Análise de imagens de Neuron Glia para Interação em Plataforma Cultura microfluídicos (MCP) baseado Axon Neuronal e Sistema Glia co-cultura

Summary

Este estudo descreve os procedimentos de criação de um axônio neuronal e romance (astro) glia plataforma de co-cultura. Neste sistema de co-cultura, a manipulação da interacção directa entre um único axónio (e única célula glial) torna-se possível, permitindo a análise mecanicista do neurónio mútuo de sinalização gliais.

Abstract

Neurónio adequado para interacção glia é crítica para a função fisiológica do sistema nervoso central (SNC). Esta comunicação bidirecional é sofisticada específicas mediadas por vias de sinalização entre neurônios e células gliais ^1,2. Identificação e caracterização de tais vias de sinalização é essencial para a compreensão de como a fisiologia neurônio glia interacção CNS formas. Anteriormente, neurônios e células gliais culturas mistas têm sido amplamente utilizados para testes e caracterização de vias de sinalização entre neurônios e células gliais. O que aprendemos com essas preparações e outras ferramentas in vivo, no entanto, sugeriu que a sinalização mútuas entre neurônio e glia que ocorreram geralmente em compartimentos específicos dentro dos neurônios (axônio, dendrito, ou soma) ^3. Isto torna importante o desenvolvimento de um sistema de cultura novo, que permite a separação dos compartimentos neuronais e, especificamente, examina a interacção entre as células gliais e neuroaxônios NAL / dendritos. Além disso, o sistema de cultura convencional mista não é capaz de diferenciar os factores solúveis e os sinais de membrana por contacto directo entre neurónios e células gliais. Além disso, a grande quantidade de neurónios e células gliais no sistema de co-cultura convencional não tem a resolução necessária para observar a interacção entre um único axónio e uma célula glial.

Neste estudo, descrevemos uma nova axónio e glia do sistema de co-cultura com a utilização de uma plataforma de cultura de microfluidos (MCP). Neste sistema de co-cultura, os neurónios e células gliais são cultivadas em duas câmaras separadas, que estão ligados através de múltiplos canais centrais. Nesta plataforma de cultura de microfluidos, apenas processos neuronais (especialmente axónios) pode entrar no lado glial através dos canais centrais. Em combinação com a marcação de proteínas poderoso fluorescente, este sistema permite a análise directa das vias de sinalização entre as interações axonais / dendrítica e glial, tals regulação axônio mediada transcrição em glia tráfico receptor, mediada por células gliais em terminais neuronais, e glia mediada crescimento do axônio. O diâmetro estreito da câmara também significativamente proíbe o fluxo do meio para neurónios enriquecidos para a câmara de glial, facilitando sondagem da interacção proteína-membrana directa entre axónios / dendritos e superfícies gliais.

Protocol

1. Assembleia da Câmara Cultura microfluídicos (MCP)

1. MCP (Figura 1) são concebidos para câmaras abertas compartimentados culturas de diferentes tipos de células ^4. Geralmente, ela tem dois compartimentos, que são ligados por meio dos canais centrais (3 mm de diâmetro). Assembleia de MCP com vidro de fundo pratos é necessário para preparação de culturas e análise de imagem posterior.
2. Em primeiro lugar, revestimento estéreis de vidro com fundo de pratos com poliornitina (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) dissolvido em tetraborato de sódio (Sigma-Aldrich, 10 mM pH 8,5) e foram incubadas durante a noite a 37 ° C.
3. No dia seguinte, as revestidas de vidro com fundo de placas foram lavadas três vezes com DDQ ₂ O e secou-se sob o capô estéril fumos. Os pratos de vidro com fundo foram então adicionalmente revestidas com laminina (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) e secou-se sob luz UV, durante 1 hora. Pratos revestidos estão prontas para utilização ou podem ser armazenadas à temperatura de -20 ° C até à sua utilização. Estas revestimento de umre necessário para chapeamento neurônios e astrócitos na co-cultura.
4. Para a montagem da plataforma de cultura, as plataformas de cultura microfluídicos foram colocados no topo dos com revestimento de vidro com fundo de pratos com canais de ligação centrais no seu lado inferior para formar uma vedação estanque. Neurónio regular ou meios de cultura de astrócitos foram adicionados (a partir das áreas de células de revestimento), em ambos os lados (fig. 1) para a MCP montado e incubadas durante 2-4 horas a 37 ° C, para assegurar que não haja fugas entre a MCP e-glass prato fundo. Nós testamos com o meio antes de as células de revestimento para garantir que não haja vazamento. A montagem de MCP sobre o prato de vidro de fundo deve ser preparado imediatamente antes da utilização.

2. Preparação da cultura neuronal e Indução de axónios neuronais em MCP montado

1. Culturas de células neuronais corticais foram recém-preparado a partir de cérebros embrionários 14-16 dias de idade, de ratinho. O meio de cultura é composto por neurónios meio neurobasal, 2% B27 neurobasal suplemento, glutamina 2 mM pela adição de 1% de 100x GlutaMAX, e 1% de penicilina-streptomysin. Seguindo a dissecção do cérebro do rato, as meninges foram removidas a partir do córtex sob o microscópio de dissecação. O tecido foi então triturado com uma lâmina de barbear para fazer pequenos blocos de tecido de modo a aumentar a área de superfície exposta à tripsina. Os blocos de tecido foram tratadas com tripsina (Sigma-Aldrich, de Tripsina a 0,05%) durante 10 minutos num banho de água a 37 ° C, e depois dissociado por trituração suave com um fogo polida pipeta de Pasteur. As células dissociadas foram filtradas através de um filtro de 70 | iM para recolher a suspensão de células claras neuronal.
2. Neurónios (2-3 x 10 ⁶ / ml, 150 ul) foram colocadas em placas sobre as áreas de células de revestimento do lado direito (Figura 1) da MCP montado de modo que os neurónios pode anexar na área de retenção de células (Figura 1). Neurónios recentemente preparadas foram colocadas em placas com meio de plaqueamento neuronal que é suplementado com 5% de soro fetal bovino (Hyclone) para a regulaçãor meio de cultura neuronal. Porque apenas os neurónios que se ligam na área de retenção de células são capazes de crescer em axónios do outro lado da MCP montado por meio de canais centrais, é importante que a densidade da placa elevada de neurónios na área de revestimento de células suficientes para assegurar neurónios estão ligados ao área de retenção de células. Uma imagem representativa de alta densidade de axónios neuronais é mostrado na Figura 2A.
3. No dia seguinte, o meio de plaqueamento neuronal foi substituído por meio normal de cultura neuronal. Alterando médio foi realizado por meio de aspiração cuidadosamente a partir da área de revestimento da câmara de célula, mas não a partir da área de retenção de células da MCP montado, de modo a evitar bolhas de ar na área de retenção de células e os canais de ligação centrais. As bolhas de ar vai inibir seriamente o crescimento axonal ea subsequente entrada nos canais centrais no MCP. Glial-cell factor neurotrófico derivado (GDNF, 10-20 ng / ml) foi também adicionado no lado (esquerdo) outrosda câmara no mesmo dia, para facilitar a indução de crescimento axonal ⁵ a partir do lado neuronal e transversal através de canais centrais da MCP montada (Figura 2A). Quantidade de crescimento de neurites espontânea sem GDNF é também observada a partir do lado neuronal e transversal através de canais centrais da MCP montado. Axónios que entram no canal central são frequentemente observadas 2-3 dias após o plaqueamento. Uma vez que os axónios entrar no canal central, que normalmente entrar no outro lado no prazo de um dia. Axônios são normalmente intacto durante pelo menos uma semana após a entrada no outro lado.

3. Além de astrócitos cultivados para MCP estabelecer um sistema de co-cultura Compartimentada

Culturas primárias de astrócitos foram preparadas a partir do cérebro P1-3 do rato filhote. O procedimento de dissociação cérebro é semelhante ao processo neuronal de células de isolamento descritas acima. Os astrócitos foram inicialmente semeadas em placa de 10 cm, que foram pré-Revestidas com poliornitina (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml). O meio de cultura de astrócitos (DMEM, 10% de soro fetal bovino, 1% de penicilina-streptomysin) foi mudado todos os dias durante os dois dias seguintes para remover os detritos. Depois disso, o meio foi trocado a cada três dias.

1. Astrócitos tornam-se confluentes 90% e formam uma monocamada após 7 dias. Astrócitos confluentes foram tripsinizadas e 150 ul de re-suspensas astrócitos (1x10 ⁶ / ml) foram re-plaqueadas em placas de revestimento da área da célula do lado esquerdo do MCP montado quando axónios estão prestes a entrar ou ter acabado de entrar na parte lateral esquerda do o montado MCP. Os astrócitos foram plaqueadas normalmente 4-5 dias depois dos neurónios foram plaqueados. O GDNF foi primeiro removido antes da re-chapeamento dos astrócitos para o lado esquerdo da MCP. Re-plated astrócitos foram fixados na área de retenção de células, como mostrado pela imunocoloração GFAP (Figura 1). Apenas o fluxo mínimo de meio entre os dois lados das câmaras (determinado por fluorescência dsim) foi encontrada na MCP, tal como anteriormente demonstrado ^4,6.
2. Astrócitos tornam-se confluentes 90% e formam uma monocamada após 7 dias. Astrócitos confluentes foram tripsinizadas e 150 ul de re-suspensas astrócitos (1 x 10 ⁶ / ml) foram re-plaqueadas em placas de revestimento da área da célula do lado esquerdo do MCP montado quando axónios estão prestes a entrar ou ter acabado de entrar na esquerda lado da MCP montado. Os astrócitos foram plaqueadas normalmente 4-5 dias depois dos neurónios foram plaqueados. O GDNF foi primeiro removido antes da re-chapeamento dos astrócitos para o lado esquerdo da MCP. Re-plated astrócitos foram fixados na área de retenção de células, como mostrado pela imunocoloração GFAP (Figura 1). Apenas o fluxo mínimo de meio entre os dois lados das câmaras (determinado por fluorescência de corantes) foi encontrada na MCP, tal como anteriormente demonstrado ^4,6.
3. Após a re-chapeamento dos astrócitos, axónios que entraram no lado esquerdo da MCP montado interagir directamente com o Astrocytes por contato direto axonal ou liberação de fatores solúveis. A imunocoloração de astroglial GLT1 transportador de membrana plasmática de glutamato e neuronal βIII-tubulina foi utilizada para visualizar a interacção entre os axónios e os astrócitos, conforme mostrado na Figura 2D-F.

Representative Results

Lapso de tempo de análise de imagem de axônio induzida por ativação do promotor GLT1 em astrócitos

O neurónio compartimentado e sistema de co-cultura de astrócitos permite que apenas os processos neuronais, particularmente axónios, os seletivamente interagir com os astrócitos. Após o estabelecimento com sucesso de axónio e astrócito (ou outras células da glia) co-cultura na MCP montados, diferentes tipos de interacções axónio-glia pode ser estudado, tais como; axonal induzida por activação de activação astroglial gene promotor, astrócitos induzida orientação axon , axon induzida por Ca ^{2 +} astroglial resposta e axonal induzida a síntese de mielina em oligodendrócitos. Todas estas aplicações tirar partido da disponibilidade de poderosas repórteres fluorescentes disponíveis para células da glia ou corantes carregados para estas células.

Aqui descrevemos axônio induzida por ativação da transcrição do promotor astroglial transportador 1 (GLT1) glutamato usando bacteriana cromo artificialalguns (BAC) GLT1 EGFP camundongos transgênicos e este sistema de co-cultura compartimentada. Nos GLT1 BAC ratos transgénicos EGFP, um repórter fluorescente eGFP foi superexpresso, sob o controlo do promotor genómico GLT1 ^7. A expressão do repórter eGFP se correlaciona com a expressão de proteína endógena GLT1 promotor de activação e actividade funcional ⁷ permitindo assim uma avaliação da actividade do promotor em astrócitos GLT1 simples in situ. Expressão GLT1 astroglial é altamente dependente da estimulação neuronal ^6,8. Astrócitos primários expressam níveis mínimos de GLT1, no entanto, os níveis de expressão GLT1 (tanto de mRNA e proteína) são fortemente induzidos em astrócitos, que são co-cultivadas com os neurónios ^9. A evidência é mostrado aqui pela imunorreactividade significativamente aumentada GLT1 no sistema de co-cultura compartimentada (Figura 3). Em neurónio convencional e co-culturas de astrócitos, a alta densidade de neurónios torná-lo menos ideal para observar aefeito de axónios neuronais na activação da transcrição do promotor GLT1.

Para monitorizar o axónio dependente de activação do promotor GLT1, os neurónios do tipo selvagem foram cultivadas no lado direito da MCP montado e os axónios foram induzidas no seguimento da aplicação do GDNF sobre o lado esquerdo da MCP montado. Os astrócitos derivados dos ratinhos BAC GLT1 EGFP foram cultivadas no lado esquerdo da MCP montada depois os axónios foram induzidas e acabou de entrar para o lado esquerdo da MCP montado. Um total de 6 dias (24 horas a 140 horas) de lapso de tempo foram recolhidas imagens de controlar a variação da intensidade de fluorescência eGFP em tempo real e o crescimento axonal no MCP. Como mostrado na Figura 4A, a expressão de fluorescência muito mínima eGFP em astrócitos foi observado 24 horas após o plaqueamento dos astrócitos. Aumento significativo da intensidade de eGFP foi observado 48 horas após a co-cultura (de 24 a 68 hr hr) quando os axônios são bem dentro do lado do astrócito e interacçãot contactar directamente com astrócitos (Figura 4 aC). Por outro lado, a intensidade de fluorescência eGFP foi gradualmente diminuída uma vez axónios foram retraídos e degenerados por cainite (200 uM) de morte celular neuronal induzida no lado (direito) neuronal da MCP montada (Figura 4D-F). A mudança dinâmica de eGFP intensidade de fluorescência em resposta aos axónios claramente demonstrado que a actividade do promotor astroglial GLT1 é modulada pela interação axónio.

Figura 1. Diagrama esquemático do neurônio microfluídicos e plataforma de co-cultura de astrócitos. Plataforma microfluídica cultura (MCP) tem dois compartimentos que são conectados através dos canais centrais. As células podem ser plaqueadas a partir da área de plaqueamento das células em cada lado e axónios neuronais são induzidas a partir da área de retenção de células e passe através dos canais centrais para enter o outro lado (inserir barra de escala 50 mm).

Figura 2. Indução de axônios neuronais e interação de axônios com astrócitos no MCP MCP. (A) de alta densidade de neurônios na área de retenção celular do MCP montado, revelado pelo βIII-tubulina imunocoloração. Barra de escala: 50 ^ m (B) vista ampliada de axónios que cruzam os canais centrais e entram no outro lado da MCP. Barra de escala: 100 mm (C) do cone de crescimento Axon revelado pela coloração BIII-tubulina, quando entra em axónios do outro lado da MCP. Barra de escala: 100 ^ m (D) Axon feixes que crescem através do canal central e entrar no outro lado da MCP. (E) Os astrócitos revelado pela imunocoloração GLT1 no lado glial da MCP. (F) exibe imagem mesclada contato entre axônios e GLT1 astrócitos positivos. Barra de escala: 50 ^ m.

Figura 3. Neuron-dependente indução da expressão GLT1 em astrócitos primários GLT1 imunorreactividade em (A) culturas primárias de astrócitos, barra de escala:. 50 um (B) culturas primárias de neurónios, e (C) de neurónios primários e co-culturas de astrócitos. Barra de escala: Neurônios são mostrados por imunomarcação de βIII-tubulina. Aumento significativo de GLT1 imunorreatividade foi observada em neurônios e astrócitos co-culturas.

Figura 4. Lapso de tempo imagens do axônio induzida por ativação do promotor GLT1 em MCP com BAC GLT1 astrócitos e neurônios EGFP tipo selvagem. Mudanças dinâmicas de intensidade eGFP e do crescimento de axônios foram coletados através de uma gravação com lapso de tempo 6d seguindo chapeamento astrócitos. (A) 24h (B) (C 48h) 68h (D) 92H (E) 112H (F) 140h. Entrada de umXONs (realçado pelas setas amarelas) para o lado do astrócito foi observada a partir de 48h para 92h que se correlacionam com o aumento da intensidade de fluorescência eGFP. Diminuir a intensidade de fluorescência de EGFP ocorreu de 112H a 140h após cainite (200 ^ M) foi aplicada no lado neuronal em 92h para induzir a morte de células neuronais e degeneração axonal. Barra de escala: 50 ^ m.

Discussion

O neurônio MCP baseado e astrócitos sistema de co-cultura de neurônio permite dissecção detalhada para as vias de sinalização astroglia permitindo que somente os axônios passam os canais centrais e interagindo com as células gliais. Este sistema de co-cultura pode ser convenientemente configurado com o neurônio convencional e procedimentos de cultura de astrócitos. Nós também descrita uma aplicação prática deste sistema de co-cultura utilizando um repórter baseado eGFP para demonstrar a activação dependente do axónio promotor GLT1 em astrócitos.

Este MCP baseado neurônio e astroglia sistema de co-cultura oferece várias vantagens em relação ao convencional de co-cultura métodos: 1) a capacidade de visualizar e identificar a interação explícita morfológica entre axônios individuais e astrócitos em tempo real sob microscopia de alta resolução 2) um poço controlado microambiente independente para aplicar manipulação farmacológica para células específicas efeito 3) análise de activação do promotore a expressão da proteína induzida exclusivamente / sobre-regulada em astrócitos, que são moduladas por contacto axónios. Dado que os procedimentos para a cultura primária microglia e oligodendrócitos ^{10 11} foram bem estabelecidos, isto MCP sistema de co-cultura pode ser também aplicada ao neurónio a microglia e oligodendrócitos neurónio de co-culturas. Enquanto isso, nós também reconhecer que este sistema de co-cultura é destinado para a análise de imagem sensível ao nível da célula individual, que é complementar às abordagens convencionais de análise de grande quantidade de células, tais como RNA ou análise de proteínas. Além disso, o nosso sistema simplifica a interação enorme entre neurônios e células gliais in vivo por interação entre exemplificando única célula e axônio. Todos estes devem ser considerados na interpretação dos resultados deste sistema de co-cultura. No SNC, as interacções entre diferentes axónios e células gliais são amplamente distribuídas e são de importância crítica para o neurónio efunções gliais ^12,13. O desenvolvimento deste sistema de co-cultura irá permitir imagens baseada dissecação destas interacções.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30070.03	for plating neuron for neuron cutlure medium
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F4135	for astrocyte culture medium
Glial derived nerve factor	R&D Systems	212-GD	Apply 10-20 ng/ml to neuron side of chamber
Dulbecco modified eagle medium high glucose	Sigma-Aldrich	11995
70 mm cell strainer	BD Falcon	352350
Sterile glass bottom dish	MatTek Corporation
Microfluidic culture platforms	Xona Microfluidics LLC	SND150
6 wells of the culture plate	Cellstar	657 160
Neuron culture medium Neurobasal medium 2% B27 Neurobasal supplement 2 mM glutamate by adding 1% 100x GlutaMAX 1% Penicillin-streptomysin
Neuron culture medium for plating cell Neurobasal medium 2% B27 Neurobasal supplement 2 mM glutamate by adding 1% 100x GlutaMAX 1% Penicillin-streptomysin 5% Fetal bovine serum SH30070.03
Astrocyte culture medium Dulbecco modified eagle medium high glucose 10% Fetal bovine serum F4135 1% Penicillin-streptomysin
Table 1. Materials used in the microfluidic culture platform-based neuronal axon and glia co-culture system.