Summary
ACF染色质重塑因子E4orf4诱导的细胞死亡的贡献进行了测量。该协议包括在多西环素治疗诱导有条件击倒的ACF的亚基ACF1和SNF2h的细胞克隆的选择，使用的DAPI检测测量E4orf4-诱导的细胞死亡的诱导的细胞系。
Abstract
的研究是非常重要的贡献感兴趣的各种途径的1,2的蛋白质在哺乳动物细胞中的基因表达的功能失活。然而，有条件击倒的基因的表达是必需的情况下，当没有被细胞的耐受性，构击倒了很长一段的时间3-5。在这里，我们描述了一个协议，准备允许有条件的ACF染色质重塑因子亚基敲除的细胞株。这些细胞株诱导的细胞死亡的ACF的贡献便于确定由腺病毒E4orf4蛋白6。编码为ACF1和SNF2h亚基的ACF染色质重塑因子的短发夹RNA的序列进行克隆到一个多西环素诱导型启动子中还含有新霉素抗性基因的基因的质粒的旁边。选择的新霉素抗性细胞克隆在G418的存在下，和隔离。将所得的细胞系诱导的强力霉素治疗，而一旦ACF1或SNF2h表达水平降低，细胞转染的质粒编码E4orf4或空载体。确认具体的shRNA结构的影响，ACF1或SNF2h蛋白水平恢复到WT水平的转染与表达质粒ACF1或SNF2h呈现抵抗的shRNA引入沉默突变。通过DAPI染色的测定，其中的频率测定细胞核与细胞凋亡在转染的细胞群体的形貌的外观7-9 E4orf4的能力，诱导细胞死亡的各种样品中测定。
这里所描述的协议，可用于测定各种蛋白质的功能贡献的情况下诱导细胞死亡的蛋白质的合作伙伴，构击倒时，可能是电池致命的。
Protocol
1。产生的诱导性细胞系
- 实验之前，人们需要找到所有用于制备所需的细胞系的细胞死亡的药物G418的最小浓度。为此目的，板中给出的细胞在培养基中，将用于在实验过程中，添加的G418的浓度增加（0-1,000微克每毫升）在70％汇合的几个重复板。监控每天来确定的最低G418浓度，有效地杀死细胞的细胞。细胞死亡是内观察3-7天。
- 在此之前产生的它建议以验证表达的shRNA的质粒瞬时转染实验，可以在一定程度上减少所研究的基因的表达的细胞株。这可以在任何可有效地转染的细胞系，完成。
- 板T-REX-293细胞在每10cm的板的密度为约5×10 6个细胞在8毫升的DMEM培养基（含有10％四环素学年茎核准FBS，2mM L-谷氨酰胺，100单位每ml青霉素和0.1毫克每毫升链霉素，5微克每毫升含杀稻瘟素）。孵育过夜的板在37℃下，5％CO 2。
- 翌日，改变介质8毫升新鲜培养基转染前。
- 转染的细胞，用10微克pSuperior.neo + GFP质粒（ 图1）的编码ACF1或SNF2h短发夹驱动四环素诱导型H1启动子，以及稠合到GFP和由一个构PGK启动子驱动的新霉素抗性基因。添加的DNA到500μl的150 mM NaCl。加入另一等分的500微升的150 mM NaCl，2微升每微克DNA jetPIE试剂。的涡流添加的jetPIE的解决的DNA，拌匀。在室温下孵育15分钟。轻轻地移液管到10厘米的板含70％至80％融合细胞的DNA复合物。返回板的孵化器。
- 第二天更换培养基用选择性培养基（DMEM培养基上述包含一个额外的500微克每毫升G418）。
- 在接下来的两个星期监测的细胞，取代类似的新鲜培养基，每3-4天至菌落出现，可以不用显微镜可视化的选择性培养基。
- 隔离的菌落之前，准备与选择性培养基的24孔板中。
- 确定菌落，经眼，和在底部的板，使用的着色标记标示他们的位置。验证显微镜下观察，菌落分离。
- 在无菌罩，吸板，轻轻地用温水PBS冲洗，吸出所有剩余的液体介质。将为3微升0.25％胰蛋白酶/ EDTA板的一个殖民地。移液器的胰蛋白酶反复，直到细胞分离，并将它们添加到24孔板中的井之一。在其他殖民地板重复此操作。
- 成长的细胞在37℃下，5％CO 2，直到他们填补。然后分裂细胞来源于每个原始菌落分为三个井，每一个单独的12孔板中，并孵育过夜。
- 翌日，更换培养基中含有1微克每毫升多西环素的培养基，从库存中双蒸水（1-5毫克每毫升）中制备的溶液在一个板。未经强力霉素在控制板更换介质。孵育细胞72小时，在37℃，5％CO 2。
- 收获细胞处理和未经处理的井水，每个细胞克隆的蛋白提取物的制备和Western blot分析，以确定ACF1或SNF2h击倒的效率。使用抗体到ACF1或SNF2h以及α-微管蛋白的抗体，作为一个负荷控制。使用这些细胞在第三阱，留下未处理的，供选择的细胞克隆中，强力霉素除了导致减少至少50％，在所研究的蛋白质的水平扩张。冻结，这些细胞的等分试样，在90％FBS，10％DMSO的进一步使用。
- 板细胞在选择性培养基中在10厘米的板。在每毫升1微克至一半的板添加强力霉素和孵育在37℃，5％CO 2的 48〜72小时（参见图4）。
- 48-72小时后，从各组的细胞trypsinize细胞，它们进行计数，和板每6厘米板在相同的介质中的1.5×10 6个细胞，带或不带强力霉素。细胞在37℃，5％CO 2过夜孵育。计划，以便使板从第2.1节中的每个组将提供的细胞126厘米板，包括两个重复的每个点的DAPI检测以及每个样品进行Western印迹分析（参见图4）的一个极板。
- 在翌日的转染的细胞在6厘米的板与下列质粒的组合：一个空质粒1微克或相同的质粒编码的数量E4orf4，连同4μg的一个向量表达ACF1-GFP或SNF2h的-GFP呈现抗通过导入沉默突变，或相应的空载体和1μg质粒表达GFP（ 图4）3微克的shRNA的细胞克隆中。使用如上所述的jetPIE试剂（10微升每5微克DNA）以制备转染混合物。对于每个样品，准备三个板中的转染混合物。
- DNA与jetPIE试剂在室温下孵育15分钟后，轻轻移液等量的DNA复合物从每个转染组合到三个的6厘米板和孵育在37℃，5％CO 2过夜。
3。 DAPI检测转染细胞中
- 第二天，提取的蛋白质进行Western印迹分析，以确定从每个样品的一个板，ACF1或SNF2h已被有效地撞倒E4orf4有人在不同的样品中的平均。
- 从板的DAPI用于吸取介质分析，洗的盘子轻轻地用PBS和添加1毫升4％的多聚甲醛在PBS准备，以覆盖细胞。应进行的多聚甲醛溶液的制备和与此化学品的细胞治疗中的化学遮光罩。在室温下孵育15分钟，无晃动。
- 吸取的多聚甲醛，并用PBS洗三次，每次5分钟，在室温下摆动。保持在-20℃，并在-20℃下孵育至少1小时，加入80％的乙醇。该板可以乙醇在-20℃下保存数天，只要它们被密封良好，以防止乙醇蒸发和干燥。
- 吸取乙醇，并用PBS洗涤细胞两次，一次用PBS-BT（含0.5％BSA和0.05％吐温20的PBS中），在室温下搅拌5分钟，每次摆动。
- 为了防止非特异性抗体结合，阻止细胞在1ml PBS-BT缓冲液含有10％山羊血清的20分钟，同时在室温下摇动。然后洗净吨他PBS-BT细胞两次，每次洗5分钟。
- 与第一抗体孵育的细胞（在我们的例子中一个E4orf4特定抗体）在1ml PBS-BT的同时，在室温下摇动1小时。然后在PBS-BT洗两次，一次在PBS中含有0.1％BSA，5分钟，每次洗涤。
- 孵育细胞在1ml的PBS-0.1％BSA含有适当的辅助荧光标记的抗体和0.5微克每毫升最终浓度的DAPI，在室温下在黑暗中40分钟，同时摆动。然后用PBS洗5分钟，干好愿望，并保持板倒挂小时在一夜之间实现完全干燥。然后再装载的细胞的封面上滑动，使用Fluoromount-G溶液。保持板在黑暗中，直到准备好来计算凋亡细胞在4°C。
- 问同事，以确定新的数字，计数凋亡细胞的各种样品中的各种板材可以做一个公正的方式。
- 可视化的细胞下的upright在400X的放大倍数下（在空气中）或630X（浸没油中）的荧光显微镜。确定转染的细胞进行染色，并计算每个样本中的各种蛋白的表达简明或分散的细胞核用DAPI染色转染细胞内人口的数量。监视几个字段和计数总共至少为200转染的细胞。
- 计算的百分比的核内的转染的细胞群体的细胞凋亡形态。重复实验过程中，重复2-3次，以计算出的各样品之间的变化的统计意义。
4。代表性的成果
有条件击倒的基因表达获得的菌落中，已成功的效率是可变的，这取决于所涉及的基因。在我们的手中，我们了12测试ACF1和18 SNF2h的。成功获得7殖民地图2 SH的样品的代表性板的选定的细胞克隆（ 图2A），以及一个单菌落（ 图2B），图3示出了具有代表性的印迹，用生长在72小时的强力霉素的存在或不存在的各种克隆从细胞中提取的蛋白质的制备。印迹染色到SNF2h和α-微管蛋白的抗体，作为一个负荷控制。两个克隆（数字4和5）表现出很强的降低在SNF2h后，多西环素诱导水平。应当指出的是，虽然在稳定的细胞系中的绿色荧光pSuperior.neo + GFP质粒（ 图1）用于生成编码一个新GFP融合蛋白的细胞系，是非常低的和其他GFP融合蛋白的表达瞬时引入到这些细胞可以很容易地检测到上述的背景绿色荧光。
的示意图进行的实验中的细胞克隆，满分测量确保的ACF1或SNF2h击倒E4orf4诱导的细胞死亡的效果示于图。 4。击倒的基因表达的多西环素治疗所需的时间可以有所不同，这取决于其水平应减少的蛋白质的稳定性。对于ACF1和SNF2h，72小时处理，在蛋白质水平上所需的高效击倒。
图5示出了表达E4orf4和GFP和DAPI染色的细胞核与稠或分散形态的外观表现为接受的细胞死亡的细胞的例子， 图6示出了一个代表性的实验证明的结果导致了，多西环素诱导ACF1击倒增加E4orf4刺激的细胞死亡（ 图6A）。增加并不会导致增加E4orf4水平（ 图6B）。此外，恢复ACF1强力霉素诱导的细胞削弱E4orf4毒性增加的水平在未诱导的细胞（ 图6）中观察到的。
图1。地图的pSuperior.neo + GFP质粒。的地图显示四环素诱导的H1启动子驱动的shRNA表达和PGK启动子驱动的新GFP融合蛋白的表达。该地图是适用，从OligoEngine pSuperior手册。
图2。鉴定的新霉素抗性菌落。含有菌落的板图像（A）和（B）的单菌落示。通过以下方式获得的菌落在含有新霉素的选择性培养基中培养14天的细胞。
图3。审核击倒效率在选定的菌落细胞新霉素的存在下，在选择的几个菌落接种于复孔。以及每个样品诱导的多西环素（+）和一个阱被留下未处理的（ - ）。蛋白质的提取72小时后诱导和层析，SDS-PAGE上。 Western blot法染色依次与抗体以SNF2h和α-微管蛋白的（作为装载控制），，并显示SNF2h在诱导和控制细胞水平。
图4。连续步骤的实验显示，包括多西环素治疗，以达到ACF1或SNF2h敲除，转染恢复ACF1或SNF2h表达或引入EMP 规划一个典型的击倒DAPI检测实验。性载体和介绍E4orf4或者其相应的空载体导入细胞，分析的结果。多西环素处理板以红色显示（DOX）和控制板被标记为蓝色。 点击此处查看大图 。
图5。 E4orf4诱导的细胞死亡检测的DAPI检测细胞经历了图4中描述的各种治疗与E4orf4-特异性抗体和DAPI固定和染色，以可视化的转染细胞的细胞核。这种特殊的照片是从一个样品中含有E4orf4和控制绿色荧光蛋白。 （A）GFP。 （B）E4orf4。 （C）DAPI。 （D）合并后的图像。白色箭头标记GFP和E4orf4转染的细胞，包含细胞核与细胞凋亡形态。红色箭头标记与不规则形状不计入凋亡细胞的细胞核。星号标记的有丝分裂核或细胞核，只是划分。
图6。 ACF1击倒提高E4orf4诱导的细胞死亡。（A）-shRNA组四环素诱导的启动子表达ACF1从T-REX-293-源性细胞系的细胞被诱导，用强力霉素（DOX）或不及时治疗（阿霉素）。三天后，细胞转染与表达E4orf4（+ E4orf4）或空载体（E4orf4）与空载体，呈现耐引进沉默的shRNA质粒表达绿色荧光蛋白标记的ACF1突变。转染后，用抗体染色E4orf424小时用DAPI固定细胞。诱导的细胞死亡，测定由上述的DAPI检测和百分比òf压缩或分散核转染细胞进行了测定。示出了一个代表性实验重复3次，及误差棒表示标准偏差。 （B）平行板细胞收获Western blot分析。染色的抗体E4orf4，GFP和ACF1的印迹。内源性ACF1和ACF1-GFP在两个不同的面板。
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Discussion
敲除特定基因的表达，是一个重要的贡献的一种蛋白质调控途径的调查方法。由于构击倒必需基因的表达产生负面影响细胞的增殖，他们的研究可能需要稳定的条件击倒系统的siRNA或应用程序无论是短暂的介绍。生成的稳定的细胞系的能力对于药物引起的这里描述的shRNA表达，提供了一个优势，在许多细胞系中，这可能不是高效的瞬时转染，并在使用的病毒，需要重复制备，并有时一个额外的短长期的选择。一旦生成，细胞株，不需要额外的准备。此外，在我们的手中，瞬时转染的shRNA结构相比，在选定的shRNA表达细胞株的诱导效率较低撞倒基因表达。这是建议编然而，以确定在每个实验中，药物引起的击倒仍然很有效率。使用稳定的细胞系基因表达的条件击倒一个潜在的缺点是，他们可能获得额外的变化，在选择过程中，可能会影响实验结果。然而，为了克服这个问题，人们可以进行实验在两个平行的细胞系或表达短发夹耐WT蛋白的质粒通过引入扭转击倒效果。如果WT蛋白消除的shRNA的效果，那么无性系的效果可以被排除。
古典，caspase依赖的细胞凋亡，可检测多种方法，包括检测caspase激活，膜联蛋白-V染色，染色隧道的一个子G1的细胞群，检测用流式细胞仪等10。但是，E4orf4诱导一种非经典的，在许多细胞系和几种方法中的胱天蛋白酶非依赖性细胞死亡细胞凋亡检测是不适用于检测细胞死亡6,7,11,12这种独特的模式。先前已表明，最典型的形态与E4orf4诱导的细胞死亡，包括膜皱缩，核固缩或碎裂，细胞支队13。因此，我们通常衡量E4orf4诱导的细胞死亡，通过测定核固缩，碎裂，或细胞的损失。
利用DAPI检测时，应特别注意以下几点：1）为了保持最佳的客观性的测试，强烈建议该法将进行“盲时尚”，所以，数数的人细胞核与细胞凋亡形态的细胞中含有不知道的样品标识。 2）建议保持严格的标准，以确定有丝分裂的核或核unev的与核的凋亡形态，不应该被混淆EN形态（ 见图5）。额外的细胞死亡的检测，也可以作为一个读出的实验中，如集落形成细胞的存活分析8。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是支持（部分）以色列科学基金会（批准11分之399），德意志研究联合会（DFG）的框架内，德国和以色列的项目合作（DIP）和拉巴波特家庭研究所的研究工作的医学科学。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High glucose DMEM | Gibco | 41965 | |
| Tet system approved FBS | Clontech | 631106 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | |
| T-REx-293 cells | Invitrogen | R710-07 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| pSuperior.neo+GFP plasmid | OligoEngine | VEC-PBS-0007/0008 | |
| jetPIE | Polyplus transfection | 101-40 | |
| doxycycline | Sigma | D9891 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
References
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