Summary
Beskrivs är en tvåstegsprocess märkning med användning β-glukosyltransferas (β-GT) för att överföra en azid-glukos till 5-HMC, följt genom att klicka kemi för att överföra en biotin linker för enkel och densitet oberoende anrikning. Denna effektiva och särskild märkning metod möjliggör anrikning av 5-HMC med extremt låg bakgrund och hög genomströmning epigenomic kartläggning via nästa generations sekvensering.
Abstract
5-metylcytosin (5-MC) utgör ~ 2-8% av de totala cytosiner i human genomisk DNA och påverkar ett brett utbud av biologiska funktioner, inklusive genuttryck, underhåll av genomet integritet, föräldrarnas prägling, X-kromosom inaktivering, reglering av utveckling, åldrande och cancer 1. Nyligen har närvaron av en oxiderad 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC), upptäcktes i däggdjursceller, i synnerhet i embryonala stamceller (ES)-celler och neuronala celler 2-4. 5-HMC alstras genom oxidation av 5-mC katalyserad av TET familjen järn (II) / α-ketoglutarat-beroende dioxygenases 2, 3. 5-HMC föreslås delta i upprätthållandet av embryonala stamceller (MES) cell, normal hematopoes och maligniteter och zygot utveckling 2, 5-10. För att bättre förstå funktionen av 5-HMC, är en tillförlitlig och enkel sekvenseringssystem väsentlig. Traditionell bisulfit sekvensering kan inte skilja 5-HMC från 5-mC 11 12.
Här beskriver vi en enkel två-stegsförfarande för selektiv kemisk märkning av 5-HMC. I det första märkning steget, är 5-HMC i genomiskt DNA märkt med en 6-azid-glukos katalyseras av β-GT, en glukosyltransferas från T4 bakteriofag, på ett sätt som överför 6-azid-glukos till 5-HMC från modifierad cofaktor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). I det andra steget, biotinylering, är en disulfid biotin linker fäst till azidgruppen genom att klicka kemi. Båda stegen är mycket specifika och effektiva, vilket leder till fullständig märkning oavsett överflöd av 5-HMC i genomiska regioner och ger extremt låg bakgrund. Efter biotinylering av 5-HMC, de 5-HMC-innehållande DNA-fragment därefter selektivt fångasmed streptavidinpärloma i en täthet-oberoende sätt. De resulterande 5-HMC-anrikade DNA-fragment kan användas för nedströms analyser, inklusive nästa generations sekvensering.
Vår selektiva märkning och fånga protokoll ger hög känslighet, som gäller för alla källor av genomiskt DNA med varierande / varierande 5-HMC abundances. Även om det huvudsakliga syftet med detta protokoll är dess nedströms tillämpning (dvs.., Nästa generations sekvensering att kartlägga 5-HMC distribution i genomet), är den kompatibel med enda molekyl, i realtid SMRT (DNA) sekvensering, som är kan leverera enkel-bas upplösning sekvensering av 5-HMC.
Protocol
1. Genomiskt DNA Fragmentering
Fragment genomiskt DNA med användning av sonikering i ett önskat storleksområde lämpad för genomet hela sekvensering plattform. (Vi brukar sonikera till ~ 300 bp). Kontrollera storleken fördelningen av fragmenterade genomiska DNA på 1% agarosgel (figur 1).
2. DNA-preparation
Bestäm utgångspunkterna DNA mängder baserat på det överflöd av 5-HMC i genomisk DNA. Eftersom 5-HMC varierar avsevärt i olika vävnadstyper, börjar DNA mängder beror på de 5-HMC nivåer av proverna. Se tabell 1 för exempel.
3. β-GT katalyserade reaktionen (glukos Transfer Reaction)
- Blanda genom att pipettera blandningen som anges i tabell 2 och inkubera i ett 37 ° C vattenbad under 1 timme.
- Efter inkubation städa upp reaktionen med QIAquick Nucleotide Removal Kit, med 10 pg DNA perkolonn. Eluera med 30 pl vatten per kolumn och kombinera.
4. Biotinylerings Reaktion (Klicka kemi)
- Lägg DBCO-SS-PEG3-biotin-konjugat arbetslösning (1 mM) i den eluerade DNA-lösningen (från steg 3) till en slutlig koncentration av 150 iM (dvs., 5 pl arbetslösning per 30 pl DNA-lösning).
- Blanda genom pipettering och inkubera i ett 37 ° C vattenbad under 2 timmar.
- Städa upp reaktionen med QIAquick Nukleotid borttagning Kit. Den idealiska totala elueringsvolymen är 100 pl.
- Kvantifiera det återvunna DNA beloppet med mikroliter skalan spektrofotometer (t.ex.., NanoDrop).
5. Fånga av 5-HMC-innehållande DNA
- Tvätta 50 il Dynabeads MyOne Streptavidin C1 3 gånger med 1 ml 1X B & W buffert enligt tillverkarens anvisningar. Separera pärlorna med en magnetisk stativ.
- Lägg lika volym av 2X B & W buffert till den återvunna biotinylerade DNA (100 pl) till de tvättade pärlorna.
- Inkubera under 15 minuter vid rumstemperatur med försiktig rotation på en rotator.
- Separera pärlorna med en magnetisk stativ och tvätta pärlorna 3 gånger med 1 ml 1X B & W-buffert.
- Eluera DNA genom inkubation av pärlorna i 100 | il nyberedd 50 mM DTT under 2 timmar vid rumstemperatur med varsam rotation på en rotator.
- Separera pärlorna med en magnetisk stativ. Aspirera elueringsmedlet och lasten på en Micro Bio-Spin 6 kolonn enligt tillverkarens instruktioner för att avlägsna DTT. Mål-DNA är i lösningen nu.
- Rena det eluerade DNA från föregående steg av Qiagen MinElute PCR Purification Kit och eluera DNA i 10 pl buffert EB. Kvantifiera DNA med användning kvantbit Fluorometer, eller NanoDrop om koncentrationen är högre än 20 ng / ul. Det DNA är redo för efterföljande genomet hela sekvensering bibliotek beredning.
6. Representativa resultat
Om kvaliteten of genomiskt DNA är hög, typiska återhämtning ger efter β-GT och reaktioner biotinylering är ~ 60-70%. Emellertid infångningseffektiviteten varierar kraftigt med olika vävnadstyper beroende på 5-HMC nivåer av proverna. Typiskt är den infångande effektiviteten för hjärnans genomiskt DNA ~ 4-9%, och i vissa extrema fall kan verkningsgraden nå upp till 12%. För ES-celler, är den genomsnittliga infångningseffektivitet ~ 2-4%, i motsats till ~ 0,5% för neurala stamceller. Den lägsta effektiva sett hittills var för genomisk DNA från cancerceller. Alla berikade DNA är klar för vanliga nästa generations protokoll bibliotek förberedelse. Dessutom, kan den infångade DNA också kan användas som mall för realtids-PCR för att detektera anrikning av vissa fragment jämfört med ingående DNA om tillhörande primers är tillgängliga.
Figur 1. Sonikerade humana genomiska DNA-fragment i1% agarosgel. 10 pg genomiskt DNA som isolerats från humana iPS celler i 120 pl 1X TE-buffert sonikerades med användning av en anordning sonikering (Covaris). Efter sonikering tillsattes 2 pl av den sonikerade DNA laddades på 1% agarosgel med användning av 100 bp av DNA-markör för att jämföra storlekarna hos de sonikerade DNA-fragment.
| Komponent | Volym | Slutlig koncentration |
| Vatten | _ Il | |
| 10 X β-GT-reaktionsbuffert | 2 pl | 1 X |
| Upp till 10 ng genomiskt DNA | _ Il | Upp till 500 ng / | il |
| UDP-6-N-3-Glc (3 mM) | 0,67 pl | 100 pM |
| β-GT (40 iM) | 1 il | 2 iM |
| Total volym | 20 il |
i) För vävnad genomisk DNA (hög 5-HMC halt> 0,1%)
| Komponent | Volym | Slutlig koncentration |
| Vatten | _ Il | |
| 10 X β-GT-reaktionsbuffert | 10 il | 1 X |
| Upp till 20 pg genomiskt DNA | _ Il | Upp till 500 ng / | il |
| UDP-6-N3-Glc (3 mM) | 1,33 pl | 100 pM |
| β-GT (40 iM) | 2 pl | 2 iM |
| Total volym | 40 il |
ii) För stamceller genomiska DNA (median 5-HMC halt ~ 0,05%)
| Komponent | Volym | Slutlig koncentration |
| Vatten | _ Il | |
| 10 X β-GT-reaktionsbuffert | 10 il | 1 X |
| Upp till 50 ng genomiskt DNA | _ Il | Upp till 500 ng / | il |
| UDP-6-N3-Glc (3 mM) | 3,33 pl | 100 pM |
| β-GT (40 iM) | 5 pl | 2 iM |
| Total volym | 100 pl |
iii) För cancercell genomiskt DNA (låg 5-HMC halt ~ 0,01%)
Tabell 1. Exempel på mängder av ingående DNA och reaktioner märkning med proverna med olika 5-HMC nivåer selektiv kemisk märkningsmetod.
| Prov | 5-HMC nivå | Start-DNA (pg) | Återhämtning efter märkning (ingång till pärlor) (g) | Utvinningsutbyte | Pull-down-DNA (ng) | Rullgardinsmenyn ge |
| Vuxen mus cerebellum | 0,4% | 10 | 7,5 | 75% | 236 | 3,1% |
| Postnatal dag 7 mus cerebellum | 0,1% | 11 | 9 | 82% | 140 | 1,6% |
| Mus ES-cell E14 | 0,05% | 60 | 42 | 70% | 350 | 0,8% |
Tabell 2. Representativa resultat från vävnader mushjärna och celler ES.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
5-hydroxymethylcytosine (5-HMC) är en nyligen identifierad epigenetiska modifiering föreligger i väsentliga mängder i vissa däggdjurscelltyper. Den metod som presenteras här är för att bestämma genomet bred distribution av 5-HMC. Vi använder T4 bakteriofag β-glukosyltransferas att överföra en manipulerad glukosenhet innehållande en azidgrupp till hydroxylgruppen av 5-HMC. Azidgruppen kan modifieras kemiskt med biotin för detektering, affinitetsanrikning och sekvensering av 5-HMC-innehållande DNA-fragment i däggdjursgenom. Detta protokoll har fördelar jämfört med 5-HMC antikroppsbaserad hydroximetylerad DNA immunoutfällning (hMeDIP-Seq) 13-15, även om hMeDIP är enkel, den har en stark slagsida mot hög densitet 5-HMC regioner och oftast ger motstridiga resultat från oberoende dragning nedskrivningar. Vår metod skulle inte införa en sådan partiskhet.
Det finns dock två möjliga orosmoment i form av vår märkning och fånga migThOD. Ledordet kan vara specifika för märkning och fånga. Eftersom en färsk rapport visade att 5-hydroxymethyluracil (5-HMU) också kan fungera som ett substrat för β-GT kan falskt positiva signaler införas, vilket leder till berikade fragment som är ospecifika till 5-HMC-släktskap 16. Denna oro kan vara ogrundad, men eftersom mycket aktiva 5-hydroxymethyluracil-DNA glykosylaser ständigt bort denna DNA-skador, vilket resulterar i huvudsak odetekterbar 5-HMU i däggdjursgenom 17,18. Den andra bekymmer är effektivitet märkning och fångst. Eftersom 5-HMC varierar avsevärt i olika vävnader och celler, som sträcker sig från 0,5% i hjärnvävnad till 0,05% i MES-celler och 0,01% i cancerceller, är det viktigt att våra metoder tillämpas på alla dessa vävnader i form av den nedströms tillämpningar av märkta och fångade genomiskt DNA. Vår erfarenhet visar att de metoder som beskrivs här är verkligen känslig och specifiktillräckligt för att analysera alla dessa vävnader för att antingen kvantifiering baserad jämförelse av 5-HMC nivåerna bland de vävnader eller för nedströms tillämpningar, såsom djup sekvensering att kartlägga fördelningen av 5-HMC i genomet 19-21.
Nyckeln till vår metod är användningen av en lämplig mängd utgångsmaterial genomiskt DNA. Om det genomiska DNA-koncentrationen är alltför låg, kommer märkningen effektivitet och specificitet minskar därefter. Baserat på vår erfarenhet, trots överflödet av 5-HMC är tillräckligt hög i DNA från hjärnvävnader, om koncentrationen är lägre än 25 ng / pl i 20 pl reaktion, märkning och infångningseffektivitet, liksom specificiteten, kommer att minska avsevärt. För låg överflöd DNA-prover, utöver koncentrationen kravet är den totala mängden DNA viktigt att få hög och specifik fånga effektivitet. Därför måste även en enda 25 ng 5-HMC-berikade DNA-fragment för nedströms standard bibliotek generationens protokoll används av nästa generations sekvensering plattformar bör grundbeloppet för genomisk DNA från hjärnan vävnader inte understiga 2 g (och en idealisk utgångspunkt beloppet är 5-10 ng). Genom försök och misstag, har vi optimerat utgångsbeloppet för genomisk DNA från olika vävnader med variabla 5-HMC abundances att få hög märkning effektivitet och specificitet som anges i tabell 2.
Sammanfattningsvis är vår metod kvalificerad att exakt märka genomisk 5-HMC och särskilt fånga 5-HMC-innehållande fragment, vilket gör det en lyckad protokoll i fråga om känslighet och specificitet för nedströms nästa generations sekvensering analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna studie stöddes delvis av National Institutes of Health (GM071440 till CH och NS051630/MH076090/MH078972 PJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Promega | V4221 | |
| 0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Promega | V4231 | |
| 1M Trizma base (Tris) pH7.5 | Invitrogen | 15567-027) | |
| HEPES 1M, pH7.4 | Invitrogen | 15630 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) 1M | Ambion | AM9530G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337-100 | |
| DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate | Click Chemistry Tools | A112P3 | |
| 1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure | Invitrogen | 15508-013 | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Micro Bio-Spin 6 Column | Bio-Rad | 732-6222 | |
| Dynabeads MyOne | Invitrogen | 650-01 | |
| Streptavidin C1 | |||
| Qiagen MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| UDP-6-N3-glucose | Active Motif | 55013 | |
| Enzyme | |||
| β-glucosyltransferase (β-GT) | New England Biolab | M0357 | |
| Equipment | |||
| Sonication device | Covaris | ||
| Desktop centrifuge | |||
| Water bath | Fisher Scientific | ||
| Gel running apparatus | Bio-Rad | ||
| NanoDrop1000 | Thermo Scientific | ||
| Labquake Tube Shaker | Barnstead | ||
| Labquake Tube Shaker | Thermolyne | ||
| Magnetic Separation Stand | Promega | Z5342 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20). | |||
References
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. , Suppl 33. 245-254 (2003).
- Ito, S. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466, 1129-1133 (2010).
- Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).
- Ko, M. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
- Koh, K. P. Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).
- Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. E. Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3642-3647 (2011).
- Wossidlo, M. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nat. Commun. 2, 241 (2011).
- Gu, T. P. The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes. Nature. 477, 606-610 (2011).
- Dawlaty, M. M. Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development. Cell Stem Cell. 9, 166-175 (2011).
- Huang, Y. The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing. PLoS One. 5, e8888 (2010).
- Song, C. X. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).
- Pastor, W. A. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473, 394-397 (2011).
- Matarese, F., Pau, C. arrillo-deS. anta, E,, Stunnenberg, H. G. 5-Hydroxymethylcytosine: a new kid on the epigenetic block. Mol. Syst. Biol. 7, 562 (2011).
- Szwagierczak, A., Bultmann, S., Schmidt, C. S., Spada, F., Leonhardt, H. Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, 181 (2010).
- Terragni, J., Bitinaite, J., Zheng, Y., Pradhan, S. Biochemical characterization of recombinant β-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes. Biochemistry. , (2012).
- Rusmintratip, V., Sowers, L. C. An unexpectedly high excision capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human cell extracts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).
- Globisch, D. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367 (2010).
- Yildirim, O. Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells. Cell. 147, 1498-1510 (2011).
- Szulwach, K. E. Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells. PLoS Genet. 7, e1002154 (2011).
- Szulwach, K. E. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nat. Neurosci. 14, 1607-1616 (2011).
