Summary
Beschreven is een twee stappen proces labeling met β-glucosyltransferase (β-GT) een azide-glucose dragen aan 5-HMC, gevolgd door een klik chemie biotine linker gemakkelijk en dichtheid onafhankelijk verrijking brengen. Deze efficiënte en specifieke etiketteringsvoorschriften methode maakt het mogelijk verrijking van 5-HMC met extreem lage achtergrond en high-throughput epigenomisch mapping vinden plaats via next-generation sequencing.
Abstract
5-methylcytosine (5-mC) vormt ~ 2-8% van de totale cytosines in menselijk genomisch DNA en beïnvloedt een breed scala aan biologische functies, inclusief genexpressie, het behoud van de integriteit genoom, ouderlijke imprinting, X-chromosoom inactivatie, regulering van ontwikkeling, de vergrijzing, en kanker 1. Onlangs werd de aanwezigheid van een geoxideerd 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (HMC 5), ontdekt in zoogdiercellen, met name in embryonale stam (ES) cellen en neuronale cellen 2-4. 5-HMC wordt gegenereerd door oxidatie van 5-mC gekatalyseerd door TET familie ijzer (II) / α-ketoglutaraat afhankelijke dioxygenases 2, 3. 5-HMC voorgesteld worden met het onderhoud van embryonale stamcellen (MES) cel, normale hematopoiese en maligniteiten en zygote ontwikkeling 2, 5-10. Om beter te begrijpen van de functie van 5-HMC, een betrouwbare en eenvoudig sequencing is essentieel. Traditionele bisulfiet sequencing kunnen geen onderscheid maken 5-HMC van 5-MC 11 12.
Hier beschrijven we een eenvoudige twee stappen voor selectieve chemische labeling van 5-HMC. In de eerste stap labeling wordt 5-HMC in genomisch DNA gelabeld met een 6-azide-glucose gekatalyseerd door β-GT, een glucosyltransferase van T4 bacteriofaag, op een manier die de 6-azide-glucose overdraagt aan HMC 5 van de gemodificeerde cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In de tweede stap biotinylering wordt een disulfide linker biotine aan de azidegroep door klikken chemie. Beide stappen zijn zeer specifiek en efficiënt, waardoor Uitgebreide beschrijving ongeacht de overvloed van 5-HMC in genoomgebieden en geeft zeer lage achtergrond. Na biotinylering van 5-HMC, de 5-HMC bevattende DNA-fragmenten worden vervolgens selectief gevangenmet streptavidine beads in een dichtheid-onafhankelijke manier. De resulterende 5-HMC verrijkte DNA-fragmenten kunnen worden gebruikt voor downstream analyses, met inbegrip volgende generatie sequencing.
Onze selectieve etikettering en capture-protocol verleent een hoge gevoeligheid, van toepassing zijn op elke bron van genomisch DNA met een variabele / diverse 5-HMC abundanties. Hoewel het belangrijkste doel van dit protocol is de downstream toepassing (dat wil zeggen., Next-generation sequencing in kaart te brengen van de 5-HMC distributie in genoom), het is compatibel met single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, dat is kan leveren single-basisresolutie sequencing van 5-HMC.
Protocol
1. Genomisch DNA Fragmentation
Fragment genomisch DNA met sonificatie om een gewenst groottebereik geschikt voor genoomwijde sequencing platform. (We meestal ultrasone trillingen ~ 300 bp.) Controleer de grootteverdeling van de gefragmenteerde genomisch DNA op 1% agarose gel (figuur 1).
2. DNA Bereiding
Bepaal het uitgangs-DNA bedragen op basis van de overvloed van 5-HMC in genomisch DNA. Aangezien 5-HMC niveaus variëren sterk in verschillende weefseltypen, uitgangs-DNA hoeveelheden hangen af van de 5-HMC niveau van de monsters. Zie tabel 1 voor voorbeelden.
3. β-GT gekatalyseerde reactie (Glucose Transfer Reaction)
- Mix door pipetteren het mengsel zoals uiteengezet in tabel 2 en incubeer in een 37 ° C waterbad gedurende 1 uur.
- Na incubatie schoonmaken van de reactie met QIAquick Nucleotide Removal Kit, met 10 ug DNA perkolom. Elueer met 30 pi water per kolom en combineren.
4. Biotinylatie Reactie (Instructies Chemie)
- Voeg DBCO-SS-biotine conjugaat PEG3-werkoplossing (1 mM) in het geëlueerde DNA (uit stap 3) tot een eindconcentratie van 150 uM (dwz 5 pi werkoplossing per 30 ul DNA oplossing).
- Meng door pipetteren en incubeer in een 37 ° C waterbad gedurende 2 uur.
- Het schoonmaken van de reactie met QIAquick Nucleotide Removal Kit. Het ideale totale elutievolume is 100 pl.
- Kwantificeer de herstelde DNA hoeveelheid met behulp van microliter schaal spectrofotometer (bijv.., NanoDrop).
5. Vangst van 5-HMC-bevattend DNA
- Wassen 50 pi Dynabeads MyOne Streptavidin C1 3 keer met 1 ml 1X B & W buffer volgens de fabrikant. Scheid de kralen met een magnetische standaard.
- Voeg gelijk volume 2 x B & W buffer de herstelde gebiotinyleerde DNA (100 ul) aan de gewassen korrels.
- Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur onder zacht rotatie op een rotator.
- Scheid de kralen met een magnetische standaard en was de kralen 3 maal met 1 ml 1X B & W buffer.
- Elueer het DNA door het incuberen van de parels in 100 pl vers bereide 50 mM DTT gedurende 2 uur bij kamertemperatuur onder zacht rotatie op een rotator.
- Scheid de kralen met een magnetische standaard. Zuig het eluent en de belasting op een Micro Bio-Spin Column 6 volgens de instructie aan de vervaardiging DTT verwijderen. Het doelwit DNA in de oplossing nu.
- Zuiver het geëlueerde DNA van de vorige stap Qiagen MinElute PCR Purification Kit en elueer DNA in 10 pl EB buffer. Kwantificeren DNA met Qubit Fluorometer of NanoDrop indien de concentratie hoger dan 20 ng / ul. Het DNA is klaar voor downstream genoom-wijde sequencing bibliotheek voorbereiding.
6. Representatieve resultaten
Indien de kwaliteit of genomisch DNA is hoog, de typische hersteltijden opbrengsten na de β-GT en biotinylatie reacties zijn ~ 60-70%. De afvangrendement sterk verschillen met verschillende weefseltypes afhankelijk van de 5-HMC niveau van de monsters. Kenmerkend voor de afvangrendement hersenen genomisch DNA ~ 4-9% en in sommige extreme gevallen de efficiency kan oplopen tot 12%. Voor ES cellen was de gemiddelde afvangrendement is ~ 2-4%, in tegenstelling tot ~ 0,5% voor neurale stamcellen. Het zien laagste rendement tot nu toe was voor genomisch DNA van kankercellen. Alle verrijkte DNA is klaar voor standaard de volgende generatie bibliotheek voorbereiding protocollen. Bovendien kan de vastgelegde DNA worden gebruikt als template voor real-time PCR voor de verrijking van bepaalde fragmenten vergeleken met de uitgangs-DNA, detecteren of de desbetreffende primers beschikbaar.
Figuur 1. Gesoniceerd humane genomische DNA-fragmenten in1% agarose gel. 10 ug genomisch DNA geïsoleerd uit menselijke iPS cellen in 120 pi 1X TE buffer werd gesoniceerd met een sonicatie apparaat (Covaris). Na sonicatie, werd 2 pi van de gesoniceerd DNA geladen 1% agarose gel met 100 bp van DNA marker van de afmetingen van de gesoniceerd DNA fragmenten te vergelijken.
| Bestanddeel | Volume | Eindconcentratie |
| Water | _ Pl | |
| 10 X β-GT Reaction Buffer | 2 pi | 1 X |
| Tot 10 ug genomisch DNA | _ Pl | Tot 500 ng / pl |
| UDP-6-N 3-Glc (3 mM) | 0,67 ul | 100 uM |
| β-GT (40 uM) | 1 pi | 2 uM |
| Totaal volume | 20 pi |
i) Voor weefsel genomisch DNA (hoog 5-HMC gehalte> 0,1%)
| Bestanddeel | Volume | Eindconcentratie |
| Water | _ Pl | |
| 10 X β-GT Reaction Buffer | 10 pi | 1 X |
| Tot 20 ug genomisch DNA | _ Pl | Tot 500 ng / pl |
| UDP-6-N3-Glc (3 mM) | 1,33 ul | 100 uM |
| β-GT (40 uM) | 2 pi | 2 uM |
| Totaal volume | 40 pi |
ii) Voor stamceltransplantatie genomisch DNA (mediaan 5-HMC gehalte ~ 0,05%)
| Bestanddeel | Volume | Eindconcentratie |
| Water | _ Pl | |
| 10 X β-GT Reaction Buffer | 10 pi | 1 X |
| Tot 50 ug genomisch DNA | _ Pl | Tot 500 ng / pl |
| UDP-6-N3-Glc (3 mM) | 3,33 ul | 100 uM |
| β-GT (40 uM) | 5 pi | 2 uM |
| Totaal volume | 100 pi |
iii) Voor kankercel genomisch DNA (lage 5-HMC gehalte ~ 0,01%)
Tabel 1. Voorbeelden van hoeveelheden input-DNA en labelingsreacties met de monsters met verschillende 5-HMC niveau van de selectieve chemische labelingsmethode.
| Monster | 5-HMC niveau | Uitgangs-DNA (ug) | Herstel na labeling (dwz in beads) (ug) | Herstel rendement | Pull-down DNA (ng) | Pull-down opleveren |
| Volwassen muis cerebellum | 0,4% | 10 | 7,5 | 75% | 236 | 3,1% |
| Postnatale dag 7 muis cerebellum | 0,1% | 11 | 9 | 82% | 140 | 1,6% |
| Muis ES-cel E14 | 0,05% | 60 | 42 | 70% | 350 | 0,8% |
Tabel 2. Representatieve resultaten van muizenhersenen weefsels en embryonale stamcellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
5-hydroxymethylcytosine (HMC 5) is een recent geïdentificeerde epigenetische modificatie in aanzienlijke hoeveelheden in bepaalde types zoogdiercel. De methode die hier wordt gepresenteerd voor het bepalen van het genoom-brede distributie van 5-HMC. We gebruiken T4 bacteriofaag β-glucosyltransferase een gemanipuleerde glucose rest met een azidegroep op de hydroxylgroep van 5-HMC brengen. De azidegroep kan chemisch worden gemodificeerd met biotine voor de detectie, affiniteitsverrijking en sequencing van 5-HMC bevattende DNA-fragmenten in zoogdier genomen. Dit protocol heeft voordelen ten opzichte van 5-HMC antilichaam-gebaseerde hydroxymethylated DNA immunoprecipitatie (hMeDIP-Seq) 13-15, hoewel de hMeDIP is eenvoudig, het een sterke voorkeur voor high-density 5-HMC-gebieden heeft en meestal geeft inconsistente resultaten van onafhankelijke pull -downs. Onze methode zou niet introduceren, bias.
Er zijn echter twee mogelijke problemen op het vlak van onze etikettering en vast te leggen meThOD. De eerste zorg zou de specificiteit van de etikettering en de capture te zijn. Aangezien een recent rapport geeft aan dat 5-hydroxymethyluracil (5-HMU) ook kan dienen als een substraat van β-GT kan vals-positieve signalen, wat leidde tot verrijkte fragmenten die aspecifieke aan 5-HMC-relatedness 16. Deze zorg zou kunnen zijn ongegrond, hoewel, omdat zeer actieve 5-hydroxymethyluracil-DNA glycosylases constant verwijderen van deze DNA-schade, wat resulteert in wezen niet detecteerbaar 5-HMU in zoogdiergenoom 17,18. Het tweede punt van zorg is de efficiëntie van de etikettering en de vangst. Aangezien 5-HMC niveaus variëren sterk in verschillende weefsels en cellen, variërend van 0,5% in hersenweefsel tot 0,05% in MES-cellen en 0,01% in kankercellen, is het essentieel dat onze werkwijze voor al deze weefsels in termen van de downstream toepassingen van het gemerkte en gevangen genomisch DNA. Onze ervaring leert dat de methoden die hier beschreven zijn inderdaad gevoelig en specifiekgenoeg om al deze weefsels te analyseren ten behoeve van zowel kwantificering gebaseerde vergelijking van 5-HMC niveaus van de weefsels of downstream toepassingen, zoals diepe sequencing de verdeling van de 5-HMC kaart in het genoom 19-21.
De sleutel tot onze methode is het gebruik van een geschikte hoeveelheid uitgangsmateriaal genomisch DNA. Indien het genomische DNA concentratie te laag is, zal de labelingsefficiëntie en specificiteit dus af. Gebaseerd op onze ervaring, ofschoon de overvloed van 5-HMC hoog genoeg in DNA van hersenweefsel als de concentratie lager dan 25 ng / ul in 20 ul van de reactie, de etikettering en capture efficiëntie en de specificiteit, zal aanzienlijk worden verminderd. Voor de lage abundantie DNA monsters, naast de concentratie eis, de totale hoeveelheid DNA is essentieel om hoge en specifieke capture efficiency. Ofschoon heeft men slechts 25 ng van 5-HMC verrijkte DNA fragmenten voor de downstream stAndard bibliotheek generatie protocollen in dienst van next-generation sequencing platforms, moet het basisbedrag van genomisch DNA uit de hersenen weefsels niet minder zijn dan 2 ug (en het ideale vertrekpunt hoeveelheid is 5-10 ug). Met vallen en opstaan hebben we geoptimaliseerd het basisbedrag van genomisch DNA uit verschillende weefsels met variabele 5-HMC abundanties aan hoge etikettering efficiëntie en specificiteit te krijgen, als omschreven in tabel 2.
Samengevat is onze methode gekwalificeerd om precies te labelen genomische 5-HMC en specifiek vastleggen van de 5-HMC-bevattende fragmenten, waardoor het een succesvol protocol ten aanzien van sensitiviteit en specificiteit voor downstream-next-generation sequencing assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd mede ondersteund door de National Institutes of Health (GM071440 naar CH en NS051630/MH076090/MH078972 naar PJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Promega | V4221 | |
| 0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Promega | V4231 | |
| 1M Trizma base (Tris) pH7.5 | Invitrogen | 15567-027) | |
| HEPES 1M, pH7.4 | Invitrogen | 15630 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) 1M | Ambion | AM9530G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337-100 | |
| DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate | Click Chemistry Tools | A112P3 | |
| 1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure | Invitrogen | 15508-013 | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Micro Bio-Spin 6 Column | Bio-Rad | 732-6222 | |
| Dynabeads MyOne | Invitrogen | 650-01 | |
| Streptavidin C1 | |||
| Qiagen MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| UDP-6-N3-glucose | Active Motif | 55013 | |
| Enzyme | |||
| β-glucosyltransferase (β-GT) | New England Biolab | M0357 | |
| Equipment | |||
| Sonication device | Covaris | ||
| Desktop centrifuge | |||
| Water bath | Fisher Scientific | ||
| Gel running apparatus | Bio-Rad | ||
| NanoDrop1000 | Thermo Scientific | ||
| Labquake Tube Shaker | Barnstead | ||
| Labquake Tube Shaker | Thermolyne | ||
| Magnetic Separation Stand | Promega | Z5342 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20). | |||
References
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. , Suppl 33. 245-254 (2003).
- Ito, S. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466, 1129-1133 (2010).
- Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).
- Ko, M. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
- Koh, K. P. Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).
- Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. E. Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3642-3647 (2011).
- Wossidlo, M. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nat. Commun. 2, 241 (2011).
- Gu, T. P. The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes. Nature. 477, 606-610 (2011).
- Dawlaty, M. M. Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development. Cell Stem Cell. 9, 166-175 (2011).
- Huang, Y. The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing. PLoS One. 5, e8888 (2010).
- Song, C. X. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).
- Pastor, W. A. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473, 394-397 (2011).
- Matarese, F., Pau, C. arrillo-deS. anta, E,, Stunnenberg, H. G. 5-Hydroxymethylcytosine: a new kid on the epigenetic block. Mol. Syst. Biol. 7, 562 (2011).
- Szwagierczak, A., Bultmann, S., Schmidt, C. S., Spada, F., Leonhardt, H. Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, 181 (2010).
- Terragni, J., Bitinaite, J., Zheng, Y., Pradhan, S. Biochemical characterization of recombinant β-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes. Biochemistry. , (2012).
- Rusmintratip, V., Sowers, L. C. An unexpectedly high excision capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human cell extracts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).
- Globisch, D. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367 (2010).
- Yildirim, O. Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells. Cell. 147, 1498-1510 (2011).
- Szulwach, K. E. Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells. PLoS Genet. 7, e1002154 (2011).
- Szulwach, K. E. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nat. Neurosci. 14, 1607-1616 (2011).
