Summary
Описывается два шага маркировки процесса с использованием β-glucosyltransferase (β-GT), чтобы передать азид-глюкозы до 5-HMC, а затем нажмите химия для передачи биотин компоновщика для легкой и плотности независимых обогащения. Это эффективный и конкретный маркировки метод позволяет обогащению 5-HMC с крайне низким фоном и высокой пропускной эпигеномном отображения с помощью следующего поколения секвенирования.
Abstract
5-метилцитозин (5-MC) составляет ~ 2-8% от общего цитозина в геномной ДНК человека и влияет на широкий спектр биологических функций, включая экспрессию генов, поддержание целостности генома, родительского импринтинга, инактивации Х-хромосомы, регуляция развития, старения и рака 1. В последнее время в присутствии окисленного 5-тС, 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC), был обнаружен в клетках млекопитающих, в частности, в эмбриональных стволовых (ЭС) клеток и нервных клеток 2-4. 5-HMC образуется при окислении 5-тС катализируемой ТЕТ семьи железа (II) / α-КГ-зависимых диоксигеназ 2, 3. 5-HMC предлагается принять участие в поддержании эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) клетки, нормального кроветворения и злокачественных новообразований, а также развития зиготы 2, 5-10. Чтобы лучше понять функции 5-HMC, надежный и простой последовательности системы имеет важное значение. Традиционная последовательность бисульфита не могут отличить 5-HMC из 5-тС 11 12.
Здесь мы опишем простой двухэтапной процедуры для селективного маркировки химической 5-HMC. На первом этапе маркировки, 5-HMC в геномной ДНК помечена с 6-азид-глюкозы, катализируемой β-GT, glucosyltransferase из бактериофага Т4, таким образом, что переводит 6-азид-глюкозы до 5-HMC из Изменения кофактора, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). На втором этапе, биотинилирование, линкер дисульфида биотин прикреплен к азид группу, нажав на кнопку химии. Оба шага весьма конкретные и эффективные, ведущие к полному маркировке независимо от обилия 5-HMC в геномных регионов и дает крайне низкий фон. После биотинилирования 5-HMC, 5-HMC-содержащих фрагменты ДНК затем выборочно захваченныеиспользованием стрептавидина бусы в плотности независимым образом. Полученный 5-HMC-обогащенного фрагменты ДНК могут быть использованы для последующего анализа, в том числе следующего поколения секвенирования.
Наш избирательный маркировки и захват протокол дает высокую чувствительность, применимы к любому источнику геномной ДНК с переменным / разнообразна 5-HMC содержания. Хотя основной целью этого протокола является его вниз по течению приложений (например,. Следующего поколения секвенирования, чтобы наметить 5-HMC распределение в геноме), она совместима с одной молекулой, в режиме реального времени SMRT (ДНК) последовательность, которая является способные доставлять одной базе резолюции последовательности 5-HMC.
Protocol
1. Геномной ДНК фрагментации
Фрагмент геномной ДНК с использованием ультразвука до нужного размера диапазона подходит для генома последовательности платформы. (Мы обычно разрушать ультразвуком до ~ 300 б.п.). Убедитесь, распределение по размерам фрагментированной геномной ДНК на 1% агарозном геле (рис. 1).
2. Подготовка ДНК
Определение исходной ДНК суммы, основанные на обилие 5-HMC в геномной ДНК. С 5-HMC уровни значительно различаются в разных типах тканей, начиная количества ДНК зависит от 5-HMC уровней образцов. Пожалуйста, обратитесь к таблице 1 для примера.
3. β-GT катализируемой реакции (реакции глюкозы Transfer)
- Смешать с помощью пипетки смесью, как указано в таблице 2 и инкубировать при 37 ° С водяной бане в течение 1 часа.
- После инкубации, очистка реакции с QIAquick нуклеотидных Kit удаления, используя 10 мкг ДНК настолбца. Элюировать 30 мкл воды в колонке и объединить.
4. Биотинилирование реакции (Click Chemistry)
- Добавить DBCO-SS-PEG3-биотин сопряженных рабочий раствор (1 мм) в Элюированную решение ДНК (с шагом 3) до конечной концентрации 150 мкМ (то есть, 5 мкл рабочего раствора в 30 мкл раствора ДНК).
- Перемешать пипетированием и инкубируют при 37 ° C на водяной бане 2 часа.
- Очистка реакции с QIAquick нуклеотидных Kit удаления. В идеале общий объем элюирования 100 мкл.
- Количественная восстановленных ДНК сумму с помощью микролитр масштаба спектрофотометр (например,., NanoDrop).
5. Захват 5-HMC-содержащих ДНК
- Вымойте 50 мкл Dynabeads MyOne Стрептавидин C1 3 раза с 1 мл 1X B & W буфера в соответствии с инструкцией завода-изготовителя. Отделить бусин с магнитным стенда.
- Добавить равный объем 2X B & W буфер для восстановления биотинилированного DNA (100 мкл) в промытых бус.
- Инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре с легким вращением на ротатор.
- Отделить бусин с магнитным стенд и мыть гранул 3 раза с 1 мл 1X B & W буфера.
- Элюируйте ДНК путем инкубации бисером в 100 мкл свежеприготовленного 50 мМ DTT в течение 2 часов при комнатной температуре с легким вращением на ротатор.
- Отделить бусин с магнитным стенда. Аспирируйте элюента и нагрузка на Micro Bio-Spin 6 колонку в соответствии с инструкцией производство, чтобы удалить DTT. ДНК-мишени в решение сейчас.
- Очищают Элюированную ДНК из предыдущего шага по Qiagen MinElute ПЦР-комплект для очистки и элюируются ДНК в 10 мкл буфера EB. Количественная ДНК с использованием Кубит Флуорометр, или NanoDrop, если их концентрация превышает 20 нг / ул. ДНК готова для последующей генома подготовки библиотеке последовательности.
6. Представитель Результаты
Если качество выводаF геномной ДНК является высокой, типичной дает восстановление после β-GT и биотинилирование реакции ~ 60-70%. Тем не менее, эффективность захвата существенно различаться с различными типами тканей в зависимости от 5-HMC уровней образцов. Как правило, эффективность захвата головного мозга геномной ДНК составляет ~ 4-9%, а в некоторых крайних случаях эффективность может достигать 12%. Для ЭС клеток, средняя эффективность улавливания составляет ~ 2-4%, в отличие от ~ 0,5% для нейронных стволовых клеток. Низкая эффективность видели до сих пор было для геномной ДНК из раковых клеток. Все ДНК, обогащенной готова к стандартным следующего поколения протоколов библиотеке подготовки. Кроме того, захваченных ДНК может быть также использован в качестве шаблона для ПЦР в реальном времени для обнаружения обогащения некоторых фрагментов по сравнению с входным ДНК, если соответствующие праймеры имеются.
Рисунок 1. Ультразвуком геномной ДНК человека фрагментов в1% агарозном геле. 10 мкг геномной ДНК, выделенной из клеток человека плюрипотентных в 120 мкл 1X TE буфера ультразвуком помощью ультразвука устройство (Covaris). После обработки ультразвуком, 2 мкл ДНК ультразвуком был загружен на 1% агарозном геле с использованием 100 п.н. ДНК маркеров для сравнения размеров фрагментов ДНК ультразвуком.
| Компонент | Объем | Конечная концентрация |
| Воды | _ Мкл | |
| 10 X β-GT Реакционный буфер | 2 мкл | 1 X |
| До 10 мкг геномной ДНК | _ Мкл | До 500 нг / мкл |
| UDP-6-N 3-Glc (3 мМ) | 0,67 мкл | 100 мкМ |
| β-GT (40 мкм) | 1 мкл | 2 мкМ |
| Общий объем | 20 мкл |
I) Для ткани геномной ДНК (высокое 5-HMC содержимого> 0,1%)
| Компонент | Объем | Конечная концентрация |
| Воды | _ Мкл | |
| 10 X β-GT Реакционный буфер | 10 мкл | 1 X |
| До 20 мкг геномной ДНК | _ Мкл | До 500 нг / мкл |
| UDP-6-N3-Glc (3 мМ) | 1,33 мкл | 100 мкМ |
| β-GT (40 мкм) | 2 мкл | 2 мкМ |
| Общий объем | 40 мкл |
II) Для стволовых клеток геномной ДНК (в среднем 5-HMC содержание ~ 0,05%)
| Компонент | Объем | Конечная концентрация |
| Воды | _ Мкл | |
| 10 X β-GT Реакционный буфер | 10 мкл | 1 X |
| До 50 мкг геномной ДНК | _ Мкл | До 500 нг / мкл |
| UDP-6-N3-Glc (3 мМ) | 3,33 мкл | 100 мкМ |
| β-GT (40 мкм) | 5 мкл | 2 мкМ |
| Общий объем | 100 мкл |
III) Для раковых клеток геномной ДНК (низкой 5-HMC содержание ~ 0,01%)
Таблица 1. Примеры количество ДНК входа и маркировке реакций с использованием образцов с различными 5-HMC уровней селективный метод маркировки химических веществ.
| Образец | 5-HMC уровне | Начиная ДНК (мкг) | Восстановление после маркировки (вход с бисером) (мкг) | Восстановление выход | Выпадающие ДНК (нг) | Выпадающие дают |
| Взрослые мозжечка мыши | 0,4% | 10 | 7,5 | 75% | 236 | 3,1% |
| Послеродовая день 7 мышь мозжечка | 0,1% | 11 | 9 | 82% | 140 | 1,6% |
| Мышь ЭС клеток E14 | 0,05% | 60 | 42 | 70% | 350 | 0,8% |
Таблица 2. Представитель результаты мыши тканях мозга и ES клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
5-hydroxymethylcytosine (5-HMC) является недавно идентифицированных эпигенетической модификацией настоящего в значительных количествах в определенных типах клеток млекопитающих. Метод, представленный здесь для определения генома распределение 5-HMC. Мы используем бактериофага Т4 β-glucosyltransferase перенести инженерные часть глюкозы содержащие азид группу на гидроксильной группе 5-HMC. Азид группы могут быть химически модифицированы с биотином для обнаружения, близость обогащения, и последовательность 5-HMC-содержащих фрагментов ДНК в геномах млекопитающих. Этот протокол имеет преимущества по сравнению с 5-HMC основе антител гидроксиметилированных иммунопреципитации ДНК (hMeDIP-Seq) 13-15, хотя hMeDIP проста, она имеет сильный уклон в сторону высокой плотности 5-HMC регионов и обычно дает противоречивые результаты независимых притяжение -падений. Наш метод бы не ввести такую предвзятость.
Есть, однако, два возможных проблем с точки зрения нашего маркировки и захватить меняТПК. Первая забота может быть специфика маркировки и захвата. С недавнем докладе указано, что 5-hydroxymethyluracil (5-ЖКХ) могут также служить в качестве субстрата β-GT, ложно-положительные сигналы могут быть введены, что приводит к обогащенным фрагменты, которые являются неспецифическими до 5-HMC-родства 16. Эта проблема может быть голословными, хотя, так как очень активного 5-hydroxymethyluracil-ДНК гликозилазами постоянно удаления этого повреждения ДНК, в результате чего существенно обнаружить 5-ЖКХ в геноме млекопитающих 17,18. Вторая проблема заключается в эффективности маркировки и захвата. С 5-HMC уровни значительно различаются в разных тканях и клетках, начиная с 0,5% в тканях мозга до 0,05% в ЭСК и 0,01% в раковых клетках, важно, что наши методы применимы ко всем этим тканям с точки зрения вниз по течению применение меченых и захватили геномной ДНК. Наш опыт показывает, что методы, описанные здесь, действительно, чувствительные и специфичныеДостаточно проанализировать все эти ткани с целью либо количественной основе сравнения 5-HMC уровнях между тканями или ниже по течению приложений, таких как глубокая секвенирования карту распределения 5-HMC в геноме 19-21.
Ключ к нашим методом является использование соответствующего количества исходного геномной ДНК. Если геномной ДНК концентрация слишком мала, эффективность маркировки и специфичность будет уменьшаться соответственно. Основываясь на нашем опыте, даже несмотря на обилие 5-HMC достаточно высок в ДНК из тканей мозга, если концентрация ниже 25 нг / мкл в 20 мкл реакции, маркировки и эффективность захвата, а также специфика, будет значительно сокращен. Для низкого обилия образцов ДНК, в дополнение к концентрации требование, общее количество ДНК необходимо получить высокие и конкретные эффективность захвата. Таким образом, хотя надо только 25 нг 5-HMC-обогащенных фрагментов ДНК на выходе йAndard библиотеки поколение протоколов, используемых платформ нового поколения секвенирования, начиная количество геномной ДНК из тканей мозга не должна быть менее 2 мкг (и идеальная стартовая сумма составляет 5-10 мкг). Путем проб и ошибок, мы оптимизировали исходного количества геномной ДНК из различных тканей с переменной 5-HMC содержания, чтобы получить высокую эффективность маркировки и специфичность, как указано в таблице 2.
Таким образом, наш метод квалифицирован, чтобы точно маркировать геномной 5-HMC и, в частности захвата 5-HMC-содержащих фрагментов, что делает его успешным протокол с точки зрения чувствительности и специфичности для последующих поколений анализа последовательности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Это исследование было частично поддержана Национальным институтом здоровья (GM071440 в CH и NS051630/MH076090/MH078972 к PJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Promega | V4221 | |
| 0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Promega | V4231 | |
| 1M Trizma base (Tris) pH7.5 | Invitrogen | 15567-027) | |
| HEPES 1M, pH7.4 | Invitrogen | 15630 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) 1M | Ambion | AM9530G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337-100 | |
| DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate | Click Chemistry Tools | A112P3 | |
| 1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure | Invitrogen | 15508-013 | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Micro Bio-Spin 6 Column | Bio-Rad | 732-6222 | |
| Dynabeads MyOne | Invitrogen | 650-01 | |
| Streptavidin C1 | |||
| Qiagen MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| UDP-6-N3-glucose | Active Motif | 55013 | |
| Enzyme | |||
| β-glucosyltransferase (β-GT) | New England Biolab | M0357 | |
| Equipment | |||
| Sonication device | Covaris | ||
| Desktop centrifuge | |||
| Water bath | Fisher Scientific | ||
| Gel running apparatus | Bio-Rad | ||
| NanoDrop1000 | Thermo Scientific | ||
| Labquake Tube Shaker | Barnstead | ||
| Labquake Tube Shaker | Thermolyne | ||
| Magnetic Separation Stand | Promega | Z5342 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20). | |||
References
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. , Suppl 33. 245-254 (2003).
- Ito, S. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466, 1129-1133 (2010).
- Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).
- Ko, M. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
- Koh, K. P. Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).
- Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. E. Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3642-3647 (2011).
- Wossidlo, M. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nat. Commun. 2, 241 (2011).
- Gu, T. P. The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes. Nature. 477, 606-610 (2011).
- Dawlaty, M. M. Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development. Cell Stem Cell. 9, 166-175 (2011).
- Huang, Y. The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing. PLoS One. 5, e8888 (2010).
- Song, C. X. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).
- Pastor, W. A. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473, 394-397 (2011).
- Matarese, F., Pau, C. arrillo-deS. anta, E,, Stunnenberg, H. G. 5-Hydroxymethylcytosine: a new kid on the epigenetic block. Mol. Syst. Biol. 7, 562 (2011).
- Szwagierczak, A., Bultmann, S., Schmidt, C. S., Spada, F., Leonhardt, H. Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, 181 (2010).
- Terragni, J., Bitinaite, J., Zheng, Y., Pradhan, S. Biochemical characterization of recombinant β-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes. Biochemistry. , (2012).
- Rusmintratip, V., Sowers, L. C. An unexpectedly high excision capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human cell extracts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).
- Globisch, D. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367 (2010).
- Yildirim, O. Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells. Cell. 147, 1498-1510 (2011).
- Szulwach, K. E. Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells. PLoS Genet. 7, e1002154 (2011).
- Szulwach, K. E. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nat. Neurosci. 14, 1607-1616 (2011).
