Summary
Bidrag av ACF kromatin remodeling faktor til E4orf4-indusert celledød ble målt. Protokollen inkluderer valg av cellekloner hvori doksycyklin behandling induserer betinget knockdown av ACF subenheter Acf1 og SNF2h, og bruk av DAPI analysen å måle E4orf4-indusert celledød i induserbare cellelinjer.
Abstract
Funksjonell inaktivering av genuttrykk i mammalske celler er avgjørende for studiet av bidraget av et protein av interesse for ulike veier 1,2. Imidlertid er betinget knockdown av genekspresjon kreves i tilfeller når konstitutive knockdown ikke er tolerert av celler for en lang tidsperiode 3-5. Her beskriver vi en protokoll for utarbeidelse av cellelinjer slik betinget knockdown av subenheter av ACF kromatin remodeling faktor. Disse cellelinjer lette fastsettelsen av bidraget fra ACF til induksjon av celledød ved adenovirus E4orf4 protein 6. Sekvenser som koder korte hårnål RNAS for Acf1 og SNF2h subenheter av ACF kromatin remodeling faktor ble klonet ved siden av en doksycyklin-induserbar promoter i et plasmid som også inneholder et gen for neomycin resistens-genet. Neomycin-resistente cellekloner ble selektert i nærvær av G418 og isolert. De resulterende cellelinjer ble indusert veddoksycyklin behandling, og en gang Acf1 eller SNF2h ekspresjonsnivåer ble redusert, ble cellene transfektert med et plasmid som koder E4orf4 eller tom vektor. For å bekrefte den spesifikke effekten av shRNA konstruerer, ble Acf1 eller SNF2h protein nivåer restaurert til WT nivåer ved cotransfection med et plasmid uttrykker Acf1 eller SNF2h som ble gjengitt resistente mot shRNA ved innføring av tause mutasjoner. Evnen E4orf4 å indusere celledød i de ulike prøvene ble bestemt ved en DAPI assay hvori frekvensen av utseendet atomkjerner med apoptotiske morfologier i transfekterte cellepopulasjon ble målt 7-9.
Protokollen beskrevet her kan benyttes for bestemmelse av den funksjonelle bidraget av ulike proteiner til induksjon av celledød ved deres protein partnerne i tilfeller når konstitutive knockdown kan være celle dødelige.
Protocol
1. Generasjon av Induserbare Cell Lines
- Før forsøket en må finne den minimale konsentrasjon av medikamentet G418 som dreper alle celler som brukes for fremstilling av de ønskede cellelinjer. For dette formålet, plate cellene av valg i flere dupliserte platene på 70% sammenflyting i mediet som skal brukes i løpet av eksperimentet og legge økende konsentrasjoner av G418 (0-1,000 ug per ml). Overvåke cellene daglig for å bestemme den minimale konsentrasjonen G418 som dreper celler effektivt. Celledød er observert i løpet av 3-7 dager.
- Før generasjon cellelinjer anbefales det å verifisere ved forbigående transfeksjon analysene som plasmidet uttrykker shRNA kan redusere til en viss grad ekspresjon av genet under studien. Dette kan gjøres i en hvilken som helst cellelinje som effektivt kan transfektert.
- Plate T-rex-293 celler ved en tetthet på rundt 5x10 6 celler pr 10 cm plate i 8 ml DMEM medium (inneholdende 10% Tet systammen godkjent FBS, 2 mM L-glutamin, 100 enheter per ml penicillin og 0,1 mg per ml streptomycin, 5 ug per ml blasticidin). Inkuber platene over natten ved 37 ° C, 5% CO 2.
- På den påfølgende dagen, bytter mediet til 8 ml friskt medium før transfeksjon.
- Transfektere cellene med 10 ug pSuperior.neo + GFP plasmid (figur 1) koding Acf1 eller SNF2h shRNA drevet av en tetracyklin-induserbar H1 promotor, samt neomycin-resistens genet fusjonert til GFP og drives av en konstitutiv PGK promoter. Legg DNA til 500 pl av 150 mM NaCl. Tilsett jetPIE reagens til en annen porsjon av 500 pl av 150 mM NaCl i 2 pl per ug DNA. Tilsett jetPIE løsningen til DNA og bland godt ved å virvle. Inkuber i 15 minutter ved romtemperatur. Forsiktig pipetteres DNA komplekser på de 10 cm plater som inneholder 70-80% confluent celler. Returner platene til inkubatoren.
- Den neste dag erstatte mediet med et selektivt medium (DMEM medium sombeskrevet ovenfor inneholdende en ytterligere 500 ug per ml G418).
- For de neste to uker overvåke cellene og erstatte selektivt medium med en lignende friskt medium hver 3-4 dager inntil kolonier vises og kan visualiseres uten mikroskop.
- Før isolering av kolonier, forberede 24-brønns plater med selektivt medium.
- Identifiser koloniene ved øyet, og merke deres plassering på bunnen av platen ved hjelp av et farget merke. Kontroller under mikroskop som koloniene er godt atskilt.
- I det sterile hette, aspirer mediet fra platen, forsiktig skylle med varm PBS og aspireres godt alle gjenværende væske. Tilsett 3 pl 0,25% trypsin / EDTA til en koloni på plate. Pipetter trypsin ganger til cellene løsner og legge dem til en av brønnene i 24-brønns plate. Gjenta dette for flere andre kolonier på plate.
- Dyrke cellene ved 37 ° C, 5% CO 2 inntil de fyller brønnen. Deretter delt cellene avledet frahver av de opprinnelige kolonier i tre brønner, hver i en separat 12-brønners plate, og inkuber over natten.
- På den følgende dag, erstatte mediet i en plate med medium inneholdende 1 pg pr ml doksycyklin fra en stamløsning fremstilt i dobbelt-destillert vann (1-5 mg per ml). Erstatt mediet i en kontroll plate med medium uten doksycyklin. Inkuber cellene for 72 timer ved 37 ° C, 5% CO 2.
- Høste celler fra en behandlet og en ubehandlet brønn av hver celle klon for utarbeidelse av proteinekstrakter og Western blot analyse for å fastslå effektiviteten av Acf1 eller SNF2h knockdown. Bruk antistoffer mot Acf1 eller SNF2h samt antistoffer mot alfa-tubulin, tjener som en lasting kontroll. Bruke celler i den tredje brønnen, forblir ubehandlet, for utvidelse av utvalgte cellekloner hvori doksycyklin tillegg førte til minst 50% reduksjon i nivået av proteinet under studien. Fryse aliquoter av disse cellene i 90% FBS, 10% DMSO for videre bruk.
- Plate celler i det selektive medium i 10 cm plater. Legg doksycyklin ved 1 pg pr ml til halvdel platene og inkuber ved 37 ° C, 5% CO 2 i 48-72 timer (se figur 4).
- Etter 48-72 timers, trypsinize cellene fra hver gruppe av celler, telle dem, og plate 1.5x10 6 celler pr 6 cm plate i samme medium, med eller uten doksycyklin. Inkuber cellene ved 37 ° C, 5% CO 2 natten. Plan slik at hver gruppe av plater fra seksjon 2,1 vil gi cellene for tolv 6 cm plater, inkludert to dubletter for DAPI analysen for hvert punkt samt en plate for Western blot-analyse av hver prøve (se figur 4).
- På følgende dag transfektere cellene i 6 cm plater med følgende kombinasjoner av plasmider: 1 ug av et tomt plasmid eller en identisk mengde av plasmidet koding E4orf4, sammen med 4 ug av en vektoruttrykker Acf1-GFP eller SNF2h-GFP gjengitt resistente mot shRNA i cellekloner ved innføring av tause mutasjoner eller 3 ug av den tilsvarende tomme vektor og 1 ug plasmid uttrykker GFP (figur 4). Bruk jetPIE reagens som beskrevet ovenfor (10 ul per 5 ug DNA) for å forberede transfeksjon mix. For hver prøve, utarbeide en transfeksjon blanding for tre plater.
- Etter en 15 min inkubering av DNA med jetPIE reagenset ved romtemperatur, forsiktig pipetteres like mengder DNA komplekser fra hver transfeksjon blanding bort tre 6 cm plater og inkuber ved 37 ° C, 5% CO 2 natten.
3. DAPI Assay i transfekterte celler
- Den neste dagen, trekke proteiner fra en plate per prøve for Western blot analyse for å fastslå at Acf1 eller SNF2h er effektivt slått ned og at E4orf4 ble uttrykt likt i de ulike prøvene.
- Aspirer mediet fra platene beregnet for DAPIassay vaske platene forsiktig med PBS og tilsett 1 ml 4% paraformaldehyd fremstilt i PBS for å dekke cellene. Tilberedning av paraformaldehyd løsning og behandling av cellene med dette kjemiske bør utføres i en kjemisk hette. Inkuber i 15 minutter ved romtemperatur uten risting.
- Aspirer paraformaldehyd og vask tre ganger med PBS, vuggende ved romtemperatur i 5 min hver gang. Tilsett 80% etanol holdt ved -20 ° C og inkuber ved -20 ° C i minst 1 time. Platene kan holdes under etanol ved -20 ° C i flere dager, så lenge de er forseglet brønnen for å forhindre etanol fordampning og tørking.
- Aspirer etanol og vask cellene to ganger med PBS og en gang med PBS-BT (PBS inneholdende 0,5% BSA og 0,05% Tween-20), vuggende ved romtemperatur i 5 min hver gang.
- Å hindre ikke-spesifikk antistoffbinding, blokkere cellene i 1 ml PBS-buffer inneholdende 10 BT% geit serum i 20 min mens rock ved romtemperatur. Deretter vaske than celler to ganger i PBS-BT, 5 min hver vask.
- Inkuber cellene med det primære antistoff (en E4orf4-spesifikt antistoff i vårt tilfelle) i 1 ml PBS-BT i 1 time mens rock ved romtemperatur. Deretter vaskes to ganger i PBS-BT og en gang i PBS inneholdende 0,1% BSA, 5 min hver vask.
- Inkuber cellene i 1 ml PBS-0,1% BSA inneholdende riktig sekundær fluorescently-merket antistoff og 0,5 ug per ml endelig konsentrasjon av DAPI i 40 min mens rock ved romtemperatur i mørket. Deretter vaskes med PBS i 5 min, tørke godt ved aspirasjon og holde platene opp ned i ytterligere en time til over natten for å oppnå fullstendig tørking. Deretter montere dekselet lysbilder på cellene ved hjelp Fluoromount-G løsning. Hold platene ved 4 ° C i mørke inntil klar til å telle den apoptotiske kjerner.
- Spør en kollega til å identifisere de forskjellige platene med nye tall, så teller apoptotisk kjerner i de ulike prøvene kan gjøres på en objektiv måte.
- Visualiser cellene under en upright fluorescerende mikroskop med en forstørrelse på 400X (i luft) eller 630X (i immersjonsolje). Identifisere transfekterte celler som er farget for de ulike proteiner uttrykt i hver prøve, og telle antall av kondensert eller fragmenterte atomkjerner visualisert ved DAPI farging innenfor transfekterte cellepopulasjon. Overvåke flere felt og telle en total på minst 200 transfekterte celler.
- Beregne prosentandelen av atomkjerner med apoptotisk morfologi innen transfekterte cellepopulasjon. Gjenta eksperimentet, med duplikater, 2-3 ganger beregne statistisk signifikans av endringer mellom de forskjellige prøver.
4. Representant Resultater
Effektiviteten av innhenting kolonier hvor betinget knockdown av genekspresjon har vært vellykket er variabel, avhengig av genet som er involvert. I våre hender, fikk vi syv vellykkede kolonier av 12 testet for Acf1 og 6 av 18 for SNF2h. Figur 2 shOWS et representativt tallerken utvalgte cellekloner (figur 2A), samt en enkelt koloni (figur 2B). Fig. 3 viser et representativt klatt fremstilt med proteiner utvunnet celler av ulike kloner dyrket i nærvær eller fravær av doksycyklin i 72 timer. Blot var farget med antistoffer mot SNF2h og til alfa-tubulin, som fungerer som en belastning kontroll. To av klonene (nummer 4 og 5) viste en sterk reduksjon i SNF2h nivåer upon doksycyklin induksjon. Det bør bemerkes at selv om pSuperior.neo + GFP plasmid (figur 1) benyttes til generering av de cellelinjer koder en neo-GFP fusjonsprotein, den grønne fluorescens i de stabile cellelinjer var svært lav og ekspresjon av andre GFP fusjonsproteiner introdusert forbigående inn i disse cellene kan lett oppdages over bakgrunnen grønne fluorescens.
En skjematisk fremstilling av eksperimenter utført i cellekloner til meaat effekten av Acf1 eller SNF2h knockdown på E4orf4-indusert celledød er vist i fig. 4. Den nødvendige tid for knockdown av genekspresjon ved doksycyklin behandling kan variere avhengig av stabiliteten av proteinet hvis nivåer bør reduseres. For Acf1 og SNF2h, ble en 72 timers behandling er nødvendig for effektiv knockdown på protein nivå.
Figur 5 viser et eksempel på celler som uttrykker E4orf4 og GFP og gjennomgår celledød manifestert av utseendet av DAPI-beiset atomkjerner med en kondensert eller fragmenterte morfologi. Figur 6 viser resultatene av et representativt eksperiment som viser at doksycyklin-indusert Acf1 knockdown førte til en øke i E4orf4-stimulert celledød (figur 6A). Denne økningen ikke skyldes en økning i E4orf4 nivåer (figur 6B). Videre avtok restaurering av Acf1 til doksycyklin-induserte celler økningen i E4orf4 toksisitet til nivåene observert i uninduced celler (figur 6).
Figur 1. Kart over pSuperior.neo + GFP plasmid. Kartet viser tetracyklin-induserbar H1 promoter kjøring shRNA uttrykk og PGK promoter kjører uttrykk for en neo-GFP fusion protein. Kartet ble tilpasset fra OligoEngine pSuperior manualen.
Figur 2. Identifikasjon av neomycin-resistente kolonier. Bilder fra en plate som inneholder kolonier (A) og av en enkelt koloni (B) er vist. Koloniene ble oppnådd ved dyrking av cellene i 14 dager i et selektivt medium inneholdende neomycin.
Figur 3. Undersøkelse av knockdown effektivitet i utvalgte kolonier. Celler av flere kolonier valgt i nærvær av neomycin ble platet i duplikatbrønner. En brønn av hver prøve ble indusert av doksycyklin (+) og en brønn ble ubehandlet (-). Proteiner ble ekstrahert 72 timer post-induksjon og kromatografert på SDS-PAGE. Western blott ble farget suksessivt med antistoffer mot SNF2h og alfa-tubulin (tjener som en lasting kontroll) og viser SNF2h nivåer i induserte og kontrollcellene.
Figur 4. Planlegger du en typisk knockdown-DAPI analysen eksperiment. Suksessive trinn i eksperimentet er vist, blant annet doksycyklin behandling for å oppnå Acf1 eller SNF2h knockdown, en transfeksjon å gjenopprette Acf1 eller SNF2h uttrykk eller å innføre en empty vektor og å introdusere E4orf4 eller dets tilsvarende tomme vektor inn i cellene, og analyse av resultatene. Doxycycline-behandlede plater er vist i rødt (Dox) og kontroll plater er merket i blått. Klikk her for å se større figur .
Figur 5. Påvisning av E4orf4-indusert celledød ved DAPI analysen. Celler som gjennomgikk de forskjellige behandlingene beskrevet i figur 4 ble fikset og farget med E4orf4-spesifikke antistoffer og DAPI å visualisere kjernen av transfekterte celler. Denne spesifikke bildet ble tatt fra en prøve som inneholder E4orf4 og kontroll GFP protein. (A) GFP. (B) E4orf4. (C) DAPI. (D) Sammenslåtte bilder. De hvite pilene mark GFP-og E4orf4-transfekterte celler som inneholder kjerner med apoptotiske morfologi. Røde pilermarkere atomkjerner med uregelmessige former som ikke regnes som apoptotisk kjerner. Asterisker mark mitotisk kjerner eller kjerner som nettopp har delt.
Figur 6. Acf1 knockdown forbedrer E4orf4-indusert celledød. (A) celler fra T-Rex-293-avledet cellelinje uttrykker Acf1-shRNA fra en tetracyclin-induserbar promoter ble indusert med doksycyklin (+ Dox) eller venstre ubehandlet (-Dox). Tre dager senere ble cellene transfektert med plasmider som uttrykker E4orf4 (+ E4orf4) eller en tom vektor (-E4orf4) sammen med en tom vektor eller et plasmid som uttrykker GFP-merket Acf1 som ble gjengitt resistente mot shRNA ved innføringen av stille mutasjoner. Cellene ble løst tjuefire timer etter transfeksjon og farget med antistoffer mot E4orf4 og med DAPI. Induksjon av celledød ble målt ved DAPI analysen beskrevet ovenfor og den prosentvise of transfekterte celler med kondensert eller fragmentert kjerner ble bestemt. En representant eksperiment med tre gjentak vises, og feilfelt representerer standardavviket. (B) Celler fra parallelle platene ble høstet for Western blot-analyse. Blot var farget med antistoffer mot E4orf4, GFP, og Acf1. Den endogene Acf1 og Acf1-GFP er vist i to separate paneler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Knockdown av spesifikke genuttrykk er en viktig tilnærming til etterforskningen av bidraget av et protein til regulatoriske veier. Siden konstituerende knockdown av uttrykk for viktige gener virker negativt celleproliferasjon, kan deres studie krever enten forbigående innføring av siRNAs eller anvendelsen av stabile betinget knockdown systemer. Generering av stabile cellelinjer med kapasitet for narkotika-indusert ekspresjon av shRNAs beskrevet her, gir en fordel fremfor transiente transfeksjoner som kanskje ikke er effektiv i mange cellelinjer, og over bruken av virus som krever gjentatt forberedelse og noen ganger en ekstra korte Begrepet utvalg. De cellelinjer, når genererte, krever ikke ytterligere forberedelser. Videre i våre hender, var forbigående transfeksjoner av shRNA konstruerer mye mindre effektiv i å slå ned genuttrykk sammenlignet med induksjon av shRNA uttrykk i de valgte cellelinjer. Det er anbefalted imidlertid å fastslå i hvert forsøk at legemiddelindusert knockdown forble effektiv. En potensiell ulempe ved bruk av stabile cellelinjer som betinget knockdown av genekspresjon er at de kan ha ervervet ytterligere endringer i utvelgelsesprosessen som potensielt påvirke utfallet av eksperimenter. Imidlertid, for å overvinne dette problemet, kan en utføre eksperimentet i to parallelle cellelinjer eller reversere knockdown effekten ved innføring av et plasmid som uttrykker en shRNA-motstandsdyktig WT protein. Om WT proteinet eliminerer effekten av shRNA, deretter en klonal effekt kan utelukkes.
Klassisk, caspase-avhengige apoptose, kan bli analysert av mange metoder, inkludert påvisning av caspase aktivering, Annexin-V farging, Tunnel farging, oppdagelse av et sub-G1 cellepopulasjon av FACS osv. 10. Men induserer E4orf4 en ikke-klassisk, caspase-uavhengig celledød i mange cellelinjer og flere metoderfor apoptose deteksjon gjelder ikke for påvisning av denne unike måten å celledød 6,7,11,12. Det har tidligere vært vist at de mest typiske morfologier knyttet E4orf4-indusert celledød inkluderer membran blebbing, kjernefysisk kondens eller fragmentering, og celle løsgjøring 13. Derfor har vi vanligvis måler E4orf4-indusert celledød ved å analysere kjernefysisk kondens og fragmentering, eller celle tap.
Når utnytte DAPI analysen, bør man være spesielt oppmerksom på følgende punkter: 1) For å opprettholde optimal objektivitet testen, er det sterkt anbefalt at analysen vil bli utført i en "blind fashion", slik at den personen som teller antall av celler inneholdende atomkjerner med apoptotiske morfologier vil ikke være klar av prøven identitet. 2) Det anbefales å opprettholde strenge kriterier for å identifisere kjernefysiske apoptotiske morfologi som ikke må forveksles med mitotisk kjerner eller kjerner med unevno morfologi (se Figur 5). Ytterligere celledød analyser kan også anvendes som en lese-out av eksperimentet, som clonogenic celleoverlevelse analyser 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet (delvis) av Israel Science Foundation (Grant 399/11), ved Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) innenfor rammen av Den tysk-israelske Prosjekt Samarbeid (DIP), og ved Rappaport Family Institute for Research in Medisinsk fakultet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High glucose DMEM | Gibco | 41965 | |
| Tet system approved FBS | Clontech | 631106 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | |
| T-REx-293 cells | Invitrogen | R710-07 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| pSuperior.neo+GFP plasmid | OligoEngine | VEC-PBS-0007/0008 | |
| jetPIE | Polyplus transfection | 101-40 | |
| doxycycline | Sigma | D9891 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
References
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science (New York, N.Y). 296, 550-553 (2002).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference. Cancer. 2, 243-247 (2002).
- Czauderna, F. Inducible shRNA expression for application in a prostate cancer mouse model. Nucleic acids research. 31, e127 (2003).
- Matsukura, S., Jones, P. A., Takai, D. Establishment of conditional vectors for hairpin siRNA knockdowns. Nucleic acids research. 31, e77 (2003).
- Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. Journal of. 77, 8957-8961 (2003).
- Brestovitsky, A., Sharf, R., Mittelman, K., Kleinberger, T. The adenovirus E4orf4 protein targets PP2A to the ACF chromatin-remodeling factor and induces cell death through regulation of SNF2h-containing complexes. Nucleic acids research. 39, 6414-6427 (2011).
- Livne, A., Shtrichman, R., Kleinberger, T. Caspase activation by adenovirus E4orf4 protein is cell line-specific and is mediated by the death receptor pathway. J. Virol. 75, 789-798 (2001).
- Shtrichman, R., Kleinberger, T. Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosis in transformed cells. J. Virol. 72, 2975-2982 (1998).
- Shtrichman, R., Sharf, R., Kleinberger, T. Adenovirus E4orf4 protein interacts with both Ba and B' subunits of protein phosphatase 2A, but E4orf4-induced apoptosis is mediated only by the interaction with Ba. Oncogene. 19, 3757-3765 (2000).
- Galluzzi, L. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell death and differentiation. 16, 1093-1107 (2009).
- Lavoie, J. N., Nguyen, M., Marcellus, R. C., Branton, P. E., Shore, G. C. E4orf4, a novel adenovirus death factor that induces p53-independent apoptosis by a pathway that is not inhibited by zVAD-fmk. J. Cell Biol. 140, 637-645 (1998).
- Li, S. The adenovirus E4orf4 protein induces growth arrest and mitotic catastrophe in H1299 human lung carcinoma cells. Oncogene. 28, 390-400 (2009).
- Lavoie, J. N., Champagne, C., Gingras, M. -C., Robert, A. Adenovirus E4 open reading frame 4-induced apoptosis involves dysregulation of Src family kinases. J. Cell Biol. 150, 1037-1055 (2000).
