Summary
描述的是一个两步骤的标记过程中使用的β-葡糖基转移酶（β-GT）来传输的叠氮化物5-HMC-葡萄糖，然后通过点击化学生物素链接器为容易和密度独立富集转移。这种高效的和具体的标记方法使富集5 - HMC具有极低的背景和高通量表观映射的通过新一代测序。
Abstract
5 - 甲基胞嘧啶（5-MC）构成约2-8％，总在人类基因组DNA胞嘧啶和影响广泛的生物学功能，包括基因表达，维持基因组的完整性，亲本印记，X染色体失活，调节发育，衰老和癌症。最近，氧化的5-MC，5 -羟甲基胞嘧啶（5-HMC），存在下，在哺乳动物细胞中被发现，特别是在胚胎干（ES）细胞和神经元细胞2-4。 TET家族铁（II）/α-酮戊二酸依赖性双加氧酶2，3 5-MC催化氧化所产生的5-HMC。 5-HMC提出参与胚胎干细胞（MES），正常的造血和恶性肿瘤，和受精卵开发2，5-10维护。为了更好地理解5-HMC的功能，可靠的和直接测序系统是必不可少的。传统的亚硫酸氢钠测序可以不区分5-HMC从5-MC 11 12。
在这里，我们描述一个简单的两步骤程序选择性化学标记的5-HMC。在第一标记步骤中，基因组DNA中的5-HMC被标记为与6 - 叠氮-葡萄糖催化β-GT，葡糖基转移酶从T4噬菌体，在从一种方式，将6 - 叠氮-葡萄糖以5-HMC改性的辅助因子，：UDP-6-N3-Glc的（6-N3UDPG）。在第二步骤中，生物素化，二硫键的生物素连接器附着的叠氮基，通过点击化学。这两个步骤是非常具体的，高效的，从而完成标签，无论5-HMC丰富的基因组区域和极低的背景。生物素化的5 - HMC后，5-HMC-含DNA片段，然后选择性地捕获使用抗生蛋白链菌素珠粒的密度无关的方式。所得的5-HMC-富集的DNA片段可用于下游分析，包括下一代测序。
我们的选择性标记和捕获协议赋予高灵敏度，适用于任何变量/ 5-HMC不同丰度的基因组DNA的来源。虽然此协议的主要目的，是其下游的应用程序（ 即 ，下一代测序绘制出了在基因组的5-HMC分布），它是兼容的单分子实时SMRT（DNA）测序，这是能够提供单碱基分辨率的测序5 - HMC。
Protocol
1。基因组DNA碎片
适合的全基因组测序平台使用所希望的大小范围内的超声处理的片段的基因组DNA。 （我们通常超声〜300个基点。）验证的粒度分布零散的基因组DNA，1％琼脂糖凝胶电泳（ 图1）。
2。 DNA的制备
确定起始DNA金额5-HMC丰富的基因组DNA的基础上。由于5 - HMC水平的显着不同组织类型的不同，启动DNA金额的依赖样品5-HMC水平。请参阅表1的例子。
3。 β-GT催化反应（葡萄糖转移反应）
- 混匀移液混合物，详情载于表2和孵化，在37°C水浴1小时。
- 培养结束后，清理用QIAquick核苷酸去除试剂盒的反应，使用10微克的DNA每列。每列30μl水洗脱结合起来。
4。生物素化反应（点击化学）
- 添加DBCO-SS-PEG3-生物素共轭的工作溶液（1mM）中洗脱的DNA溶液（从步骤3）至最终浓度为150μM（ 即 ，每30微升DNA溶液的工作溶液的5微升）。
- 混合移液和孵育在37℃水浴2小时。
- 清理用QIAquick核苷酸去除试剂盒的反应。理想的总洗脱体积为100微升。
- 量化使用回收的DNA量微升规模分光光度计（ 如 。的NanoDrop）。
5。含HMC-DNA捕获
- 50微升的Dynabeads MyOne链霉亲和素C1 3次洗净，用1ml 1X B＆W缓冲液根据制造商的说明。珠粒分离的磁性的立场。
- 加入等体积的2倍B＆W缓冲恢复的生物素化ðNA（100微升）洗过的小珠。
- 孵育15分钟，在室温下在旋转器上轻轻旋转。
- 带有磁性支架分隔珠粒珠粒和洗3次，用1毫升1X B＆W缓冲。
- 洗脱DNA孵育中的小珠100微升新鲜制备的50mM的DTT为2小时，在室温下在旋转器上轻轻旋转。
- 珠粒分离的磁性的立场。吸取洗脱液和负载到微生物分拆列根据生产指令删除DTT。现在是在溶液中的目标DNA。
- 净化从以前的步骤由Qiagen公司MinElute PCR纯化试剂盒进行纯化，洗脱的DNA在10μlEB缓冲液洗脱的DNA。量化DNA荧光量子比特，或的NanoDrop如果浓度高于20毫微克/ UL。 DNA是下游的全基因组测序文库制备做好准备。
6。代表性的成果
如果质量Øf基因组DNA是高的，典型的β-GT和生物素化反应后恢复产量约60-70％。然而，捕获效率取决于样品5-HMC水平与不同的组织类型的显着变化。通常情况下，脑组织的基因组DNA的捕获效率是〜4-9％，并且在一些极端的情况下，效率可高达12％。对于ES细胞，平均捕获效率是〜2-4％，在对比〜0.5％的神经干细胞。效率最低为癌症细胞的基因组DNA。所有丰富的DNA是准备为下一代标准库准备协议。此外，也可以使用所捕获的DNA作为模板的实时PCR检测到输入DNA相比，富集的一些片段，如果相关的引物是可用的。
图1。经声波处理的人基因组DNA片段在1％琼脂糖凝胶电泳。10μg的人iPS细胞在120μl的1X TE缓冲液中分离出的基因组DNA，使用超声波处理装置（Covaris）超声处理。超声处理后，2微升的超声处理的DNA加载到1％琼脂糖凝胶上，使用100 bp的DNA标记，用来比较的超声处理的DNA片段的大小。
| 元件 | 量 | 终浓度 |
| 水 | _微升 | |
| 10 Xβ-GT反应缓冲液 | 2微升 | 1 X |
| 高达10微克基因组DNA的 | _微升 | 高达500纳克/微升 |
| UDP-6-N 3 -葡萄糖（3毫摩） | 0.67微升 | 100μM |
| β-GT（40μM） | 1微升 | 2μM |
| 总成交量 | 20微升 |
i）对于组织基因组DNA（5-HMC含量> 0.1％）
| 元件 | 量 | 终浓度 |
| 水 | _微升 | |
| 10 Xβ-GT反应缓冲液 | 10微升 | 1 X |
| 高达20微克基因组DNA的 | _微升 | 高达500纳克/微升 |
| UDP-6-N3-葡萄糖（3毫摩） | 1.33微升 | 100μM |
| β-GT（40μM） | 2微升 | 2μM |
| 总成交量 | 40微升 |
ii）对于干细胞的基因组DNA（中位数为5-HMC含量约为0.05％）
| 元件 | 量 | 终浓度 |
| 水 | _微升 | |
| 10 Xβ-GT反应缓冲液 | 10微升 | 1 X |
| 高达50μg的基因组DNA的 | _微升 | 高达500纳克/微升 |
| UDP-6-N3-葡萄糖（3毫摩） | 3.33微升 | 100μM |
| β-GT（40μM） | 5微升 | 2μM |
| 总成交量 | 100微升 |
iii）对于癌症细胞基因组DNA（5-HMC低含量约0.01％）
表1作为输入的DNA的量的和使用的样本的标记反应通过选择性化学标记方法与各种5-HMC水平。
| 样品 | 5 HMC水平的 | 开始的DNA（微克） | 恢复后的标签（输入珠）（微克） | 回收率 | 下拉DNA（纳克） | 下拉产量 |
| 成年小鼠小脑 | 0.4％ | 10 | 7.5 | 75％ | 236 | 3.1％ |
| 产后第7天小鼠小脑 | 0.1％ | 11 | 9 | 82％ | 140 | 1.6％ |
| 小鼠胚胎干细胞E14 | 0.05％ | 60 | 42 | 70％ | 350 | 0.8％ |
表2中。从小鼠脑组织和ES细胞的代表性的结果。
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Discussion
5 - 羟甲基胞嘧啶（5-HMC）是最近确定的表观遗传修饰在某些哺乳动物的细胞类型中的大量存在。这里介绍的方法是确定基因组中广泛分布的5-HMC。我们使用T4噬菌体的β-葡糖基转移酶，转移含有叠氮基团上的羟基基团的5-HMC一个精心设计的葡萄糖部分。叠氮基团，可以通过化学方法用生物素修饰，用于检测，亲和富集，和5-HMC-含在哺乳动物基因组的DNA片段测序。该协议具有优势超过5 HMC抗体为基础的羟甲基化DNA免疫沉淀（hMeDIP-SEQ）13-15，，虽然hMeDIP是简单的，它有很强的偏向高密度5-HMC地区，并给出了不一致的结果，从独立拉起伏。我们的方法将不采用这种偏见。
然而，有两种可能的问题，在我们的标签和捕捉我thod。第一个问题可能是特异性的标记和捕获。由于最近的一份报告表明，5 -羟甲基（5 - HMU）也可以作为β-GT的基板，假阳性信号可能被引入，导致富集5-HMC相关性16是非特异性的片段。虽然，这种担忧可能是没有根据的，因为高活性的5 -羟甲基-DNA糖基化酶不断消除DNA损伤，造成基本上检测不到5 HMU在哺乳动物的基因组17,18。第二个问题是：在标签和采集的效率。由于5-HMC水平在不同的组织和细胞中显着不同，范围从在mES细胞的脑组织中的0.5％到0.05％和0.01％的在肿瘤细胞中，至关重要的是，我们的方法是适用于所有这些组织在下游标记和捕获的基因组DNA的应用。我们的经验表明，这里描述的方法是敏感和特异的足以分析所有这些组织为5-HMC水平之间的组织或下游的应用程序，如深度测序在基因组中的分布映射的5-HMC 19-21任定量基于比较的目的。
我们的方法的关键是使用适当量的基因组DNA开始。如果基因组DNA的浓度过低时，标记的效率和特异性会相应减少。根据我们的经验，即使5-HMC的丰度是足够高，从脑组织的DNA，如果该浓度低于25纳克/微升，在20μl的反应中，标签和捕获效率，以及特异性，将显着降低。对于低丰度的DNA样品，在此外的浓度要求，DNA的总量是必不可少的，以获得高和特定的捕获效率。因此，虽然只需要25毫微克5-HMC-富集的DNA片段的下游第一andard库代协议的新一代测序平台，从脑组织基因组DNA的起始量应不超过2微克（和理想的起点金额为5至10微克）。通过试验和错误，我们已经优化了不同的组织基因组DNA的起始量与变量5-HMC丰度，以获得高的标记效率和特异度， 详见表2。
总之，我们的方法是合格的精确标记基因组5-HMC和专门捕捉，使其成为一个成功的协议，在下游新一代测序检测的敏感性和特异性5-HMC的片段。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项研究是支持的，部分由美国国立卫生研究院（GM071440 CH和NS051630/MH076090/MH078972的PJ）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Promega | V4221 | |
| 0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Promega | V4231 | |
| 1M Trizma base (Tris) pH7.5 | Invitrogen | 15567-027) | |
| HEPES 1M, pH7.4 | Invitrogen | 15630 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) 1M | Ambion | AM9530G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337-100 | |
| DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate | Click Chemistry Tools | A112P3 | |
| 1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure | Invitrogen | 15508-013 | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Micro Bio-Spin 6 Column | Bio-Rad | 732-6222 | |
| Dynabeads MyOne | Invitrogen | 650-01 | |
| Streptavidin C1 | |||
| Qiagen MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| UDP-6-N3-glucose | Active Motif | 55013 | |
| Enzyme | |||
| β-glucosyltransferase (β-GT) | New England Biolab | M0357 | |
| Equipment | |||
| Sonication device | Covaris | ||
| Desktop centrifuge | |||
| Water bath | Fisher Scientific | ||
| Gel running apparatus | Bio-Rad | ||
| NanoDrop1000 | Thermo Scientific | ||
| Labquake Tube Shaker | Barnstead | ||
| Labquake Tube Shaker | Thermolyne | ||
| Magnetic Separation Stand | Promega | Z5342 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20). | |||
References
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. , Suppl 33. 245-254 (2003).
- Ito, S. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466, 1129-1133 (2010).
- Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).
- Ko, M. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
- Koh, K. P. Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).
- Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. E. Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3642-3647 (2011).
- Wossidlo, M. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nat. Commun. 2, 241 (2011).
- Gu, T. P. The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes. Nature. 477, 606-610 (2011).
- Dawlaty, M. M. Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development. Cell Stem Cell. 9, 166-175 (2011).
- Huang, Y. The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing. PLoS One. 5, e8888 (2010).
- Song, C. X. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).
- Pastor, W. A. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473, 394-397 (2011).
- Matarese, F., Pau, C. arrillo-deS. anta, E,, Stunnenberg, H. G. 5-Hydroxymethylcytosine: a new kid on the epigenetic block. Mol. Syst. Biol. 7, 562 (2011).
- Szwagierczak, A., Bultmann, S., Schmidt, C. S., Spada, F., Leonhardt, H. Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, 181 (2010).
- Terragni, J., Bitinaite, J., Zheng, Y., Pradhan, S. Biochemical characterization of recombinant β-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes. Biochemistry. , (2012).
- Rusmintratip, V., Sowers, L. C. An unexpectedly high excision capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human cell extracts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).
- Globisch, D. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367 (2010).
- Yildirim, O. Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells. Cell. 147, 1498-1510 (2011).
- Szulwach, K. E. Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells. PLoS Genet. 7, e1002154 (2011).
- Szulwach, K. E. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nat. Neurosci. 14, 1607-1616 (2011).
