Summary
Se describe un proceso de etiquetado en dos etapas utilizando β-glucosiltransferasa (β-GT) para transferir una azida-glucosa al 5-HMC, seguido de química para transferir un enlazador de biotina para el enriquecimiento fácil y densidad independiente. Este método de marcaje eficaz y específico permite el enriquecimiento de 5-HMC con fondo extremadamente bajo y de alto rendimiento de mapeo epigenómico a través de secuenciación de próxima generación.
Abstract
5-metilcitosina (5-mC) constituye ~ 2-8% de las citosinas en el total de ADN genómico humano y afecta a una amplia gama de funciones biológicas, incluyendo la expresión génica, el mantenimiento de la integridad del genoma, impronta parental, inactivación del cromosoma X, la regulación de desarrollo, el envejecimiento y el cáncer 1. Recientemente, la presencia de un oxidó 5-MC, 5-hidroximetilcitosina (HMC-5), fue descubierto en células de mamífero, en particular en madre embrionarias (ES) de células y células neuronales 2-4. 5-HMC es generada por la oxidación de 5-mC catalizada por TET familia del hierro (II) / α-cetoglutarato dependiente de dioxigenasas 2, 3. 5-HMC es propuesto para que participen en el mantenimiento de la madre embrionarias (ES) de células, la hematopoyesis normal y tumores malignos, y cigoto desarrollo 2, 5-10. Para comprender mejor la función de 5-HMC, un sistema de secuenciación fiable y sencilla es esencial. Secuenciación de bisulfito tradicionales no pueden distinguir 5 HMC de 5-MC 11 12.
Aquí se describe un sencillo procedimiento en dos etapas para el etiquetado de productos químicos selectivos de 5-HMC. En la primera etapa de etiquetado, 5-HMC en el ADN genómico se marca con un catalizada 6-azida-glucosa por β-GT, una glucosiltransferasa a partir del bacteriófago T4, de una manera que transfiere el 6-azida-glucosa al 5-HMC de la modificado cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). En la segunda etapa de biotinilación,, un enlazador disulfuro de biotina se une al grupo azida por la química clic. Ambas etapas son altamente específicos y eficiente, llevando a completar el etiquetado independientemente de la abundancia de la 5-HMC en regiones genómicas y dando fondo extremadamente bajo. Después de biotinilación de 5-HMC, los fragmentos de ADN de 5 HMC que contienen son entonces selectivamente capturadoutilizando perlas de estreptavidina de una manera independiente de la densidad. El resultante 5-HMC enriquecidos con fragmentos de ADN se podría utilizar para los análisis posteriores, incluyendo secuenciación de próxima generación.
Nuestra etiquetado selectivo y protocolo de captura confiere una alta sensibilidad, aplicable a cualquier fuente de ADN genómico con variables / diversa 5-HMC abundancias. Aunque el propósito principal de este protocolo es su aplicación aguas abajo (es decir., Secuenciación de próxima generación para mapear la distribución de 5-HMC en el genoma), es compatible con una sola molécula, en tiempo real SMRT (ADN) secuenciación, que es capaz de ofrecer una sola base de secuenciación resolución de 5-HMC.
Protocol
1. Fragmentación de ADN genómico
El fragmento de ADN genómico utilizando sonicación a un intervalo de tamaño deseado adecuado para la plataforma de secuenciación de todo el genoma. (Por lo general, sonicar a ~ 300 pb.) Verificar la distribución del tamaño del ADN genómico fragmentado en 1% de gel de agarosa (Figura 1).
2. Preparación de ADN
Determinar las cantidades de ADN de partida basado en la abundancia de la 5-HMC en el ADN genómico. Dado que los niveles de 5-HMC varían significativamente en diferentes tipos de tejidos, a partir cantidades de ADN dependen de los niveles de 5-HMC de las muestras. Por favor, consulte la Tabla 1 para ver ejemplos.
3. β-GT reacción catalizada (reacción de glucosa Transfer)
- Mezclar pipeteando la mezcla como se detalla en la Tabla 2 y se incuba en un baño a 37 ° C durante 1 hr.
- Después de la incubación, limpiar la reacción con el kit QIAquick eliminación de nucleótidos, usando 10 g de ADN porcolumna. Se eluye con 30 l de agua por columna y combinar.
4. Biotinilación Reacción (Instrucciones Química)
- Añadir DBCO-SS-PEG3-biotina conjugado solución de trabajo (1 mM) en la solución de ADN eluido (de la etapa 3) a una concentración final de 150 mM (es decir, 5 l de solución de trabajo por solución de ADN 30 l).
- Mezclar mediante pipeteo y se incuba en un baño a 37 ° C durante 2 horas.
- Limpie la reacción con el kit QIAquick eliminación de nucleótidos. El volumen ideal de elución total es de 100 l.
- Cuantificar la cantidad de ADN recuperado mediante espectrofotómetro microlitro escala (por ejemplo., NanoDrop).
5. Captura de la 5-HMC que contienen ADN
- Lavar 50 l de Dynabeads MyOne estreptavidina C1 3 veces con 1 ml de 1X tampón B & W de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se separan las perlas con un soporte magnético.
- Añadir un volumen igual de 2X tampón B & W al recuperado D biotiniladoNA (100 ul) a las perlas lavadas.
- Incubar durante 15 min a temperatura ambiente con rotación suave, en un rotador.
- Se separan las perlas con un soporte magnético y lavar las perlas 3 veces con 1 ml de 1X tampón B & W.
- Eluir el ADN incubando las perlas en 100 l de DTT 50 mM recién preparado durante 2 horas a temperatura ambiente con rotación suave, en un rotador.
- Se separan las perlas con un soporte magnético. Aspirar el eluyente y se carga en un Micro Bio-Spin 6 columna de acuerdo con la instrucción de fabricación para eliminar el DTT. El ADN diana se encuentra en la solución ahora.
- Se purifica el ADN eluido de la etapa anterior por Qiagen kit de purificación de PCR MinElute y el ADN se eluye en 10 l de tampón EB. Cuantificar el ADN utilizando fluorómetro Qubit, o NanoDrop si la concentración es superior a 20 ng / ul. El ADN está listo para aguas abajo en todo el genoma preparación de bibliotecas de secuenciación.
6. Los resultados representativos
Si la calidad of ADN genómico es alto, los rendimientos típicos de recuperación después de la β-GT y reacciones biotinilación son ~ 60-70%. Sin embargo, la eficiencia de la captura variar significativamente con tipos de tejidos diferentes en función de los niveles de 5-MCS de las muestras. Típicamente, la eficiencia de la captura de ADN genómico cerebro es de ~ 4.9%, y en algunos casos extremos, la eficiencia puede llegar hasta 12%. Para células madre embrionarias, la eficiencia de la captura promedio es de ~ 2-4%, en contraste con ~ 0,5% para las células madre neurales. La menor eficiencia visto hasta ahora era para el ADN genómico de las células cancerosas. Todo el ADN enriquecido está listo para el estándar de la próxima generación de protocolos de preparación de la biblioteca. Además, el ADN capturado también puede ser utilizado como molde para la PCR en tiempo real para detectar el enriquecimiento de algunos fragmentos en comparación con el ADN de entrada, si los cebadores relacionados están disponibles.
Figura 1. Sonicadas humanos fragmentos de ADN genómico en1% en gel de agarosa. 10 g de ADN genómico aislado de células iPS humanas en 120 l de tampón TE 1X se sometió a ultrasonidos usando un dispositivo de sonicación (Covaris). Después de la sonicación, 2 l de la ADN sonicado se cargó en agarosa al 1% en gel utilizando 100 pb del marcador de ADN para comparar los tamaños de los fragmentos de ADN sometidos a ultrasonidos.
| Componente | Volumen | Concentración final |
| Agua | _ L | |
| 10 X β-GT Reaction Buffer | 2 l | 1 X |
| Hasta 10 g de ADN genómico | _ L | Hasta 500 ng / l |
| UDP-6-N-3 Glc (3 mM) | 0,67 l | 100 mM |
| β-GT (40 mM) | 1 l | 2 uM |
| Volumen total | 20 l |
i) Para el ADN genómico de tejido (mayor de 5 HMC contenido> 0,1%)
| Componente | Volumen | Concentración final |
| Agua | _ L | |
| 10 X β-GT Reaction Buffer | 10 l | 1 X |
| Hasta 20 g de ADN genómico | _ L | Hasta 500 ng / l |
| UDP-6-N3-Glc (3 mM) | 1,33 l | 100 mM |
| β-GT (40 mM) | 2 l | 2 uM |
| Volumen total | 40 l |
ii) Para el ADN genómico de células madre (mediana 5 HMC contenido ~ 0,05%)
| Componente | Volumen | Concentración final |
| Agua | _ L | |
| 10 X β-GT Reaction Buffer | 10 l | 1 X |
| Hasta 50 g de ADN genómico | _ L | Hasta 500 ng / l |
| UDP-6-N3-Glc (3 mM) | 3,33 l | 100 mM |
| β-GT (40 mM) | 5 l | 2 uM |
| Volumen total | 100 l |
iii) En el caso del ADN genómico de las células cancerosas (de menos de 5 HMC contenido de ~ 0,01%)
Tabla 1. Ejemplos de cantidades de ADN de entrada y etiquetado reacciones utilizando las muestras con diferentes niveles de 5-HMC por el método de etiquetado químico selectivo.
| Muestra | 5 HMC nivel | ADN de partida (g) | La recuperación después de etiquetado (entrada a las perlas) (g) | Recuperación de rendimiento | Tire hacia abajo del ADN (ng) | Pull-down producir |
| Cerebelo de ratón adulto | 0,4% | 10 | 7,5 | 75% | 236 | 3,1% |
| Día 7 postnatal ratón cerebelo | 0,1% | 11 | 9 | 82% | 140 | 1,6% |
| Ratón de células ES E14 | 0,05% | 60 | 42 | 70% | 350 | 0,8% |
Tabla 2. Los resultados representativos de los tejidos del cerebro de ratón y células ES.
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Discussion
5-hidroximetilcitosina (HMC-5) es un presente identificado recientemente modificación epigenética en cantidades sustanciales en ciertos tipos de células de mamíferos. El método presentado aquí es para determinar la distribución en todo el genoma de la 5-HMC. Usamos bacteriófago T4 β-glucosiltransferasa para transferir un resto de glucosa de ingeniería que contiene un grupo azida en el grupo hidroxilo de la 5-HMC. El grupo azida se pueden modificar químicamente con biotina para la detección, enriquecimiento de afinidad, y la secuenciación de fragmentos de ADN 5-HMC que contienen en los genomas de mamíferos. Este protocolo tiene ventajas sobre el 5-HMC basado en anticuerpos inmunoprecipitación ADN hidroximetilado (hMeDIP-Seq) 13-15, aunque la hMeDIP es sencillo, tiene un fuerte sesgo hacia la alta densidad de 5-HMC regiones y por lo general da resultados inconsistentes de tracción independiente -downs. Nuestro método no introducir sesgo.
Hay, sin embargo, dos problemas posibles en términos de nuestra marca y la captura de míDTO. La primera preocupación podría ser la especificidad de la captura y etiquetado. Dado que un informe reciente indica que el 5-hidroximetiluracilo (5-HMU) también puede servir como un sustrato de β-GT, falsos positivos señales podrían ser introducidas, que conduce a fragmentos enriquecidos que no son específicos a la 5-HMC-relación 16. Esta preocupación podría ser infundado, sin embargo, ya altamente activo 5-ADN hidroximetiluracilo-glicosilasas están constantemente eliminar este daño en el ADN, dando como resultado esencialmente indetectable 5-HMU en mamíferos genoma 17,18. La segunda preocupación es la eficiencia del etiquetado y la captura. Dado que los niveles de 5-HMC varían significativamente en diferentes tejidos y células, que van desde 0,5% en los tejidos del cerebro a 0,05% en las células MES y 0,01% en las células cancerosas, es esencial que nuestros métodos de ser aplicable a todos estos tejidos en términos de la corriente abajo aplicaciones de la etiqueta de ADN genómico y capturado. Nuestra experiencia demuestra que los métodos descritos aquí son realmente sensibles y específicossuficiente para analizar todos estos tejidos con el propósito de comparación ya sea basado en la cuantificación de 5-HMC niveles entre los tejidos o para aplicaciones posteriores, tales como la secuenciación profunda para mapear la distribución de la 5-HMC en el genoma 19-21.
La clave de nuestro método es el uso de una cantidad apropiada de ADN genómico de partida. Si la concentración de ADN genómico es demasiado bajo, el etiquetado de eficiencia y especificidad disminuirá en consecuencia. Sobre la base de nuestra experiencia, a pesar de la abundancia de la 5-HMC es lo suficientemente alta en el ADN de los tejidos del cerebro, si la concentración es inferior a 25 ng / l en 20 l de reacción, el etiquetado y la eficiencia de la captura, así como la especificidad, se reducirán considerablemente. Para las muestras de ADN de baja abundancia, además de la exigencia de concentración, la cantidad total de ADN es esencial para obtener alta y la eficiencia de captura específico. Por lo tanto, aunque sólo se necesita 25 ng de fragmentos de ADN 5-HMC-enriquecido para el st aguas abajoAndard protocolos empleados por la generación de biblioteca plataformas de secuenciación de nueva generación, la cantidad inicial de ADN genómico de los tejidos cerebrales no debe ser inferior a 2 g (y la cantidad de partida ideal es g 5-10). A través del ensayo y error, hemos optimizado la cantidad inicial de ADN genómico a partir de diferentes tejidos con 5 variables HMC abundancia de conseguir etiquetado de eficiencia y especificidad elevadas, como se detalla en la Tabla 2.
En resumen, nuestro método está calificado para etiquetar precisamente genómico 5 HMC y específicamente capturar los fragmentos 5 HMC que contienen, por lo que es un protocolo exitoso en términos de sensibilidad y especificidad para posteriores ensayos de secuenciación de última generación.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de la Salud (GM071440 a CH y NS051630/MH076090/MH078972 a PJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Promega | V4221 | |
| 0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Promega | V4231 | |
| 1M Trizma base (Tris) pH7.5 | Invitrogen | 15567-027) | |
| HEPES 1M, pH7.4 | Invitrogen | 15630 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) 1M | Ambion | AM9530G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337-100 | |
| DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate | Click Chemistry Tools | A112P3 | |
| 1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure | Invitrogen | 15508-013 | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Micro Bio-Spin 6 Column | Bio-Rad | 732-6222 | |
| Dynabeads MyOne | Invitrogen | 650-01 | |
| Streptavidin C1 | |||
| Qiagen MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| UDP-6-N3-glucose | Active Motif | 55013 | |
| Enzyme | |||
| β-glucosyltransferase (β-GT) | New England Biolab | M0357 | |
| Equipment | |||
| Sonication device | Covaris | ||
| Desktop centrifuge | |||
| Water bath | Fisher Scientific | ||
| Gel running apparatus | Bio-Rad | ||
| NanoDrop1000 | Thermo Scientific | ||
| Labquake Tube Shaker | Barnstead | ||
| Labquake Tube Shaker | Thermolyne | ||
| Magnetic Separation Stand | Promega | Z5342 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20). | |||
References
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