטומטר ההיקף microliter (למשל., NanoDrop).
5. לכידה של 5-DNA המכיל HMC
- שטוף 50 μl של Dynabeads MyOne streptavidin C1 3 פעמים עם 1 מ"ל של 1X B & W חיץ פי הוראות היצרן. הפרד את החרוזים עם מעמד מגנטי.
- הוסף נפח שווה של 2X B & W לחיץ התאושש D biotinylatedNA (100 ul) לחרוזים והבהירים.
- דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר עם סיבוב קל על כתף.
- הפרד את החרוזים עם מעמד מגנטי ולשטוף את החרוזים 3 פעמים עם 1 מ"ל של 1X B & W חיץ.
- Elute דנ"א על ידי דוגר את החרוזים ב100 μl של DTT mM המוכן טרי 50 עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר עם סיבוב קל על כתף.
- הפרד את החרוזים עם מעמד מגנטי. לשאוב eluent ועומס על 6 טור מייקר יו ספין בהתאם להוראות הייצור להסיר DTT. DNA היעד הוא בפתרון עכשיו.
- לטהר את הדנ"א eluted מהשלב הקודם על ידי ערכת Qiagen MinElute PCR DNA וטיהור elute ב10 μl של חיץ EB. לכמת דנ"א באמצעות Fluorometer קיוביט, או NanoDrop אם הריכוז גבוה מ 20 ng / ul. ה-DNA היא מוכנה להכנת ספריית מורד הגנום רצף.
6. נציג תוצאות
אם איכות oהדנ"א הגנומי f הוא גבוה, תשואות התאוששות טיפוסיות לאחר β-GT ותגובות biotinylation הן ~ 60-70%. עם זאת, יעילות הלכידה להשתנות באופן משמעותי עם סוגי רקמות שונים בהתאם לרמות 5-HMC של הדגימות. בדרך כלל, את היעילות הלכידה להדנ"א הגנומי מוח היא ~ 4-9%, ובכמה מקרים קיצוניים, היעילות עשויה להגיע עד 12%. לתאי גזע עוברי, יעילות הלכידה הממוצעת היא ~ 2-4%, בניגוד ל~ 0.5% לתאי גזע עצביים. היעילות הנמוכה ביותר שראתה עד כה הייתה להדנ"א הגנומי מתאים סרטניים. כל הדנ"א המועשר מוכן להכנת פרוטוקולים סטנדרטיים של הדור הבא של ספרייה. בנוסף, ה-DNA שנתפס יכול לשמש גם כתבנית לPCR בזמן אמת כדי לזהות את ההעשרה של שברים מסוימים בהשוואה ל-DNA הקלט, אם את פריימרים הקשורים אינם זמינים.
איור 1. ברי sonicated אדם הגנומי DNA ב1% agarose ג'ל. 10 מיקרוגרם של הדנ"א הגנומי המבודד מתאי iPS אדם ב120 μl של 1X TE חיץ היה sonicated באמצעות מכשיר sonication (Covaris). לאחר sonication, 2 μl של דנ"א sonicated הועמס 1% agarose ג'ל באמצעות 100 נ"ב של סמן ה-DNA כדי להשוות את סדר הגודל של מקטעי דנ"א sonicated.
| רכיב | נפח | ריכוז סופי |
| מים | _ Μl | |
| 10 X הצפת תגובת β-GT | 2 μl | 1 X |
| עד הדנ"א הגנומי מיקרוגרם 10 | _ Μl | עד 500 ng / μl |
| UDP-6-3-N GLC (3 מ"מ) | 0.67 μl | 100 מיקרומטר |
| β-GT (40 מיקרומטר) | μl 1 | 2 מיקרומטר |
| נפח כולל | 20 μl |
i) להדנ"א הגנומי רקמות (תכולה גבוהה 5-HMC> 0.1%)
| רכיב | נפח | ריכוז סופי |
| מים | _ Μl | |
| 10 X הצפת תגובת β-GT | 10 μl | 1 X |
| עד הדנ"א הגנומי מיקרוגרם 20 | _ Μl | עד 500 ng / μl |
| UDP-6-N3-GLC (3 מ"מ) | μl 1.33 | 100 מיקרומטר |
| β-GT (40 מיקרומטר) | 2 μl | 2 מיקרומטר |
| נפח כולל | 40 μl |
ii) להדנ"א הגנומי תאי גזע (חציון 5-HMC תוכן ~ 0.05%)
| רכיב | נפח | ריכוז סופי |
| מים | _ Μl | |
| 10 X הצפת תגובת β-GT | 10 μl | 1 X |
| עד הדנ"א הגנומי מיקרוגרם 50 | _ Μl | עד 500 ng / μl |
| UDP-6-N3-GLC (3 מ"מ) | 3.33 μl | 100 מיקרומטר |
| β-GT (40 מיקרומטר) | 5 μl | 2 מיקרומטר |
| נפח כולל | 100 μl |
ג) לדנ"א סרטן התאים גנומית (תוכן נמוך 5-HMC ~ 0.01%)
טבלת 1. דוגמאות לסכומים של ה-DNA קלט ותגובות תיוג באמצעות דגימות עם רמות 5-HMC שונים על ידי שיטת התיוג הכימי סלקטיבית.
| מדגם | רמת 5-HMC | דנ"א החל (מיקרוגרם) | התאוששות לאחר תיוג (קלט לחרוזים) (מיקרוגרם) | תשואת שחזור | נפתח דנ"א (נ"ג) | משוך כלפי מטה תניב |
| מוח קטן עכבר בוגר | 0.4% | 10 | 7.5 | 75% | 236 | 3.1% |
| מוח קטן עכבר אחרי לידת יום 7 | 0.1% | 11 | 9 | 82% | 140 | 1.6% |
| תא עכבר ES E14 | 0.05% | 60 | 42 | 70% | 350 | 0.8% |
טבלה 2. נציג תוצאות מרקמות מוח עכבר ותאי גזע עוברי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
5-hydroxymethylcytosine (5-HMC) הוא הווה שינוי epigenetic זיהה לאחרונה בכמויות ניכרות בסוגי תאי יונקים מסוימים. השיטה שהוצגה כאן היא לקביעת חלוקת הגנום של 5-HMC. אנו משתמשים bacteriophage T4 β-glucosyltransferase להעביר מחצית גלוקוז מהונדסת המכילה קבוצה תזיד על קבוצת הידרוקסיל של 5-HMC. הקבוצה תזיד יכולה להיות שינוי כימי בביוטין לגילוי, העשרת זיקה, ורצף של מקטעי דנ"א 5-HMC המכילים בגנום של יונקים. פרוטוקול זה יש יתרונות על פני immunoprecipitation 5-HMC נוגדן המבוסס hydroxymethylated דנ"א (hMeDIP-Seq) 13-15, למרות hMeDIP הוא פשוט, יש לו נטייה חזקה לכיוון צפיפות גבוהה אזורים 5-HMC ובדרך כלל נותן תוצאות לא עקביות ממשיכה עצמאית ומורדות. השיטה שלנו לא רוצה להציג את ההטיה כזו.
יש, עם זאת, שני חששות אפשריים במונחים של התיוג שלנו וללכוד אותיthod. הדאגה הראשונה יכולה להיות ספציפית של התיוג והלכידה. מאז הדו"ח אחרון ציין כי 5-hydroxymethyluracil (5-hmU) יכול לשמש גם כמצע של β-GT, אותות חיוביים שגויים עלולים להיות הציגו, והוביל לברים מועשרים שהם ספציפיים ל5-HMC-16 התייחסות. חשש זה עשוי להיות מופרך, אם כי, מאז glycosylases הפעיל מאוד 5-hydroxymethyluracil-DNA כל זמן מסיר את הניזק הזה DNA, וכתוצאה מכך למעשה בלתי ניתן לגילוי 5-hmU בגנום של יונקי 17,18. החשש השני הוא היעילות של התיוג והלכידה. מאז רמות 5-HMC להשתנות באופן משמעותי ברקמות ותאים שונים, הנעה בין 0.5% ברקמות מוח עד 0.05% בתאי MES ו0.01% בתאים סרטניים, חשוב שהשיטות שלנו תהיינה ישימות לכל הרקמות הללו במונחים של הזרם יישומים של הדנ"א הגנומי כותרת ונתפס. הניסיון שלנו מראה כי השיטות שתוארו כאן הן אכן רגישות וספציפיותמספיק כדי לנתח את כל רקמות אלו לצורך ההשוואה או כימות המבוססת של רמות 5-HMC בין הרקמות או ליישומים במורד זרם, כגון סידור עמוק כדי למפות את ההתפלגות של 5-HMC בגנום 19-21.
המפתח לשיטה שלנו הוא השימוש בכמות מתאימה של התחלת הדנ"א הגנומי. אם ריכוז הדנ"א הגנומי הוא נמוך מדי, יעילות התיוג והספציפי תקטנה בהתאם. בהתבסס על הניסיון שלנו, למרות שהשפע של 5-HMC הוא גבוה מספיק בדנ"א מרקמות מוח, אם הריכוז נמוך מ 25 ng / μl μl 20 בתגובה, התיוג ויעילות לכידה, כמו גם את הספציפיות, יקטן באופן משמעותי. לדגימות הדנ"א נמוכות השפע, בנוסף לדרישת הריכוז, את הסכום הכולל של ה-DNA הוא חיוני כדי לקבל יעילות לכידה ספציפית גבוה ו. כך, למרות שיש צורך רק 25 ננוגרם של מקטעי דנ"א 5-HMC מועשרים לרח מורד הזרםפרוטוקולי דור ספריית andard מועסקים על ידי פלטפורמות הדור הבא של רצף, הסכום התחלתי של הדנ"א הגנומי מרקמות מוח לא צריך להיות פחות מ 2 ק"ג (וסכום המוצא האידיאלי הוא 5-10 ק"ג). באמצעות ניסוי וטעייה, יש לנו את הכמות אופטימלית המוצא של הדנ"א הגנומי מרקמות שונות בשכיחות משתנית 5-HMC להשיג יעילות תיוג גבוהה וספציפי, כמפורט בטבלה 2.
לסיכום, השיטה שלנו היא מוסמך בדיוק לתייג הגנומי 5-HMC ובמיוחד ללכוד את השברים 5-HMC המכילים, מה שהופך את פרוטוקול מוצלח במונחים של רגישות וסגולית למבחני רצף של דור הבא במורד זרם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות (GM071440 לCH וNS051630/MH076090/MH078972 לPJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Promega | V4221 | |
| 0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Promega | V4231 | |
| 1M Trizma base (Tris) pH7.5 | Invitrogen | 15567-027) | |
| HEPES 1M, pH7.4 | Invitrogen | 15630 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) 1M | Ambion | AM9530G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337-100 | |
| DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate | Click Chemistry Tools | A112P3 | |
| 1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure | Invitrogen | 15508-013 | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Micro Bio-Spin 6 Column | Bio-Rad | 732-6222 | |
| Dynabeads MyOne | Invitrogen | 650-01 | |
| Streptavidin C1 | |||
| Qiagen MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| UDP-6-N3-glucose | Active Motif | 55013 | |
| Enzyme | |||
| β-glucosyltransferase (β-GT) | New England Biolab | M0357 | |
| Equipment | |||
| Sonication device | Covaris | ||
| Desktop centrifuge | |||
| Water bath | Fisher Scientific | ||
| Gel running apparatus | Bio-Rad | ||
| NanoDrop1000 | Thermo Scientific | ||
| Labquake Tube Shaker | Barnstead | ||
| Labquake Tube Shaker | Thermolyne | ||
| Magnetic Separation Stand | Promega | Z5342 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20). | |||
References
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. , Suppl 33. 245-254 (2003).
- Ito, S. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466, 1129-1133 (2010).
- Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).
- Ko, M. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
- Koh, K. P. Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).
- Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. E. Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3642-3647 (2011).
- Wossidlo, M. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nat. Commun. 2, 241 (2011).
- Gu, T. P. The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes. Nature. 477, 606-610 (2011).
- Dawlaty, M. M. Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development. Cell Stem Cell. 9, 166-175 (2011).
- Huang, Y. The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing. PLoS One. 5, e8888 (2010).
- Song, C. X. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).
- Pastor, W. A. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473, 394-397 (2011).
- Matarese, F., Pau, C. arrillo-deS. anta, E,, Stunnenberg, H. G. 5-Hydroxymethylcytosine: a new kid on the epigenetic block. Mol. Syst. Biol. 7, 562 (2011).
- Szwagierczak, A., Bultmann, S., Schmidt, C. S., Spada, F., Leonhardt, H. Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, 181 (2010).
- Terragni, J., Bitinaite, J., Zheng, Y., Pradhan, S. Biochemical characterization of recombinant β-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes. Biochemistry. , (2012).
- Rusmintratip, V., Sowers, L. C. An unexpectedly high excision capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human cell extracts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).
- Globisch, D. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367 (2010).
- Yildirim, O. Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells. Cell. 147, 1498-1510 (2011).
- Szulwach, K. E. Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells. PLoS Genet. 7, e1002154 (2011).
- Szulwach, K. E. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nat. Neurosci. 14, 1607-1616 (2011).
