Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Beredning av cell-linjer för villkorlig Knockdown av genuttryck och Mätning av knockdown Effekter på E4orf4-inducerad celldöd

Published: October 21, 2012 doi: 10.3791/4442

Summary

Bidrag från ACF kromatin remodeling faktor till E4orf4-inducerad celldöd uppmättes. Protokollet innehåller val av cellkloner som doxycyklin behandling inducerar villkorlig ÖVERVÄLDIGANDE av ACF subenheter Acf1 och SNF2h, och användning av DAPI analys för att mäta E4orf4-inducerad celldöd i ledningarna inducerbara cell.

Abstract

Funktionell inaktivering av genuttryck i däggdjursceller är avgörande för att studera bidraget av ett protein av intresse för olika vägar 1,2. Emellertid är villkorad ÖVERVÄLDIGANDE av genuttryck erfordras i de fall då konstitutiv ÖVERVÄLDIGANDE inte tolereras av celler under en lång tidsperiod 3-5. Här beskriver vi ett protokoll för beredning av cellinjer som möjliggör villkorlig ÖVERVÄLDIGANDE av subenheter av ACF kromatin remodeling faktor. Dessa cellinjer underlättar bestämningen av bidrag ACF till induktion av celldöd genom adenovirus E4orf4 proteinet 6. Sekvenser som kodar för korta hårnål RNA för Acf1 och SNF2h subenheter av ACF kromatin remodeling faktor klonades intill en doxycyklin-inducerbar promotor i en plasmid som också innehåller en gen för neomycinresistensgenen. Neomycin-resistenta cellkloner utvaldes i närvaro av G418 och isolerad. De resulterande cellinjerna inducerades genomdoxycyklin behandling, och en gång Acf1 eller SNF2h uttrycksnivåer reducerades, transfekterades cellerna med en plasmid som kodar E4orf4 eller en tom vektor. För att bekräfta den specifika effekten av shRNA konstruktionerna var Acf1 eller SNF2h proteinnivåer återställas till WT nivåer genom samtransfektion med en plasmid som uttrycker Acf1 eller SNF2h som gjorts resistenta mot shRNA genom införandet av tysta mutationer. Förmågan hos E4orf4 att inducera celldöd i de olika proverna bestämdes genom en DAPI-analys, i vilken frekvensen av uppkomsten av kärnor med apoptotiska morfologier i den transfekterade cellpopulationen mättes 7-9.

Protokollet som beskrivs här kan användas för bestämning av den funktionella bidraget av olika proteiner till induktion av celldöd genom deras proteinprodukter partner i de fall när konstitutiva ÖVERVÄLDIGANDE kan vara cell dödlig.

Protocol

1. Generering av linjer Inducerbara Cell

  1. Före experimentet måste man finna den minimala koncentrationen av läkemedlet G418 som dödar alla de celler som används för framställning av de önskade cellinjema. För detta ändamål, platta celler av val i flera dubbla plattor vid 70% konfluens i mediet som ska användas under experimentet och lägga ökande koncentrationer av G418 (0-1,000 ig per ml). Övervaka celler dagligen för att bestämma den minimala G418 koncentration som dödar cellerna effektivt. Celldöd observeras inom 3-7 dagar.
  2. Före generering av cellinjer rekommenderas det att verifiera av övergående transfektionsanalyser att plasmiden uttrycker shRNA kan minska i viss mån uttryck av genen under studien. Detta kan göras i vilken som helst cellinje som effektivt kan transfekteras.
  3. Platta T-REx-293-celler vid en densitet av runt 5x10 6 celler per 10 cm platta i 8 ml DMEM-medium (innehållande 10% Tet systam godkända FBS, 2 mM L-glutamin, 100 enheter per ml penicillin och 0,1 mg per ml streptomycin, 5 ng per ml blasticidin). Inkubera plattorna över natten vid 37 ° C, 5% CO 2.
  4. På följande dag, ändra mediet till 8 ml färskt medium före transfektion.
  5. Transfektera cellerna med användning 10 pg pSuperior.neo + GFP-plasmid (figur 1) kodar Acf1 eller SNF2h shRNA drivs av en tetracyklin-inducerbar promotor H1, liksom neomycin-resistens-genen fuserad till GFP och drivs av en konstitutiv PGK-promotorn. Tillsätt DNA till 500 | il av 150 mM NaCl. Tillsätt jetPIE reagenset till en annan alikvot av 500 pl av 150 mM NaCl vid 2 fil per | ig DNA. Tillsätt jetPIE lösningen till DNA och blanda väl genom skakning. Inkubera under 15 minuter vid rumstemperatur. Försiktigt pipettera DNA-komplex på de 10 cm plattor innehållande 70-80% konfluenta celler. Returnera plattorna till inkubatorn.
  6. Nästa dag ersätta mediet med ett selektivt medium (DMEM-medium sombeskrivits ovan innehållande en ytterligare 500 xg per ml G418).
  7. För de nästa två veckorna övervakar cellerna och ersätta det selektiva mediet med ett liknande färskt medium var 3-4 dag tills kolonier visas och kan visualiseras utan mikroskop.
  8. Före isolering av kolonier, framställning 24-brunnars plattor med selektivt medium.
  9. Identifiera kolonier med ögat, och markera deras läge vid botten av plattan med användning av en färgad markör. Verifiera under mikroskop att kolonierna väl separeras.
  10. I den sterila huven, aspirera mediet från plattan försiktigt skölja med varmt PBS och aspirera väl alla kvarvarande vätska. Tillsätt 3 | il av 0,25% trypsin / EDTA till en koloni på plattan. Pipettera trypsin tills cellerna lossnar och lägg dem till en av brunnarna i 24-brunnsplatta. Upprepa detta för flera andra kolonier på plattan.
  11. Odla cellerna vid 37 ° C, 5% CO 2 tills de fyller brunnen. Sedan dela celler härledda frånvardera av de ursprungliga kolonierna i tre brunnar, var och en i en separat 12-brunnars platta, och inkubera över natten.
  12. Dagen därpå, byt mediet i en platta med medium innehållande 1 pg per ml doxycyklin från en stamlösning framställts i dubbeldestillerat vatten (1-5 mg per ml). Ersätt mediet i en kontrollplatta med medium utan doxycyklin. Inkubera cellerna i 72 timmar vid 37 ° C, 5% CO 2.
  13. Harvest celler från behandlade en och en obehandlad väl i varje cell klon för beredning av proteinextrakt och Western blot-analys för att bestämma effektiviteten av Acf1 eller SNF2h ÖVERVÄLDIGANDE. Använd antikroppar mot Acf1 eller SNF2h samt antikroppar mot alfa-tubulin, som fungerar som en belastning kontroll. Använd cellerna i den tredje brunnen, lämnas obehandlad, för expansion av utvalda cellkloner i vilka doxycyklin förutom ledde till minst 50% sänkning av proteinet som studeras. Frys alikvoter av dessa celler i 90% FBS, 10% DMSO för vidare användning.
  1. Plate celler i det selektiva mediet under 10 cm plattor. Lägg doxycyklin vid 1 pg per ml till halv plattorna och inkubera vid 37 ° C, 5% CO 2 under 48-72 h (se figur 4).
  2. Efter 48-72 timmar, Trypsinisera cellerna från varje grupp av celler, räkna dem, och plattan 1.5x10 6 celler per 6 cm platta i samma medium, med eller utan doxycyklin. Inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO 2 natten. Planera så att varje grupp av plattor från punkt 2,1 ger cellerna för tolv 6 cm plattor, däribland två dubbletter för DAPI analysen för varje punkt samt en platta för Western blot-analys av varje prov (se figur 4).
  3. På följande dag transfektera cellerna i 6 cm plattor med följande kombinationer av plasmider: 1 ig av en tom plasmid eller en identisk mängd av den plasmid som kodar E4orf4, tillsammans med 4 pg av en vektoruttryckande Acf1-GFP eller SNF2h-GFP gjorts resistenta mot shRNA i cellkloner genom införande av tysta mutationer, eller 3 pg av motsvarande tomma vektorn och 1 pg plasmid som uttrycker GFP (figur 4). Använd jetPIE reagens såsom beskrivits ovan (10 pl per 5 ug DNA) för att förbereda transfektion blandningen. För varje prov, förbereda en transfektion mix för tre plattor.
  4. Efter en 15 min inkubation av DNA med den jetPIE reagenset vid rumstemperatur, försiktigt pipettera lika stora mängder av DNA-komplexen från varje transfektion blandningen på tre 6 cm plattor och inkubera vid 37 ° C, 5% CO 2 natten.

3. DAPI Analys i transfekterade celler

  1. Nästa dag, extrahera proteiner från en platta per prov för Western blot-analys för att fastställa att Acf1 eller SNF2h effektivt har knackat ned och att E4orf4 uttrycktes lika i de olika proverna.
  2. Aspirera mediet från plattorna avsedda för DAPIanalys, tvätta plattorna försiktigt med PBS och tillsätt 1 ml av 4% paraformaldehyd framställdes i PBS för att täcka cellerna. Beredning av paraformaldehydlösning och behandling av cellerna med denna kemikalie bör genomföras i ett dragskåp. Inkubera under 15 minuter vid rumstemperatur utan skakning.
  3. Aspirera paraformaldehyd och tvätta tre gånger med PBS, gungande vid rumstemperatur under 5 min varje gång. Lägg 80% etanol hölls vid -20 ° C och inkubera vid -20 ° C under minst 1 timme. Plattorna kan hållas under etanol vid -20 ° C under flera dagar, så länge som de är tätade väl för att förhindra avdunstning etanol och torkning.
  4. Aspirera etanol och tvätta cellerna två gånger med PBS och en gång med PBS-BT (PBS innehållande 0,5% BSA och 0,05% Tween-20), gungande vid rumstemperatur under 5 min varje gång.
  5. För att förhindra icke-specifik antikroppsbindning, blockera cellerna i 1 ml PBS-BT-buffert innehållande 10% getserum under 20 min medan gungande vid rumstemperatur. Tvätta sedan than celler två gånger i PBS-BT, 5 min varje tvätt.
  6. Inkubera cellerna med den primära antikroppen (en E4orf4-specifik antikropp i vårt fall) i 1 ml PBS-BT under 1 h medan gungande vid rumstemperatur. Tvätta sedan två gånger i PBS-BT och en gång i PBS innehållande 0,1% BSA, 5 minuter varje tvätt.
  7. Inkubera cellerna i 1 ml PBS-0,1% BSA innehållande den lämpliga sekundära fluorescensmärkt antikropp och 0,5 ug per ml slutlig koncentration av DAPI för 40 min medan gungande vid rumstemperatur i mörker. Tvätta sedan med PBS under 5 minuter, torka väl genom aspiration och hålla plattorna upp och ned i ytterligare en timme till över natten för att uppnå fullständig torkning. Sedan montera täckskivor på cellerna, med användning Fluoromount-G-lösning. Håll plattorna vid 4 ° C i mörker tills att räkna den apoptotiska kärnorna.
  8. Be en kollega att identifiera de olika plattorna med nya nummer, så räknar apoptotiska kärnor i de olika proven kan göras på ett opartiskt sätt.
  9. Visualisera cellerna under en upright fluorescerande mikroskop vid en förstoring av 400X (i luft) eller 630x (i immersionsolja). Identifiera transfekterade celler som är färgade för de olika proteiner som uttrycks i varje prov, och räkna antalet kondenserade eller fragmenterade kärnor visualiserades genom DAPI-färgning inuti den transfekterade cellpopulationen. Övervaka flera områden och räkna totalt minst 200 transfekterade celler.
  10. Beräkna andelen kärnor med apoptotisk morfologi i den transfekterade cellpopulationen. Upprepa försöket, med dubbletter, till 2-3 gånger beräkna den statistiska signifikansen av förändringar mellan de olika proven.

4. Representativa resultat

Effektiviteten av att erhålla kolonier som villkorad ÖVERVÄLDIGANDE av genuttryck har varit framgångsrik är variabel, beroende på den berörda genen. I våra händer fick vi 7 lyckade kolonier av 12 testas för Acf1 och 6 av 18 för SNF2h. Figur 2 shows en representativ platta av utvalda cellkloner (Figur 2A) samt en enda koloni (fig. 2B). Figur 3 visar en representativ blöt framställd med proteiner extraherade från celler av olika kloner odlas i närvaro eller frånvaro av doxycyklin i 72 timmar. Blotten färgades med antikroppar mot SNF2h och alfa-tubulin, tjänar som en belastning kontroll. Två av klonerna (nummer 4 och 5) visade en kraftig minskning SNF2h nivåer vid doxycyklin induktion. Det bör noteras att även om pSuperior.neo + GFP-plasmid (figur 1) som används för generering av cellinjer kodar en neo-GFP-fusionsproteinet, var den gröna fluorescensen i stabila cellinjer mycket låg och expression av andra proteiner GFP fusion införes transient in i dessa celler med lätthet kan upptäckas ovanför bakgrunden grön fluorescens.

En schematisk representation av de experiment som genomförs i cellkloner till MEASe till att effekten av Acf1 eller SNF2h ÖVERVÄLDIGANDE på E4orf4-inducerad celldöd visas i figur. 4. Tiden som krävs för ÖVERVÄLDIGANDE av genexpression genom doxycyklin behandling kan variera beroende på stabiliteten hos proteinet vars nivåer bör minskas. För Acf1 och SNF2h har en 72 hr behandling som krävs för effektiv knockdown på proteinnivå.

Figur 5 visar ett exempel på celler som uttrycker E4orf4 och GFP och genomgår celldöd manifesteras genom uppkomsten av DAPI-färgade kärnor med en kondenserad eller fragmenterad morfologi. Figur 6 visar resultaten av ett representativt experiment som visar att doxycyklin-inducerad Acf1 ÖVERVÄLDIGANDE ledde till ett ökning E4orf4-stimulerad celldöd (figur 6A). Denna ökning har inte resultatet av en ökning av E4orf4 nivåer (Figur 6B). Vidare minskade återställande av Acf1 till doxycyklin-inducerade celler ökningen E4orf4 toxicitet till de nivåer observerats i oinducerade celler (Figur 6).

Figur 1
Figur 1. Karta över pSuperior.neo + GFP-plasmid. Kartan visar tetracyklin-inducerbara H1 promotor som driver shRNA expression och PGK-promotorn driver uttrycket av en neo-GFP-fusionsproteinet. Kartan var anpassad från OligoEngine pSuperior manualen.

Figur 2
Figur 2. Identifiering av neomycin-resistenta kolonier. Bilder av en platta innehållande kolonier (A) och av en enda koloni (B) visas. De kolonier erhölls genom odling av cellerna under 14 dagar i ett selektivt medium innehållande neomycin.

ys "> Figur 3
Figur 3. Examination av ÖVERVÄLDIGANDE effektivitet i utvalda kolonier. Celler av flera kolonier selekteras i närvaro av neomycin ströks i dubbla brunnar. En brunn av varje prov inducerades genom doxycyklin (+) och en väl lämnades obehandlad (-). Proteiner extraherades 72 h efter induktion och kromatograferades på SDS-PAGE. Western blöt färgades successivt med antikroppar mot SNF2h och alfa-tubulin (tjänar som en belastning kontroll) och visar SNF2h nivåer i inducerade och kontroll-celler.

Figur 4
Figur 4. Planerar en typisk knockdown-DAPI analys experimentet. Successiva steg i experimentet visas, inklusive doxycyklin behandling för att uppnå Acf1 eller SNF2h ÖVERVÄLDIGANDE, en transfektion att återställa Acf1 eller SNF2h uttryck eller att införa en EMPtet vektor och att införa E4orf4 eller dess motsvarande tom vektor i cellerna, och analys av resultaten. Doxycyklin-behandlade plattor visas i rött (Dox) och styrplattorna är markerade med blått. Klicka här för att se större bild .

Figur 5
Figur 5. Detektering av E4orf4-inducerad celldöd av DAPI-analysen. Celler som genomgick de olika behandlingar som beskrivs i fig 4 fixerades och färgades med E4orf4-specifika antikroppar och DAPI att visualisera kärnorna hos transfekterade celler. Denna specifika bild togs från ett prov innehållande E4orf4 och kontroll GFP-proteinet. (A) GFP. (B) E4orf4. (C) DAPI. (D) Sammanfogade bilder. De vita pilarna mark GFP-och E4orf4-transfekterade celler som innehåller kärnor med apoptotiska morfologier. Röda pilarmarkera kärnor med oregelbundna former som inte räknas som apoptotiska kärnor. Asterisker märke mitotisk kärnor eller kärnor som just har delat.

Figur 6
Figur 6. Acf1 ÖVERVÄLDIGANDE förbättrar E4orf4-inducerad celldöd. (A) Celler från T-REx-293-härledd cellinje som uttrycker Acf1-shRNA från en tetracyklin-inducerbar promotor inducerades med doxycyklin (+ Dox) eller lämnas obehandlade (-Dox). Tre dagar senare, cellerna transfekterades med plasmider som uttrycker E4orf4 (+ E4orf4) eller en tom vektor (-E4orf4) tillsammans med en tom vektor eller en plasmid som uttrycker GFP-märkt Acf1, som gjorts resistent mot shRNA genom införandet av tysta mutationer. Cellerna fixerades 24 timmar efter transfektion och färgades med antikroppar mot E4orf4 och med DAPI. Induktion av celldöd mättes genom DAPI-analysen beskriven ovan och den procentuella of transfekterade celler med kondenserade eller fragmenterade kärnor bestämdes. Ett representativt experiment med tre replikat visas, och felstaplar representerar standardavvikelsen. (B) Celler från parallella plattor skördades för Western blot-analys. Blotten färgades med antikroppar mot E4orf4, GFP, och Acf1. Den endogena Acf1 och Acf1-GFP visas i två separata paneler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ÖVERVÄLDIGANDE av specifika genuttryck är en viktig metod för undersökning av bidraget av ett protein till regulatoriska vägar. Eftersom konstitutiv ÖVERVÄLDIGANDE av uttryck av essentiella gener negativt påverkar celltillväxt, kan deras studie kräva antingen övergående införande av siRNA eller tillämpningen av stabila villkorade knockdown system. Generering av stabila cellinjer med kapacitet för läkemedelsinducerad expression av shRNAs beskrivs här, ger en fördel över transienta transfektioner som inte kan vara effektivt i många cellinjer, och över användningen av virus som kräver upprepad beredning och ibland en ytterligare kort- Termen urval. De cellinjer, när genererade, inte kräver ytterligare förberedelser. Dessutom, i våra händer, var övergående transfektioner av shRNA konstruktioner mycket mindre effektiv i att knacka ner genuttryck jämfört med induktion av shRNA uttryck i de valda cellinjer. Det är rekommenderared dock att fastställa i varje experiment som läkemedelsinducerade knockdown förblev effektiv. En potentiell nackdel av användningen av stabila cellinjer för villkorad ÖVERVÄLDIGANDE av genuttryck är att de kan ha förvärvat ytterligare förändringar under urvalsprocessen som skulle kunna påverka resultatet av experiment. Emellertid, för att övervinna detta problem, kan man utföra experimentet i två parallella cellinjer eller vända ÖVERVÄLDIGANDE effekten genom introduktion av en plasmid som uttrycker en shRNA-resistent WT-proteinet. Om WT proteinet eliminerar effekten av shRNA, sedan en klonal effekt kan uteslutas.

Klassiskt, kaspas-beroende apoptos, kan analyseras av flera metoder, inklusive detektering av kaspasaktivering, annexin-V färgning, Tunnel färgning, detektion av en sub-G1 cellpopulationen genom FACS mm 10. Men inducerar E4orf4 en icke-klassisk, kaspas-oberoende celldöd i många cellinjer och flera metoderför apoptos upptäckt är inte tillämpliga för detektering av denna unika sätt att celldöd 6,7,11,12. Det har tidigare visat att de mest typiska morfologier förknippas med E4orf4-inducerad celldöd inkluderar membran blåsbildning, kärnkraft kondens eller fragmentering och cell lossnar 13. Därför mäter vi brukar E4orf4-inducerad celldöd genom analys nukleär kondensation och fragmentering eller cell förlust.

Vid användning av DAPI analysen bör man ägna särskild uppmärksamhet åt följande punkter: 1) För att bibehålla optimal objektivitet testet är det starkt rekommenderat att analysen kommer att utföras i en "blind sätt" så att den person som räknar antalet av celler innehållande kärnor med apoptotiska morfologier kommer inte att vara medveten om provets identitet. 2) Det rekommenderas att hålla stränga kriterier för att identifiera kärn apoptotiska morfologier som inte bör förväxlas med mitotiska kärnor eller kärnor med unevsv morfologier (se figur 5). Ytterligare celldöd analyser kan också användas som en utlästa av experimentet, såsom klonogena analyser cellöverlevnad 8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes (delvis) av Israel Science Foundation (Grant 399/11), av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) inom ramen för den tysk-israeliska projektsamarbete (DIP), och av Rappaport Family Institute for Research in Medical Sciences.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
High glucose DMEM Gibco 41965
Tet system approved FBS Clontech 631106
L-glutamine Gibco 25030
Pen Strep Gibco 15140
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200
T-REx-293 cells Invitrogen R710-07
G418 Sigma A1720
blasticidin Invitrogen R210-01
pSuperior.neo+GFP plasmid OligoEngine VEC-PBS-0007/0008
jetPIE Polyplus transfection 101-40
doxycycline Sigma D9891
paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma D9542
Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science (New York, N.Y). 296, 550-553 (2002).
  2. Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference. Cancer. 2, 243-247 (2002).
  3. Czauderna, F. Inducible shRNA expression for application in a prostate cancer mouse model. Nucleic acids research. 31, e127 (2003).
  4. Matsukura, S., Jones, P. A., Takai, D. Establishment of conditional vectors for hairpin siRNA knockdowns. Nucleic acids research. 31, e77 (2003).
  5. Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. Journal of. 77, 8957-8961 (2003).
  6. Brestovitsky, A., Sharf, R., Mittelman, K., Kleinberger, T. The adenovirus E4orf4 protein targets PP2A to the ACF chromatin-remodeling factor and induces cell death through regulation of SNF2h-containing complexes. Nucleic acids research. 39, 6414-6427 (2011).
  7. Livne, A., Shtrichman, R., Kleinberger, T. Caspase activation by adenovirus E4orf4 protein is cell line-specific and is mediated by the death receptor pathway. J. Virol. 75, 789-798 (2001).
  8. Shtrichman, R., Kleinberger, T. Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosis in transformed cells. J. Virol. 72, 2975-2982 (1998).
  9. Shtrichman, R., Sharf, R., Kleinberger, T. Adenovirus E4orf4 protein interacts with both Ba and B' subunits of protein phosphatase 2A, but E4orf4-induced apoptosis is mediated only by the interaction with Ba. Oncogene. 19, 3757-3765 (2000).
  10. Galluzzi, L. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell death and differentiation. 16, 1093-1107 (2009).
  11. Lavoie, J. N., Nguyen, M., Marcellus, R. C., Branton, P. E., Shore, G. C. E4orf4, a novel adenovirus death factor that induces p53-independent apoptosis by a pathway that is not inhibited by zVAD-fmk. J. Cell Biol. 140, 637-645 (1998).
  12. Li, S. The adenovirus E4orf4 protein induces growth arrest and mitotic catastrophe in H1299 human lung carcinoma cells. Oncogene. 28, 390-400 (2009).
  13. Lavoie, J. N., Champagne, C., Gingras, M. -C., Robert, A. Adenovirus E4 open reading frame 4-induced apoptosis involves dysregulation of Src family kinases. J. Cell Biol. 150, 1037-1055 (2000).

Tags

Genetik Cellulär biologi molekylärbiologi mikrobiologi medicin celldöd adenovirus E4orf4 DAPI analys villkorlig ÖVERVÄLDIGANDE shRNA
Beredning av cell-linjer för villkorlig Knockdown av genuttryck och Mätning av knockdown Effekter på E4orf4-inducerad celldöd
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brestovitsky, A., Sharf, R.,More

Brestovitsky, A., Sharf, R., Kleinberger, T. Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death. J. Vis. Exp. (68), e4442, doi:10.3791/4442 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter