Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Readout מולקולרי של הסתגלות חוש ריח לטווח הארוך ב doi: 10.3791/4443 Published: December 22, 2012

Summary

כאן אנו מתארים readout מולקולרי של הסתגלות חוש ריח לטווח הארוך ב

Abstract

במהלך גירוי מתמשך נוירונים החושיים ביותר יהיה להתאים את תגובתם על ידי הפחתת רגישותם לאות. תגובת ההסתגלות מסייעת תשומת לב צורה וגם מגנה על תאים מגירוי יתר. הסתגלות בתוך מעגל חוש הריח של ג elegans תואר לראשונה על ידי קולבר וBargmann 1,2. הנה, החוקרים הגדירו פרמטרים של הפרדיגמה הסתגלות חוש הריח, שהם משמשים לעיצוב מסך גנטי לבודד מוטנטים פגומים ביכולתם להסתגל לריחות נדיפים חשו על ידי התאים מסוג C (AWC) נוירונים אגף Amphid החושיים. כאשר wildtype ג חי elegans נחשפות לריח אטרקטיבי AWC-חש 3 למשך 30 דקות הם יתאימו את היענותם לריח ואז יהיה להתעלם מריח ההתאמה בבדיקה התנהגותית chemotaxis ל~ 1 שעה. כאשר wildtype ג חי elegans נחשפות לריח אטרקטיבי AWC-חש ל~ 1 שעה ואז הם יוכלו להתעלם מהריח בהתאמת acבדיקה התנהגותית hemotaxis ל~ 3 שעות. שני שלבים אלה של הסתגלות חוש ריח בג elegans תואר כהסתגלות קצרת טווח הרחה (מושרה לאחר חשיפת ריח דק 30), והסתגלות הרחה ארוכת טווח (הנגרם לאחר חשיפת ריח דק 60). מאוחר יותר לעבוד מאטואל et al., 4 חשפו חלבון קינאז G (pkg) נקרא EGL-4 שנדרש עבור שניהם הסתגלות הרחה קצרת טווח וארוך טווח בנוירונים AWC. EGL-4 החלבונים מכילים רצף לוקליזציה גרעיני שהוא הכרחי לתגובות ארוכות טווח הרחת הסתגלות אך dispensable לתגובות הסתגלות הרחה קצרת טווח ב4 AWC. על ידי תיוג EGL-4 בחלבון פלואורסצנטי ירוק, אפשר היה לדמיין את הלוקליזציה של EGL-4 בAWC במהלך חשיפה הממושכת ריח. שימוש הפונקציונלי מלא זה GFP-tagged EGL-4 (GFP :: EGL-4) מולקולה הצלחנו לפתח readout מולקולרי של הסתגלות חוש ריח לטווח ארוך ב5 AWC. שימוש מ 'זהreadout olecular הסתגלות הרחה היינו מסוגל לבצע שני מסכים גנטיים קדימה לאחור כדי לזהות בעלי חיים מוטנטים כי תערוכה פגומה דפוסי subcellular לוקליזציה של ה-GFP :: EGL-4 ב6,7 AWC. כאן אנו מתארים: 1) הבנייה של ה-GFP :: EGL-4 חיות מבטאות, 2) הפרוטוקול לגידול של בעלי חיים למבחני טרנסלוקציה ריח מושרה גרעיניים לטווח ארוך, ו3) הניקוד של הטווח ארוך הריח המושרה אירוע גרעיני טרנסלוקציה והתאוששות (מחדש רגישות) מGFP הגרעיני :: מדינת EGL-4.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. בנייה של ה-GFP תייגה EGL-4 בעלי חיים מבטאים

  1. שיבוט ההיתוך GFP translational :: EGL-4 תחת האמרגן לגן ODR-3 (שימוש 2678 נ"ב ישירות במעלה זרם של קודון ההתחלה): (עמ ') ODR-3 :: GFP :: EGL-4. ODR-3 כונני אמרגן הביטוי בזוגות נוירון amphid: AWA; AWB; AWC; וחולשה באפר.
  2. מזריק פלסמיד (p) ODR-3 :: GFP :: EGL-4 לחי wildtype (N2) בגיל 50 ng / μl עם סמני הזרקה משותפת תוך שימוש בטכניקות ניבטה שורת טרנספורמציה סטנדרטיות 8: (עמ ') הפרנציסקאני-1: : 9-GFP (25 ng / μl), ו( p) ODR-1 :: dsRed 10 (25 ng / μl). ODR-1 ביטוי אמרגן כוננים בזוגות AWB amphid נוירון AWC ו, וביטוי הפרנציסקאני-1 אמרגן הכוננים בcoelomocytes.
  3. להכפיף את בעלי החיים המהונדסים המבטאים את מערכי extrachromosomal המפורט בשלב 1.2 לסגולים (UV) / פרוטוקול האינטגרציה trimethylpsoralen (TMP)11.
  4. האקונומיקה לסנכרן את חי 12 ולטפח אותם על צלחות צמיחה נמטודות מדיה (NGM) המכילות OP50 E. coli לL4 הבמה. שטוף L4 חי מצלחות NGM עם M9 חיץ להסיר OP50 E. חיידקי קולי.
  5. הסר חיץ M9 ולהוסיף 50-100 μl של 30 מיליליטר פתרון TMP עובד על תולעת הגלולה בצינור microcentrifuge המ"ל 1.5 מיקרוגרם /. עטוף את צינור microcentrifuge המ"ל 1.5 בנייר כסף כדי לחסום אור הסביבה, ולהתסיס בעדינות על כתף במשך 15 דקות בצינור microcentrifuge העטוף בנייר האלומיניום 1.5 מ"ל. להעביר את התולעים בפתרון TMP / תולעת לצלחת NGM unseeded גדולה.
  6. לחשוף את התולעים בצלחת NGM לUV 350 μJ (x100) באמצעות 2400 Stratalinker. ואז להוסיף תולעים לצלחת NGM OP50 מכילה ודגירה בחושך במשך 5 שעות.
  7. פיק 50 תולעים מהונדסים לכ 10 צלחות seeded (2-5 תולעים כל צלחת). העברת P0 זה לצלחות חדשות בכל שעות 24 במשך 3 ימים.
  8. פיק F1 משובט 250nimals (חיה 1 לכל צלחת). לשכפל את חי 2-4 F2 מכל צלחת F1. בדקו חי F3 כדי לחפש 100% קו הולכה מלהסתכל (עמ ') הפרנציסקאני-1 :: דפוס ביטוי של GFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתח.
  9. Outcross קו הגמר המשולב (הים) עם בעלי חי N2 wildtype 5 פעמים. אנחנו נתייחס לקו המשולב הסופי כpyIs500, ו- 4 EGL מולקולת GFP מתויג כ- GFP :: EGL-4.

2. טיפוח ותחזוקה של בעלי חיים למבחנים טרנסלוקציה גרעיניים

  1. לטפח את pyIs500 החיות ב 25 ° C על 10 צלחות NGM סנטימטר הסטנדרטי (ראה בהמשך למתכון) seeded עם OP50 E. החיידק אשריכיה קולי 13 (איור 1).
  2. ביום 1, לקחת 4-5 L4 pyIs500 חיות מצלחות מעובדות ב 25 ° C על חמישה 10 סנטימטרים נפרדים OP50 E. coli נזרע צלחות ולדגור על 25 מעלות צלזיוס (כלומר, 4-5 L4 חיות לצלחת).
  3. ביום 4, לשטוף מבוגרים עמopulations של pyIs500 חי מהצלחות NGM הגדולות באמצעות חיץ S-Basal (ראה בהמשך למתכון). השתמש pipettes זכוכית חד פעמי להעברת בעלי חיים, כפי שהם יידבקו לצד טיפי פיפטה פלסטיק.

3. מבחני טרנסלוקציה גרעיני ריח לטווח ארוך מושרה

  1. שטוף את pyIs500 החיות 3 פעמים ב- Basal S כדי להסיר חיידקים. אל סרכזת חיות בין כביסות, אלא לאפשר לבעלי החיים להתיישב על ידי הכח הכביד בצינור microcentrifuge נייח 1.5 מ"ל. זה קריטי כדי להבטיח את כל החיידקים הוסרו, וכי פאטה NGM חופשי מזיהום, כשיירי חיידקים ישפיעו לרעה על תוצאותיה של בדיקת טרנסלוקציה. כמו כן, מצאנו כי מעוקר של 1.5 צינורות מיליליטר microcentrifuge מייצר רכוש "דביק" על הקירות הפנימיים של הצינור שגורם לבעלי חיים כדי להיצמד לצדדים, ואז להשתמש בצינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge הלא autoclaved.
  2. בעוד בעלי חיים ליישב בין כביסות, איפור לאהוא התאמת פתרון. הוסף 100 מ"ל של חיץ S-Basal לצילינדר לימודיו 100 מ"ל. הוסף להתאים ריח ל- S אסאל ולאטום את הגליל באמצעות רצועה של Parafilm. אם ביצוע התאמת benzaldehyde להוסיף 7.5 μl של benzaldehyde עד 100 מ"ל של-S אסאל, להסתגלות butanone להוסיף 11 μl של 2-butaone עד 100 מ"ל של-S אסאל. בעדינות להפוך (לא לנער) הגליל סיים המכיל S-בסיס וריח פי 30 כדי ליצור אמולסיה אחידה.
  3. לאחר השטיפה הסופית ב- S אסאל, לאפשר את בעלי החיים כדי להתיישב ולהסיר את כל הנוזלים. צינור תווית 1 "+ יש" או "להתאים" וצינור "יש" או "unadapt" האחר. ואז להוסיף 1 מ"ל של תערובת ההסתגלות לצינור microcentrifuge ההסתגלות (+ יש), ולהוסיף 1 מ"ל של-Basal S לצינור microcentrifuge שליטת unadapted (-VE). נסה לשמור על מספר בעלי החיים בין 100 ל 200 בכל צינור. בעזרת תרגול מסוים, ניתן להעריך את המספר המשוער של בעלי חיים בגלולה על ידי עין.
  4. הנח 1.5 מ"ל microcentrifuge צינור כובע מגןלכל צינור (מונע מעפעפיים פתוחים popping) ולמקם את הצינורות במסובב ל80 דקות. מצאנו כי חשיפת ריח בין 60 דקות ו 80 דקות מניבה תוצאות דומות (שניהם התוצאה בתגובות הסתגלות לטווח ארוך). עם זאת, 80 דקות חשיפה מספקת תוצאות עקביות יותר בידות שלנו. לכן כל מבחני ההסתגלות ארוך הטווח שלנו הם טופלו באמצעות חשיפת ריח דקות 80 (איור 2).
  5. לאחר 80 דקות, לשטוף את החיות 3 פעמים ב- S אסאל. אפשר חיות להתיישב על ידי כוח המשיכה בין כל שטיפה.

4. מבחני טרנסלוקציה גרעיניים קצר טווח ריח מושרה

  1. במקרה של ריח הסתגלות לטווח קצר, השתמש באותו פרוטוקול של מבחנים לטווח ארוך-Induced ריח טרנסלוקציה (צעדים 3.1-3.4), לעומת זאת, במקום דוגר את pyIs500 חיות בהתאמת ריח ל80 דקות, השתמש חשיפת 30 דקות . כימות של מבחני טרנסלוקציה גרעיניים ריח מושרים מפורטים להלן (שלב 5) היא זהה לטווח ארוך וקצר terחשיפות מ.

5. בקיע אירוע טרנסלוקציה הגרעיני ריח המושרה

  1. הפוך רפידות המכילות 2% agarose יזיד הנתרן mM 5 (3 NaN) על ידי המסת ג'ל אלקטרופורזה agarose בDH 2 0. הנח טיפה אחת של agarose המותך המכילה 3 NaN בשקופית מיקרוסקופ זכוכית. מייד למקם את שקופית מיקרוסקופ עוד כוס בשקופית הראשונה לשטח טיפת agarose המותך. השאר למשך 30 שניות, ואז בעדינות להקניט מלבד מיקרוסקופ מחליק עוזב שקופית מיקרוסקופ אחד עם משטח שטוח של agarose ~ 1 מ"מ.
  2. לאחר השטיפה הסופית ב- S אסאל, לאפשר את התולעים להתיישב בצינור microcentrifuge המ"ל 1.5 ולהסיר את כל הנוזלים. ואז להוסיף את החיות החכמות שחרר את הכריות על agarose של כמה שקופיות מיקרוסקופ. זה חשוב כדי לשמור את מספר בעלי חיים לכל שקופית לבין 50 ל 100. בעלי חיים רבים מדי לכל שקופית יסבכו את הניקוד ולעתים קרובות ליצור זוהר פיזור לאחר עירור אור כחול. נוזל עודף רשאילהיות רשע מagarose המשטח באמצעות קטן קים-לנגב. הנח זכוכית 0.5 מ"מ כיסוי החלקה על המשטח ולתת לעמוד ל2 דקות כדי לאפשר ל3 NaN, כדי לשתק את בעלי החיים. שים לב, בעלי חיים יכול להיות התאושש מהשקופיות לאחר ניקוד. בעלי החיים יתאוששו מNaN 3 ההרדמה לאחר שעות ~ 1 אם הועברו לצלחת NGM seeded לירידה של מאגר M9.
  3. בנקודה זו הוא הכרחי כי כל ניסוי להמציא מפתח כדי לעקוב אחר איזו שקופית היא ניסיונית השקופית (+ יש) ואיזו שקופית הוא השליטה (-ve) שקופית, ולהעביר את השקופיות לאדם אחר שיהיה עיוור להבקיע GFP: 4-EGL דפוס לוקליזציה. זה יהיה לשלוט על כל הטיות נסיין.
  4. ציון בין 50 ל 100 חיות לכל שקופית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף עם יעדי גדלה 10x, 40X ו63X ומסנני GFP / RFP. ראשית, אתר חיות בהגדלת 10X באמצעות תאורה בהירה שדה. שנית, אתר נוירון AWC ידי כיבוי brighתאורת t-תחום ובאמצעות RFP המסנן. את (p) ODR-1 :: כונני dsRed ביטוי בשטרי מטען ונוירונים AWC. הנוירונים AWC יש גופי תא ייחודיים סגלגלים בצורה בהשוואה לגופי תא AWB שהם קטנים ומעוגלים (איור 2).
  5. ברגע שגוף התא AWC כבר נמצא, לעבור לGFP המסנן ולהקליט הלוקליזציה של ה-GFP: EGL-4 כגרעיניים או cytoplasmic. שימוש בדלפק מאפשר הנסיינית להמשיך לחפש לעיני בעוד בקיע השקופית. הערה: 5.1-5.5 צעדים הם חוזרים לפחות 3 פעמים בימים נפרדים להפקת נתונים סטטיסטיים משמעותיים (איורים 1-2).

6. ניטור GFP-tagged EGL-4 במהלך השחזור מהסתגלות ריח לטווח הארוך

  1. לאחר השלב 3.5, לחלק את האוכלוסיות של בעלי חיים לpyIs500 aliquots המרובים וציון לGFP הגרעיני לעומת cytoplasmic :: EGL-4 בAWC בנקודת אפס זמן (כלומר, לאחר חשיפה דקה 80) ומטרנקודתי ultiple עוקבות בזמן (איור 3).
  2. להעביר גם את השליטה (-VE) וניסיוניות חיות (+ יש) באמצעות pipettes זכוכית חד פעמי על צלחות NGM.
  3. אפשר חיות להתאושש לאורכים שונים של זמן והלוקליזציה לבחון מחדש של ה-GFP :: EGL-AWC 4in בכל נקודת זמן כמו בשלבים 5.1 עד 5.5.

7. חומרים

צלחות NGM: עבור 1 ליטר להוסיף עד 1 ליטר DDH 2 0: 21 Bacto-אגר גרם, 3 גרם כלוריד הנתרן (NaCl); 2.5 גרם Bacto-Peptone. מדיה חיטוי. לאחר מעוקר, המגניב אגר עד שהטמפרטורה קוראה 54 ° C. הוסף את הפתרונים הבאים: מאגר 25 מ"ל 1M אשלגן פוספט; 1 סולפט מ"ל 1 ז מגנזיום (MgSO 4); 1 כלוריד מ"ל 1 ז סידן (CaCl 2); כולסטרול 1 מ"ל באתנול (5 מניות מ"ג / מ"ל).

1 ז Dibasic K 2 HPO 4 174.2 g / mol: עבור 500 מ"ל: 400 מ"ל בDDH 2 O, להמס 87.1 גרם Dibasiג K 2 HPO 4. התאם נפח 500 ליטר עם DDH 2 O. סנן לעקר באמצעות יחידת סינון סטרילי 500 מ"ל.

1 ז Monobasic KH 2 PO 4 136.1 g / mol: עבור 1 ליטר: 800 מ"ל בDDH 2 O, לפזר 136.1 גרם Monobasic KH 2 PO 4. התאם נפח 1 ליטר עם DDH 2 O. סנן לעקר באמצעות יחידת סינון סטרילי 500 מ"ל.

פוספט אשלגן 1 ז (3 K PO 4) 6.0 pH Buffer: עבור L 1: ביחידת סינון סטרילי 1 ליטר, 868 מ"ל להוסיף M Monobasic KH 1 2 PO 4. אפשר לסנן הדרך יחידה, ואז מוסיף 132 מ"ל של 1 M Dibasic K 2 HPO 4. אפשר יחידה כדי לסנן את כל הנוזלים. הסר יחידת סינון ולהתאים את רמת חומציות עד 6.0. לאחסן בטמפרטורת חדר.

S-Basal: עבור L 1: להוסיף 50 1M 3 4 הצפת מיליליטר K PO, pH ~ 6.0; ו5M המ"ל NaCl aq 20. מלא ל1 ליטר עםDDH 2 O. חיטוי פתרון.

M9: עבור 1 ליטר: 3 גרם KH 2 PO 4, 6 גרם Na 2 4 HPO, 5 גרם NaCl, 1 מ"ל 1 ז 4 MgSO, H 2 O. מלא ל1 ליטר עם DDH 2 0. לעקר ידי מעוקר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

דוגמה לדפוס הלוקליזציה של ה-GFP :: EGL-4in AWC לפני ואחרי חשיפה ממושכת ריח מוצגת באיור 2. לפני החשיפה ממושכת ריח, GFP :: EGL-4 הוא מקומי לcytosol של AWC (איור 2 ב '), ולאחר 80 דקות ריח החשיפה GFP :: EGL-4 הם מקומי לגרעין של AWC (האיור 2D). ברמת ההתנהגותית, חיות עם cytosolic GFP :: EGL-4 בAWC נמשכות לנקודת מקור של ריח (האיור 2C גרפי נציג תוצאות ממבחני Chemotaxis של חי unadapted - לב מדד chemotaxis 3 הוא קרוב ל1). בעלי החיים מציגים GFP הגרעיני :: EGL-4 בAWC לא נמשכים לנקודת מקור של ריח ההסתגלות (גרפי 2E איור נציג תוצאות ממבחני Chemotaxis של בעלי חיים המותאמים באור - מדד chemotaxis הוא קרוב לאפס). כדי להפיק נתונים סטטיסטיים משמעותיים ממבחני טרנסלוקציה גרעיניים ריח מושרים,הניסויים צריכים לרוץ לפחות 3 פעמים ובימים נפרדים. לתיאור מפורט של assay chemotaxis זה עשוי להיות שימושי כדי להתייחס ליופיטר מאמר 2490 14.

ברגע EGL-4 נכנס לגרעין של הנוירונים AWC זה גורם לשינויים יציבים וארוך טווח בפיזיולוגית AWC כי נמשכים גם כאשר EGL-4 הם כבר לא בגרעין (איור 3). לאחר 80 דקות ריח חי חשיפה יתעלם מנקודת מקור של ריח ההסתגלות (איור 3 פנל העליון, בר אור משמאל), והתאמה זו תימשך גם לאחר 120 דקות של התאוששות (איור 3 פנל העליון, בר אור מימין). לאחר 80 דקות של חשיפת הריח GFP: EGL-4 נצפו בגרעין AWC (פנל תחתון, בר אור על שמאל איור 3). כניסה גרעינית זה גם הכרחית ומספיק כדי לגרום להסתגלות לטווח ארוך ב5 AWC. לאחר התאוששות של דקות 120, את החיות האלה כבר לא מפגינות GFP הגרעיני :: EGL-4 (איור 3 פנל תחתון, בר אור מימין) אך עדיין מתעלם מנקודת מקור של benzaldehyde ריח ההתאמה ברמה התנהגותית.

איור 1
איור 1. סקירה כללית של פרוטוקול למבחני טרנסלוקציה ריח מושרה גרעיניים לטווח ארוך. ראשית, בעלי חיים המבטאים GFP :: EGL-4 (pyIs500 חיות) מעובדות ב 25 ° C על צלחות NGM seeded עם OP50 E. coli. שנית, בעלי חיים נחשפים לתמהיל ריח הסתגלות (קבוצת ניסוי) או בולם ה-S-Basal (קבוצת ביקורת). שלישית, בעלי חי בקיע בעיוורון על ידי ספירת מספר בעלי החיים המציגים בתערוכת GFP הגרעיני :: EGL-4 בAWC ומספר בעלי החיים המציגים בתערוכת GFP cytoplasmic :: EGL-4 בAWC.

איור 2
איור 2. et al. 2B איור 6. לפני החשיפה ממושכת ריח, GFP :: EGL-4 הם מקומי לcytosol של AWC. האיור 2C. ברמה התנהגותית, חיות עם GFP cytosolic :: EGL-4 בAWC נמשכים לנקודה חמוצהספירה של ריח. הגרף הזה נוצר מתוצאות מייצגות מן מבחני Chemotaxis של חי unadapted. שים לב מדד chemotaxis קרוב ל1. האיור 2D. לאחר 80 דקות ריח החשיפה GFP :: EGL-4 הם מקומי לגרעין של AWC. 2E איור. בעלי החיים מציגים GFP הגרעיני :: EGL-4 בAWC לא נמשכים לנקודת מקור של ריח ההתאמה. הגרף הזה נוצר מתוצאות מייצגות מן מבחני Chemotaxis של בעלי חיים המותאמים. שים לב מדד chemotaxis הוא קרוב לאפס.

איור 3
איור 3. רגע EGL-4 נכנס לגרעין של הנוירונים AWC זה גורם לשינויים יציבים וארוך טווח בפיזיולוגית AWC כי נמשכים גם כאשר EGL-4 הם כבר לא בגרעין. בעלי חיים שנחשפו לריח (80 דקות) מותר להתאושש מחשיפת הריח לטווח הארוך וקלעו לcytoplasmic לעומת גרעינילוקליזציה של ה-GFP :: EGL-4. (פנל עליון) לאחר התאוששות של דקות 120 בעלי החיים שנחשפו לריח ל80 דקות עדיין מותאמים ברמה התנהגותית. (פנל תחתון) אחרי 120 דקות התאוששות חיות שנחשפו לריח ל80 דקות כבר לא מפגין GFP הגרעיני :: EGL-4. לפיכך, גרעיניים EGL-4 מעורר שינויים ארוכי טווח יציבים בפיזיולוגיה של AWC כי נמשכים לאחר EGL-4 היא כבר לא בגרעין. איור הוא שונה באישור Lee et al. 5. איור 3 פנל העליון. לאחר 80 דקות ריח חי חשיפה יתעלם מנקודת מקור של ריח ההתאמה והסתגלות זה תימשך גם לאחר 120 דקות של התאוששות. איור 3 פנל תחתון. לאחר 80 דקות של ה-GFP חשיפת הריח :: EGL-4 נצפו בגרעין AWC. כניסה גרעינית זה גם הכרחית ומספיק כדי לגרום להסתגלות לטווח ארוך בAWC. לאחר התאוששות של דקות 120, את החיות האלה כבר לא מפגינות GFP הגרעיני :: EGL-4 עדיין ימשיכו להתעלם מנקודת souRCE של benzaldehyde ריח ההתאמה ברמה התנהגותית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הכניסה הגרעינית ריח המושרית של EGL-4 מולקולת ה-GFP-tagged המתואר כאן מספק readout מולקולרי חזק של הסתגלות חוש ריח בג elegans. מבחני טרנסלוקציה הגרעיניים ריח המושרים הם פשוטים ודורשים רק כמה ימים ארוכים של הכנה. PyIs500 החיה שבנינו עבור מבחנים אלה, מבטאת את סמן שמאיר את הנוירון AWC כמו גם מבטא את חלבון ה-GFP מתויג-EGL-4. לפיכך, אנו סבורים כי ניסוי עם מעט ניסיון בעבודה עם המעמד הזה של נוירון יכול מהר מאוד (אולי לאחר שבחן כמה עשרות בעלי חיים) מתחיל להרגיש בנוח זיהוי התא והניקוד הנכון עבור גרעיניים לעומת cytoplasmic EGL-4. זה עשוי להיות שימושי לקורא להתייחס ליופיטר מאמר 835 שמתאר ניתוח GFP ב C. elegans 15.

כדי להבטיח שנתונים שנוצרו הוא באיכות הגבוהה ביותר שמציעים את ההנחיות הבאות:1) יש לעשות כל ניקוד עיוורון: 2) צלחות טיפוח המכילות כל עקבות של זיהום (פטרייתי או חיידקים) לא ניתן להשתמש ב; 3) תולעים שרעב מנוסה במהלך טיפוח לא צריך להיות בשימוש; ו 4) תערובות הסתגלות חייבות להתבצע טרי היום של ניסוי וטעייה.

כל המערכות החושיות תערוכת דוגמאות של פלסטיות עצבית. העברת אותות לגרעין היא תכונה שמורה ביותר של צורות יציבות של פלסטיות עצבית 16. על ידי פיתוח readout מולקולרי של פלסטיות הרחה שמייצגת טרנסלוקציה גרעינית של pkg בתאי עצב מגורה, אנו מספקים פלטפורמה לנתיחה מהירה ומפורטת של פלסטיות עצבית בתוך במודל vivo. שימוש readout המולקולרי של הסתגלות שלנו חוש ריח שהתחלנו לתאר כמה מהאירועים שמעצבים את חוש ריח בעיבוד ג elegans 5,6,7. עם זאת, זה רק התחלה, ועל ידי לימוד תהליך זה כפונקציה שלGE, סקס, דלקת, או דיאטה אנו עשויים לחשוף נושאים חשובים של פלסטיות עצבית במעגל ורמת מערכות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לסקוט המילטון, וחברי המעבדה 'האלורן לקריאה מדוקדקת של כתב היד הזה. אנו מודים גם למבקר האנונימי שלנו לקבלת הצעות מצוינות והערות תובנה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Agar Difco DF0140-07-4 NGM plates
Sodium Chloride Fisher Chemical S671-10 NGM plates
Bacto Peptone Difco DF0118-07-2 NGM plates
Potassium Phosphate Dibasic Fisher Chemical S375-500 S-Basal buffer and NGM plates
Potassium Phosphate Monobasic Fisher Chemical P285-500 S-Basal buffer and NGM plates
Kimwipes - Small Kimberly-Clark LS2770
Ethanol 100% Gold Shield Chemical Co. 43196-115 diluting odors for chemotaxis assays
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C8106-500G NGM plates
Magnesium Sulphate MP Biomedicals 150136-500G NGM plates
Sodium Azide 99% Fisher Scientific ICN10289180 Anesthetic
Agarose - UltraPure Invitrogen 16500-500 Agarose pads
Benzaldehyde Sigma-Aldrich B1334-100G AWC odor
Butanone, ACS Grade Sigma-Aldrich 360473-500ML AWC odor
Microcentrifuge Tubes - 1.5 ml Colored Denville LS8147
Pasteur Pipet Disposable Glass 5-3/4" Fisher Scientific 13-678-20B
Stratalinker Stratagene Stratalinker 2400 UV integration
Filter Vacuum Bottle - 500 ml Nalgene 09-740-25B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans. Neuron. 14, (4), 803 (1995).
  2. Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans. Learning and Memory. 4, (2), 179 (1997).
  3. Bargmann, C. I., et al. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Neuron. 74, (3), 515 (1993).
  4. L'Etoile, N. D., et al. The cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 regulates olfactory adaptation in C. elegans. Neuron. 36, 1079-10 (2002).
  5. Lee, J. I., et al. Nuclear entry of a cGMP-dependent kinase converts transient into long-lasting olfactory adaptation. PNAS. 107, (13), 6016 (2010).
  6. O'Halloran, D. M., et al. Regulators of AWC-mediated olfactory plasticity in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5, (12), e1000761 (2009).
  7. O'Halloran, D. M., et al. Changes in cGMP levels affect the localization of EGL-4 in AWC in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7, (2), e31614 (2012).
  8. Mello, C. C., et al. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO Journal. 10, 3959-39 (1991).
  9. Miyabayashi, T., et al. Expression and function of members of a divergent nuclear receptor family in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 215, 314 (1999).
  10. L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Olfaction and odor discrimination are mediated by the C. elegans guanylyl cyclase ODR-1. Neuron. 25, (3), 575 (2000).
  11. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451 (1995).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. Wormbook. (2006).
  13. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, (1), 71 (1974).
  14. Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays. J. Vis. Exp. (49), e2490 (2011).
  15. Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes. J. Vis. Exp. (17), e835 (2008).
  16. Pittenger, C., Kandel, E. R. In search of general mechanisms for long-lasting plasticity: Aplysia and the hippocampus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, (1432), 757 (2003).
Readout מולקולרי של הסתגלות חוש ריח לטווח הארוך ב<em&gt; ג elegans</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

He, C., Lee, J. I., L'Etoile, N., O'Halloran, D. A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans. J. Vis. Exp. (70), e4443, doi:10.3791/4443 (2012).More

He, C., Lee, J. I., L'Etoile, N., O'Halloran, D. A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans. J. Vis. Exp. (70), e4443, doi:10.3791/4443 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter