Summary
Diese Studie beschreibt die Verfahren für die Einrichtung einer neuartigen neuronalen Axon und (astro) Glia Co-Kultur-Plattform. Auf diese Co-Kultur-System wird Manipulation direkte Wechselwirkung zwischen einem einzelnen Axon (und einzigen Gliazelle) durchführbar ist, so dass mechanistischen Analyse des gegenseitigen Neuron zu glialen Signalisierung.
Abstract
Ordnungsgemäße Neuron zu Glia-Wechselwirkung ist entscheidend für physiologische Funktion des zentralen Nervensystems (ZNS). Diese bidirektionale Kommunikation wird raffiniert durch spezifische Signalwege zwischen Neuron und Glia 1,2 vermittelt. Identifizierung und Charakterisierung dieser Signalwege ist wesentlich für das Verständnis, wie Neuron zu Glia-Wechselwirkung Formen CNS Physiologie. Zuvor haben Neuron und Glia Mischkulturen weithin zum Testen und Charakterisieren Signalwege zwischen Neuronen und Glia ausgenutzt. Was wir von diesen Präparaten und anderen Werkzeugen in vivo gelernt hat jedoch vorgeschlagen, dass die gegenseitige Signalisierung zwischen Neuronen und Glia häufig in speziellen Kompartimenten innerhalb von Neuronen (dh Axon, Dendrit oder Soma) 3 aufgetreten ist. Daher ist es wichtig, eine neue Kultur System, Trennung der Fächer ermöglicht neuronalen Entwicklung und speziell untersucht die Wechselwirkung zwischen Glia und neuronal Axone / Dendriten. Darüber hinaus ist das herkömmliche System Mischkultur nicht fähig Differenzieren der löslichen Faktoren und direkte Membrankontakt Signalen zwischen Neuronen und Gliazellen. Außerdem fehlt die große Menge von Neuronen und Gliazellen im herkömmlichen Co-Kultursystem die Auflösung notwendig, die Wechselwirkung zwischen einem einzelnen Axon und einer Gliazelle beobachten.
In dieser Studie beschreiben wir eine neue Axone und Glia Kokultur System mit der Verwendung eines mikrofluidischen Kulturplattform (MCP). Auf diese Co-Kultur-System sind Neuronen und Gliazellen in zwei getrennte Kammern, die durch mehrere zentrale Kanäle angeschlossen sind, kultiviert. In diesem mikrofluidischen Kultur-Plattform, kann nur neuronale Prozesse (insbesondere Axone) die Gliazellen Seite durch den zentralen Kanälen geben. In Kombination mit leistungsfähigen fluoreszierendes Protein Etikettierung, ermöglicht dieses System eine direkte Untersuchung von Signalwegen zwischen axonalen / dendritischen und Glia Interaktionen, eine solches Axon-vermittelten Transkriptionsregulation in Glia, Glia-vermittelte Rezeptor-in neuronalen Terminals und Glia-vermittelten Axon Wachstum. Die schmalen Durchmesser der Kammer ebenfalls signifikant verbietet die Strömung des Neurons angereicherten Mediums in die Kammer gliale, Erleichterung Sondieren des direkten Membran-Protein-Wechselwirkung zwischen Axone / Dendriten und glialen Oberflächen.
Protocol
Ein. Versammlung der Mikrofluidik Kultur Kammer (MCP)
- MCP (Abbildung 1) offenen Kammern für kompartimentierten Kulturen verschiedener Zelltypen 4 ausgebildet ist. Es hat typischerweise zwei Abteile, die durch die mittleren Kanäle (3 um im Durchmesser) verbunden sind. Versammlung des MCP mit Glasboden-Gerichte ist zur Vorbereitung Kulturen und anschließende Bildanalyse.
- Erstens Mantel sterilen Glasbodengondel Gerichte mit Polyornithin (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) in Natriumtetraborat (Sigma-Aldrich, 10 mM pH 8,5) gelöst und über Nacht bei 37 ° C inkubiert
- Am folgenden Tag wurden die beschichteten Glasboden Gerichte dreimal mit ddH 2 O gewaschen und getrocknet unter der sterilen Abzug. Die Glasbodengondel Schalen wurden dann weiter mit Laminin (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) gewaschen und unter UV-Licht 1 Stunde. Beschichtete Platten sind gebrauchsfertig oder können bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. Diese Beschichtung eineswieder notwendig, für die Beschichtung Neuronen und Astrozyten in der Co-Kultur.
- Die Kultur Plattform zusammenzubauen, wurden mikrofluidischen Kultur Plattformen auf der beschichteten Glasbodengondel Gerichte mit zentralen Verbindungskanäle an seiner Unterseite angeordnet, um eine Abdichtung zu bilden. Regelmäßige Neuron oder Astrozyten Nährböden wurden zugesetzt (von den Zell Plattierungsflächen) auf beiden Seiten (Fig. 1) in der zusammengebauten MCP und inkubiert für 2-4 Stunden bei 37 ° C, um sicherzustellen, dass keine Undichtigkeit zwischen MCP und dem Glas- Boden Gericht. Wir haben mit Medium vor dem Plattieren Zellen getestet, um sicherzustellen, dass kein Leck. Die Montage der MCP auf dem Glasboden-Gericht sollte vor Gebrauch frisch hergestellt werden.
2. Vorbereitung neuronaler Kultur und Induktion der neuronalen Axonen in Assembled MCP
- Kortikalen neuronalen Zellkulturen wurden frisch aus embryonalen 14-16 Tage alten Maus Gehirn vorbereitet. Das Neuron Kulturmedium Neurobasalmedium, 2% B27 neurobasa zusammenl Ergänzung, 2 mM Glutamin durch Zugabe von 1% der 100x GlutaMAX und 1% Penicillin-streptomysin. Nach Dissektion der Maus Gehirn, wurde die Meningen aus der Rinde unter dem Binokular entfernt. Das Gewebe wurde dann mit einer Rasierklinge zu kleinen Blöcken Gewebe zu machen, um den Oberflächenbereich zu erhöhen ausgesetzt Trypsin zerkleinert. Tissue Blöcke wurden trypsiniert (Sigma-Aldrich, 0,05% Trypsin) für 10 min in einem 37 ° C Wasserbad und anschließend dissoziiert leicht durch Verreiben mit einem feuerpolierte Pasteur Pipette. Dissoziierten Zellen wurden durch eine 70 um Sieb gefiltert, um klare neuronalen Zellsuspension zu sammeln.
- Neuronen (2-3 x 10 6 / ml, 150 ul) wurden auf die Plattierungsflächen Zelle auf der rechten Seite (Figur 1) des zusammengebauten MCP ausplattiert so daß Neuronen in der Zelle Retentionsbereich (Abbildung 1) befestigen kann. Frisch hergestellten Neuronen wurden mit Neuron Plattierungsmedium, welches mit 5% fötalem Rinderserum (Hyclone) in die Regulierung wird ausplattiertr Neuron Kulturmedium. Da nur die Neuronen, die in der Zelle Retentionsbereich befestigen können Axone in die andere Seite des zusammengebauten MCP durch zentrale Kanäle wachsen, ist es wichtig zu Platte hoher Dichte von Neuronen in der Zelle zu gewährleisten, Plattierungsfläche genug Neuronen zur gebunden sind Zellrückhaltung Bereich. Ein repräsentatives Bild von hoher Dichte von neuronalen Axonen ist in 2A gezeigt.
- Am folgenden Tag wurde das Neuron Plattierungsmedium durch die regelmäßige Neuron Kulturmedium ersetzt. Ändern Medium wurde durch vorsichtiges Absaugen des Mediums von der Zelle Plattierungsfläche der Kammer erreicht, aber nicht aus der Zelle Retentionsbereich des zusammengebauten MCP., Um Luftblasen in der Zelle Retentionsbereich und den zentralen Verbindungskanäle vermeiden Luftblasen stark hemmen das Axon Auswuchs und anschließenden Eintritt in die zentralen Kanäle in der MCP. Glial-cell derived neurotrophic factor (GDNF, 10-20 ng / ml) wurde auch auf der anderen (linken) Seite angefügtder Kammer am selben Tag um die Induktion von Axon Auswuchs 5 aus dem neuronalen Seite und quer durch zentralen Kanäle der versammelten MCP (2A) zu erleichtern. Angemessene Menge der spontanen Neuritenwachstum ohne GDNF wird ebenfalls aus dem neuronalen Seite und quer durch zentralen Kanäle der zusammengebauten MCP beobachtet. Axone, die in den zentralen Kanal geben sind oft 2-3 Tage nach dem Ausplattieren beobachtet. Sobald die Axone in den zentralen Kanal geben, sie in der Regel geben die andere Seite innerhalb eines Tages. Axone sind normalerweise für mindestens eine Woche nach der Eingabe des intakten anderen Seite.
3. Zugabe von Astrozyten zu MCP eine unterteilte Co-Kultur zu etablieren
Primäre Astrozytenkulturen wurden aus dem P1-3 Maus pup Gehirn vorbereitet. Das Gehirn Dissoziation Verfahren ist ähnlich dem neuronalen Zellisolation oben beschriebenen Verfahrensweise. Astrozyten wurden zunächst in 10 cm Schüssel, wurden vorab überzogenMit Polyornithin (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) beschichtet. Die Astrozyten Kulturmedium (DMEM, 10% fetales Rinderserum, 1% Penicillin-streptomysin) wurde jeden Tag für die nächsten zwei Tage, um die Ablagerungen zu entfernen. Danach wurde das Medium alle drei Tage gewechselt.
- Astrozyten 90% konfluent geworden und bilden eine Monoschicht nach 7 Tagen. Konfluente Astrozyten wurden mit Trypsin behandelt und 150 ul des resuspendierten Astrozyten (1x10 6 / ml) wurden in die Zelle Plattierungsfläche des linken Seite des zusammengebauten MCP erneut ausplattiert wenn Axone etwa einzugeben sind oder einfach in der linken Seite des eingegebenen die versammelte MCP. Astrozyten wurden in der Regel beschichtet 4-5 Tage nachdem die Neuronen waren vergoldet. GDNF wurde zuerst vor der erneuten Beschichtung der Astrozyten in die linke Seite des MCP entfernt. Re-plattierten Astrozyten wurden in der Zelle Retentionsbereich angebracht, wie durch die Immunfärbung GFAP (Abbildung 1) gezeigt. Nur minimale Strömung des Mediums zwischen beiden Seiten der Kammern (bestimmt durch Fluoreszenz dja) wurde auf die MCP gefunden, wie zuvor 4,6 gezeigt.
- Astrozyten 90% konfluent geworden und bilden eine Monoschicht nach 7 Tagen. Konfluente Astrozyten wurden mit Trypsin behandelt und 150 ul des resuspendierten Astrozyten (1 x 10 6 / ml) wurden in die Zelle Plattierungsfläche des linken Seite des zusammengebauten MCP erneut ausplattiert wenn Axone zu betreten oder nur in den linken eingegeben sind Seite des zusammengebauten MCP. Astrozyten wurden in der Regel beschichtet 4-5 Tage nachdem die Neuronen waren vergoldet. GDNF wurde zuerst vor der erneuten Beschichtung der Astrozyten in die linke Seite des MCP entfernt. Re-plattierten Astrozyten wurden in der Zelle Retentionsbereich angebracht, wie durch die Immunfärbung GFAP (Abbildung 1) gezeigt. Nur minimale Strömung des Mediums zwischen beiden Seiten der Kammern (bestimmt durch Fluoreszenzfarbstoffe) wurde auf die MCP gefunden, wie zuvor 4,6 gezeigt.
- Nach der erneuten Beschichtung der Astrozyten, Axone, die die linke Seite des zusammengesetzten MCP eingegebenen direkt mit dem astr interagierenocytes entweder durch direkten Kontakt oder axonalen Freisetzung von löslichen Faktoren. Immunfärbung von astroglialen Plasmamembran Glutamattransporter GLT1 und neuronalen βIII-Tubulin wurde durchgeführt, um die Wechselwirkung zwischen den Axonen und die Astrozyten visualisieren, wie in 2D-F dargestellt.
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Representative Results
Zeitraffer-Aufnahmen Analyse der Axon-induzierte GLT1 Promotoraktivierung in Astrozyten
Der Fächerwagen Neuron und Astrozyten Kokultur System erlaubt nur die neuronalen Prozesse, insbesondere die Axone, um selektiv mit Astrozyten interagieren. Nach der erfolgreichen Etablierung der Axon und Astrozyten (oder andere Gliazellen) Co-Kultur im zusammengebauten MCP, können verschiedene Arten von Axon-Glia Interaktionen wie studiert werden; Axon-induzierte Aktivierung von Astrozyten-Gen-Promotor-Aktivierung, Astrozyten-induzierte axonale Wegfindung , Axon-induzierte astrogliale Ca 2 + Antwort, und Axon-induzierte Myelinsynthese in Oligodendrozyten. Alle diese Anwendungen die Vorteile der Verfügbarkeit leistungsfähiger fluoreszierenden Reporter für Gliazellen oder Farbstoffe geladen diesen Zellen.
Hier beschreiben wir Axon-induzierte transkriptionelle Aktivierung von Astrozyten Glutamat-Transporter 1 (GLT1) Promotor durch bakterielle künstliche Chromosomeneinige (BAC) GLT1 eGFP transgenen Mäusen und dies Unterteiltes Co-Kultursystem. In den BAC GLT1 eGFP transgenen Mäusen wurde eine eGFP-Fluoreszenz-Reporter unter der Kontrolle des Promotors GLT1 genomischen 7 überexprimiert. Die Expression des Reportergens eGFP korreliert mit endogenen GLT1 Promotoraktivierung Proteinexpression und funktionelle Aktivität 7 erlaubt damit eine Bewertung der GLT1 Promotoraktivität in einzelnen Astrozyten in situ. Astrogliale GLT1 Ausdruck ist stark abhängig neuronale Stimulation 6,8. Primären Astrozyten auszudrücken Mindestmaß an GLT1, aber GLT1 Expression (beide mRNA und Protein) sind stark in Astrozyten, die co-kultivierten mit Neuronen 9 sind induziert. Der Beweis wird hier durch deutlich erhöhte GLT1 Immunreaktivität in compartmentalized Co-Kultur-System (Abbildung 3). Bei herkömmlichen Neuron und Astrozyten Co-Kulturen, hohe Dichte von Neuronen machen es weniger ideal, um das zu beobachtenWirkung von neuronalen Axonen auf der Transkriptionsaktivierung von GLT1 Promotor.
Zur Überwachung der Axon-abhängigen Promotor GLT1 Aktivierung Wildtyp Neuronen in der rechten Seite des zusammengesetzten MCP und den Axonen kultiviert wurden nach dem Aufbringen des GDNF auf der linken Seite des zusammengebauten MCP induziert wurden. Astrozyten aus den BAC GLT1 eGFP Mäuse wurden in der linken Seite des zusammengebauten MCP kultiviert nachdem die Axone haben induziert worden und gerade eingegeben in die linke Seite des zusammengesetzten MCP. Es wurden insgesamt 6 Tagen (24 Stunden bis 140 Stunden) Zeitraffer-Bilder wurden gesammelt, um die eGFP Fluoreszenzintensität Änderung in Echtzeit und das Axon-Wachstum in der MCP überwachen. Wie in 4A gezeigt, wurde sehr minimalen eGFP-Fluoreszenz Expression in Astrozyten 24 h nach dem Plattieren der Astrozyten beobachtet. Deutliche Erhöhung der eGFP Intensität wurde 48 Stunden nach Co-Kultur beobachtet (von 24 h bis 68 h), wenn Axone auch in den Astrozyten Seite und Wechselwirkungen sindt direkt Kontakt mit Astrozyten (Abbildung 4 v. Chr.). Auf der anderen Seite wurde eGFP Fluoreszenzintensität degressiv einmal Axone wurden eingefahren und durch Kainit (200 pM) induzierten neuronalen Zelltod zu neuronalen (rechten) Seite des zusammengebauten MCP (4D-F) degeneriert. Die dynamische Änderung der eGFP Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von den Axonen klar gezeigt, dass astroglialen GLT1 Promotoraktivität moduliert durch das Axon-Wechselwirkung ist.
Abbildung 1. Prinzipskizze mikrofluidischen Neuron und Astrozyten Kokultur Plattform. Mikrofluidische Kultur Plattform (MCP) zwei Abteile, die durch den zentralen Kanälen verbunden sind. Zellen können von der Zelle Plattierungsfläche auf jeder Seite plattiert werden und neuronalen Axonen aus der Zelle Retentionsbereich und Durchlauf durch die zentralen Kanäle zu ent induziertener auf der anderen Seite (insert Maßstab 50 um).
Abbildung 2. Induktion von neuronalen Axonen und Wechselwirkung von Axonen mit Astrozyten in MCP MCP. (A) mit hoher Dichte von Neuronen in der Zelle Retentionsbereich des zusammengebauten MCP, offenbart durch βIII-Tubulin-Immunfärbung. Maßstab: 50 um (B) Vergrößerte Ansicht von Axonen Überschreiten der zentralen Kanäle und Eingabe in die andere Seite des MCP. Maßstabsbalken: 100 um (C) Axon Wachstumskegel vom bIII-Tubulin Färbung ergab wenn Axone in die andere Seite des MCP Kraft. Maßstab: 100 um (D) Axon-Bundles, die durch den zentralen Kanal wachsen und geben Sie in die andere Seite des MCP. (E) Astrozyten zeigte der GLT1 Immunfärbung in der glialen Seite des MCP. (F) Merged Bild zeigt den Kontakt zwischen Axonen und GLT1 positive Astrozyten. Maßstab: 50 um.
Abbildung 3. Neuron-abhängige Induktion von GLT1 Expression in primären Astrozyten GLT1 Immunreaktivität in (A) primäre Astrozytenkulturen, Scale bar:. 50 um (B) primären neuronalen Kulturen, und (C) primären Neuronen und Astrozyten Co-Kulturen. Maßstab: Neuronen sind durch Immunfärbung βIII-Tubulin gezeigt. Deutliche Erhöhung der GLT1 Immunreaktivität wurde in Neuronen und Astrozyten Co-Kulturen beobachtet.
Abbildung 4. Zeitraffer-Bilder von Axon-induzierte GLT1 Promotoraktivierung in MCP mit BAC GLT1 eGFP Astrozyten und Wildtyp Neuronen. Dynamische Änderungen der eGFP Intensität und das Wachstum von Axonen wurden durch eine 6d Zeitraffer-Aufnahme nach Astrozyten plating gesammelt. (A) 24 (B) 48h (C) 68h (D) 92h (E) 112h (F) 140h. Eingabe einerXON (hervorgehoben durch die gelben Pfeile) in den Astrozyten Seite wurde von 48h 92h die mit einer erhöhten eGFP Fluoreszenzintensität korreliert beobachtet. Abnahme der Fluoreszenzintensität eGFP aufgetreten aus 112h 140h um nach Kainit (200 pM) wurde auf der Seite, an neuronalen 92h aufgebracht, um neuronalen Zelltod und Axon Degeneration induzieren. Maßstab: 50 um.
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Discussion
Die MCP basierte Neuron und Astrozyten Co-Kultur-System ermöglicht Dissektion detaillierte Neuron Astroglia Signalwege, indem nur die Axone leiten die zentralen Kanäle und Interaktion mit den Astrozyten. Diese Co-Kultur-System bequem eingerichtet werden mit herkömmlichen Neuron und Astrozyten Kultur Verfahren. Beschrieben wir auch eine praktische Anwendung dieser Co-Kultur-System durch den Einsatz eines eGFP basierte Reporter für den Nachweis Axon-abhängige GLT1 Promotoraktivierung in Astrozyten.
Das MCP basierte Neuron und Astroglia Co-Kultur-System bietet zahlreiche Vorteile gegenüber herkömmlichen Co-Kultur Methoden: 1) zu visualisieren und den expliziten morphologischen Wechselwirkungen zwischen einzelnen Axonen und Astrozyten in Echtzeit unter hochauflösende Mikroskopie 2) ein gut gesteuerte unabhängige Mikroumgebung auf pharmakologische Manipulation für zellspezifische Wirkung anzuwenden 3) Analyse der Promotoraktivierungund Proteinexpression induziert ausschließlich / in Astrozyten, die moduliert durch Axone Kontakt sind hoch reguliert. Da die Verfahren für die Kultur primärer Mikroglia 10 und Oligodendrozyten 11 gut etabliert haben, kann diese MCP Co-Kultursystem auch Neurons werden Mikroglia und Neuron angewendet Oligodendrozyten Co-Kulturen. Inzwischen haben wir auch erkennen, dass diese Co-Kultur-System für die empfindliche Bildanalyse wird an der einzigen Zelle Ebene, die komplementär zu den herkömmlichen Ansätzen zur Analyse große Menge von Zellen, wie RNA oder Protein-Analyse bestimmt ist. Außerdem vereinfacht die enorme unserem System Wechselwirkung zwischen Neuronen und Gliazellen in vivo durch beispielhaften Wechselwirkung zwischen Einzelzelle und Axon. All dies sollte bei der Interpretation der Ergebnisse aus dieser Ko-Kultur-System werden. Im ZNS sind Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Axonen und Gliazellen weit verbreitet und sind von entscheidender Bedeutung sowohl für Neuron undGliazellen Funktionen 12,13. Die Entwicklung dieses Co-Kultur-System ermöglicht Imaging-basierte Zerlegung dieser Wechselwirkungen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir möchten Dr. Jeffrey Rothstein für die Bereitstellung von BAC GLT1 eGFP Mäusen und GLT1 Antikörper danken; Tufts Center for Neuroscience Research (NIH P30 NS047243; PI, Rob Jackson) für die Bereitstellung von wertvollen Core Facilities; New Fakultät Rekrutierung Zuschuss (NIH P30 5P30NS069254-02 , PI, Phil Haydon) in Tufts Neuroscience Department.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 | for plating neuron for neuron cutlure medium |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F4135 | for astrocyte culture medium |
| Glial derived nerve factor | R&D Systems | 212-GD | Apply 10-20 ng/ml to neuron side of chamber |
| Dulbecco modified eagle medium high glucose | Sigma-Aldrich | 11995 | |
| 70 mm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Sterile glass bottom dish | MatTek Corporation | ||
| Microfluidic culture platforms | Xona Microfluidics LLC | SND150 | |
| 6 wells of the culture plate | Cellstar | 657 160 | |
Neuron culture medium
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| Neuron culture medium for plating cell
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| Astrocyte culture medium
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| Table 1. Materials used in the microfluidic culture platform-based neuronal axon and glia co-culture system. |
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References
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