Summary
Deze studie beschrijft de procedures van het opzetten van een nieuwe neuronale axon en (astro) glia co-cultuur platform. In deze co-cultuur systeem, manipulatie van directe interactie tussen een axon (en single gliale cel) wordt het mogelijk, waardoor mechanistische analyse van de wederzijdse neuron naar gliale signalering.
Abstract
Proper neuron glia interactie is essentieel om fysiologische functie van het centrale zenuwstelsel (CNS). Deze bi-directionele communicatie wordt sophisticatedly gemedieerd door specifieke signaalwegen tussen neuron en glia 1,2. Identificatie en karakterisering van deze signaalroutes is essentieel voor het begrijpen hoe neuron glia interactie vormen CNS fysiologie. Eerder hebben neuron en glia gemengde kweken op grote schaal gebruikt voor het testen en karakteriseren signaalwegen tussen neuronen en glia. Wat we geleerd van deze preparaten en andere in vivo gereedschap heeft echter gesuggereerd dat onderlinge signalering tussen neuronen en glia vaak voor in specifieke compartimenten in neuronen (bijvoorbeeld axon, dendriet of soma) 3. Dit maakt het belangrijk om de ontwikkeling van een nieuwe cultuur systeem dat scheiding van neuronale compartimenten maakt en in het bijzonder onderzoekt de interactie tussen glia en neurointerne axonen / dendrieten. Bovendien is de conventionele mengcultuur systeem niet kunnen differentiëren de oplosbare factoren en direct contact membraan signalen tussen neuronen en glia. Bovendien is de grote hoeveelheid neuronen en gliacellen in de conventionele co-cultuur ontbreekt het de resolutie nodig is om de interactie tussen een axon en een gliacel observeren.
In deze studie beschrijven we een nieuwe axon en glia co-cultuur systeem met behulp van een microfluïdisch platform cultuur (MCP). In dit co-cultuur systeem worden neuronen en gliale cellen gekweekt in aparte kamers die zijn verbonden via meerdere centrale kanalen. In deze microfluïdische cultuur platform, alleen neuronale processen (met name axonen) kan de gliale kant binnenkomen via de centrale kanalen. In combinatie met krachtige fluorescerend eiwit labeling, dit systeem rechtstreeks onderzoek van signaalroutes tussen axonale / dendritische en gliale interacties dergelijkes axon-gemedieerde transcriptionele regulatie in glia, glia-gemedieerde receptor handel in neuronale terminals, en glia-gemedieerde axon groei. De smalle diameter van de kamer ook significant verbiedt de stroom van de neuron verrijkte medium in de kamer gliale, vergemakkelijken sondering van de direct membraan-eiwit interactie tussen axonen / dendrieten en gliale oppervlakken.
Protocol
1. Vergadering van de Microfluïdische Cultuur Kamer (MCP)
- MCP (figuur 1) zijn ontworpen voor open kamers compartimenten culturen van verschillende soorten cellen 4. Het heeft meestal twee compartimenten die zijn verbonden via het centrale kanaal (3 urn in diameter). Montage van MCP met glazen bodem gerechten is noodzakelijk voor het bereiden van culturen en de daaropvolgende beeldvorming analyse.
- Eerste laag steriele glazen bodem gerechten met polyornithine (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) opgelost in natriumtetraboraat (Sigma-Aldrich, 10 mM pH 8,5) en werden overnacht geïncubeerd bij 37 ° C.
- De volgende dag werden de beklede glazen bodem gerechten driemaal gewassen met ddH 2 O en gedroogd onder steriele zuurkast. De glazen bodem gerechten zijn daarna verder bekleed met laminine (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) en gedroogd onder UV licht gedurende 1 uur. Beklede schalen zijn klaar voor gebruik of kan worden opgeslagen bij -20 ° C tot gebruik. Deze coating eenopnieuw nodig plating neuronen en astrocyten in de co-cultuur.
- Om de cultuur platform monteren platforms werden microfluïdische cultuur bovenop de gecoate glazen bodem gerechten centrale verbindingskanalen op de onderkant om een goede afdichting te vormen. Regelmatige neuron of astrocyten voedingsbodems toegevoegd (de cel plating gebieden) aan beide zijden (fig. 1) in de gemonteerde MCP en gedurende 2-4 uur bij 37 ° C, om te zorgen geen lekkage tussen MCP en de glazen bodem schotel. We hebben getest met medium voor het uitplaten cellen om ervoor te zorgen is er geen lekkage. De montage van MCP op de glazen bodem schaal moet vers worden bereid voor gebruik.
2. Voorbereiding van Neuronale Cultuur en Inductie van Neuronale Axonen in gemonteerd MCP
- Corticale neuronale celculturen werden vers bereid uit embryonale 14 tot 16 dagen oude muis hersenen. Het neuron kweekmedium is samengesteld uit neurobasal medium, 2% B27 neurobasal supplement, 2 mM glutamine door 1% van 100x glutamax en 1% penicilline-streptomysin. Na dissectie van de hersenen van muizen, werd de meninges uit de cortex onder de dissectiemicroscoop. Het weefsel werd vervolgens fijngemaakt met een scheermesje om kleine weefselblokken maken om de oppervlakte blootgesteld aan trypsine verhogen. Weefselblokken werden getrypsiniseerd (Sigma-Aldrich, 0,05% trypsine) gedurende 10 min in een 37 ° C waterbad en vervolgens gedissocieerd door trituratie voorzichtig met vuurgepolijst Pasteur pipet. Gedissocieerde cellen werden gefiltreerd door een 70 pm zeef duidelijke neuronale celsuspensie verzamelen.
- Neuronen (2-3 x 10 6 / ml, 150 ul) werden uitgezet op de cel plating gebieden rechts (figuur 1) van de geassembleerde MCP zodat neuronen kunnen hechten in de cel behouden (Figuur 1). Vers bereide neuronen werden bedekt met neuron plating medium dat met 5% foetaal bovine serum (Hyclone) aangevuld in de regelgevingr neuron kweekmedium. Omdat alleen de neuronen die hechten in de cel bewaargebied kunnen axonen groeien tot de andere kant van de samengestelde MCP door centrale kanalen, is het belangrijk om plate hoge dichtheid van neuronen in de cel plating gebied zorgen voor voldoende neuronen aan de cel retentiegebied. Een representatief beeld van hoge dichtheid van neuronale axonen wordt getoond in Figuur 2A.
- De volgende dag werd het neuron plating medium vervangen door kweekmedium regelmatig neuron. Veranderende medium werd bewerkstelligd door voorzichtig afzuigen van het medium van de cel plating ruimte van de kamer, maar niet van de cel retentiegebied van de samengestelde MCP, om luchtbellen in de cel retentiegebied en de centrale verbindingskanalen voorkomen. Luchtbellen zal het axon uitgroei en boeking achteraf ernstig belemmeren in de centrale kanalen in de MCP. Gliale cellen afgeleide neurotrofe factor (GDNF, 10-20 ng / ml) werd toegevoegd aan de andere (links)van de kamer op dezelfde dag aan de inductie van axon uitgroei 5 vergemakkelijken van de neuronale zijde en kras door centrale kanalen van het geassembleerde MCP (Figuur 2A). Eerlijk bedrag van spontane neurietuitgroei zonder GDNF wordt ook waargenomen vanuit de neuronale kant en cross via centrale kanalen van de geassembleerde MCP. Axonen die doorlopen in het centrale kanaal worden vaak waargenomen 2-3 dagen na uitplaten. Zodra de axons gaan in het centrale kanaal, die doorgaans naar de andere zijde binnen een dag. Axonen gewoonlijk intact gedurende ten minste een week na het invoeren van de andere kant.
3. Toevoeging van Cultured Astrocyten om MCP aan een Gecompartimenteerde Co-cultuur systeem in te stellen
Primaire astrocyt culturen werden bereid uit de P1-3 muis pup hersenen. De hersenen dissociatie procedure lijkt op de neuronale celisolatie hierboven beschreven procedure. Astrocyten werden voor het eerst uitgeplaat in 10 cm schotel die voorafBekleed met polyornithine (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml). De astrocyt kweekmedium (DMEM, 10% foetaal runderserum, 1% penicilline-streptomysin) werd elke dag twee dagen om het puin. Daarna werd het medium elke drie dagen.
- Astrocyten 90% confluent worden en vormen een monolaag na 7 dagen. Confluente astrocyten werden getrypsiniseerd en 150 ul geresuspendeerd astrocyten (1x10 6 / ml) werden opnieuw uitgeplaat in de cel plating gebied van de linker zijde van het geassembleerde MCP wanneer axons gaat invoeren of zijn juist in de linkerkant van de samengestelde MCP. Astrocyten werden meestal bedekt 4-5 dagen na de neuronen waren verguld. GDNF werd eerst verwijderd voordat de re-plating van de astrocyten in de linkerkant van de MCP. Re-plated astrocyten werden bevestigd in de cel retentiegebied, zoals blijkt uit de GFAP immunokleuring (figuur 1). Minimale mediumstroom tussen beide zijden van de kamers (bepaald door fluorescentie dja) gevonden in de MCP, zoals eerder getoond 4,6.
- Astrocyten 90% confluent worden en vormen een monolaag na 7 dagen. Confluente astrocyten werden getrypsiniseerd en 150 ul geresuspendeerd astrocyten (1 x 10 6 / ml) werden opnieuw uitgeplaat in de cel plating gebied van de linker zijde van het geassembleerde MCP wanneer axons gaat invoeren of alleen zijn opgenomen in de linker zijde van het geassembleerde MCP. Astrocyten werden meestal bedekt 4-5 dagen na de neuronen waren verguld. GDNF werd eerst verwijderd voordat de re-plating van de astrocyten in de linkerkant van de MCP. Re-plated astrocyten werden bevestigd in de cel retentiegebied, zoals blijkt uit de GFAP immunokleuring (figuur 1). Minimale mediumstroom tussen beide zijden van de kamers (bepaald door fluorescentie kleurstoffen) gevonden in de MCP, zoals eerder getoond 4,6.
- Na de re-plating van de astrocyten, axons dat de linkerzijde van de samengestelde MCP ingevoerde directe interactie met de Astrocytes door ofwel direct axonale contact of afgifte van oplosbare factoren. Immunokleuring van astrogliale plasmamembraan glutamaattransporter GLT1 en neuronale βIII-tubuline werd uitgevoerd om de interactie tussen axonen en astrocyten visualiseren, zoals in figuur 2D-F.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Time-lapse imaging analyse van axon-geïnduceerde GLT1 promotor activering in astrocyten
De compartimenten neuron en astrocyt co-cultuur systeem slechts de neuronale processen, vooral de axonen, selectief interactie met astrocyten. Na de succesvolle oprichting van axon en astrocyten (of andere gliacellen) co-cultuur in de gemonteerde MCP, kan verschillende types van axon-glia interacties worden bestudeerd, zoals; axon-geïnduceerde activatie van astrogliale gen promoter activering, astrocyten-geïnduceerde axon begeleiding , axon geïnduceerde Ca2 + astrogliale reactie en axon myeline geïnduceerde synthese in oligodendrocyten. Al deze toepassingen profiteren van de beschikbaarheid van krachtige fluorescente reporters voor gliacellen of kleurstoffen geladen deze cellen.
Hier beschrijven we axon-geïnduceerde transcriptionele activering van astrogliale glutamaat transporter 1 (GLT1) promotor door het gebruik van bacteriële kunstmatige chromosommige (BAC) GLT1 eGFP transgene muizen en deze gecompartimenteerde co-cultuur systeem. In de BAC GLT1 eGFP transgene muizen werd een eGFP fluorescentie reporter overexpressie onder controle van de promoter GLT1 genomische 7. De expressie van het reporter eGFP correleert met endogene GLT1 promoter activatie eiwitexpressie en functionele activiteit 7 waardoor het mogelijk wordt de GLT1 promotoractiviteit in enkele astrocyten in situ. Astrogliale GLT1 expressie is sterk afhankelijk van neuronale stimulatie 6,8. Primaire astrocyten drukken minimum GLT1, maar GLT1 expressieniveaus (zowel mRNA en eiwit) sterk geïnduceerd in astrocyten die samen gekweekt met neuronen 9. Het bewijs wordt hier getoond door sterk toegenomen GLT1 immunoreactiviteit in gecompartimenteerde co-cultuur systeem (figuur 3). In conventionele neuron en astrocyt co-culturen, hoge dichtheid van neuronen maken het minder ideaal om de te observereneffect van neuronale axonen op de transcriptionele activering van GLT1 promoter.
Toezien op de axon-afhankelijke GLT1 promoter activatie wild type neuronen werden gekweekt in de rechterkant van de samengestelde MCP en de axonen waren geïnduceerd na toepassing van de GDNF aan de linkerkant van de samengestelde MCP. Astrocyten afgeleid van de BAC GLT1 eGFP muizen werden gekweekt in de linkerkant van de geassembleerde MCP nadat de axons zijn geïnduceerd en zojuist in de linkerkant van de samengestelde MCP. Een totaal van 6 dagen (24 uur tot 140 uur) time-lapse beelden werden verzameld om de fluorescentie-intensiteit eGFP verandering in real time en het axon groei van de MCP volgen. Zoals getoond in figuur 4A, was zeer minimale fluorescentie eGFP expressie in astrocyten waargenomen 24 uur na het plateren van de astrocyten. Significante toename van de eGFP intensiteit werd waargenomen 48 uur na co-cultuur (van 24 uur tot 68 uur) wanneer axonen zijn ver in de astrocyten kant en interactiet direct contact op te nemen met de astrocyten (Figuur 4 v. Chr.) Anderzijds werd eGFP fluorescentie intensiteit geleidelijk omlaag na axons werden teruggetrokken en gedegenereerd door KAINIET (200 uM) geïnduceerde neuronale celdood op de neuronale (rechts) van de geassembleerde MCP (Figuur 4D-F). De dynamische verandering van eGFP fluorescentie-intensiteit in reactie op de axons duidelijk aangetoond dat astrogliale GLT1 promoter activiteit wordt gemoduleerd door de axon interactie.
Figuur 1. Schematische weergave van microfluïdische neuron en astrocyt co-cultuur platform. Microfluïdische cultuur platform (MCP) heeft twee compartimenten die zijn aangesloten via de centrale kanalen. Cellen worden uitgeplaat uit de cel plating gebied aan elke kant en neuronale axonen worden geïnduceerd uit de cel retentiegebied en door het centrale kanalen enter aan de andere kant (invoegen schaalbalk 50 pm).
Figuur 2. Inductie van neuronale axonen en interactie van axonen met astrocyten in MCP MCP. (A) Hoge dichtheid van neuronen in de cel retentiegebied van de samengestelde MCP, onthuld door βIII-tubuline immunokleuring. Schaalmaat: 50 pm (B) vergroot aanzicht van axonen die de centrale kanalen en sluiten van de andere kant van de MCP. Schaalmaat: 100 pm (C) Axon groeikegel blijkt uit de BIII-tubuline kleuring wanneer axons gaan de andere kant van de MCP. Schaalmaat: 100 pm (D) Axon bundels die groeien door het centrale kanaal en gaan de andere kant van de MCP. (E) Astrocytes blijkt uit de GLT1 immunokleuring in de gliale kant van de MCP. (F) samengevoegde afbeelding toont het contact tussen axonen en GLT1 positieve astrocyten. Scale bar: 50 pm.
Figuur 3. Neuron-afhankelijke inductie van GLT1 expressie in primaire astrocyten GLT1 immunoreactiviteit in (A) primaire astrocyten culturen, Schaal bar:. 50 pm (B) primaire neuronale culturen, en (C) de primaire neuron en astrocyt co-culturen. Schaalmaat: Neuronen worden aangetoond door immunokleuring van βIII-tubuline. Significante toename van de GLT1 immunoreactiviteit werd waargenomen in neuron en astrocyt co-culturen.
Figuur 4. Time-lapse beelden van axon-geïnduceerde GLT1 promotor activering in MCP met BAC GLT1 eGFP astrocyten en wild-type neuronen. Dynamische veranderingen van eGFP intensiteit en de groei van axonen werden verzameld door middel van een 6d time-lapse-opname na astrocyten plating. (A) 24 (B) 48h (C) 68h (D) 92h (E) 112H (F) 140h. Het invoeren van eenXON's (gemarkeerd door de gele pijlen) in de astrocyten kant werd waargenomen vanaf 48h tot 92h die correleren met een verhoogde eGFP fluorescentie-intensiteit. Afname van eGFP fluorescentie-intensiteit van opgetreden 112H tot 140h na KAINIET (200 uM) werd op de neuronale kant bij 92h tot neuronale celdood en axon degeneratie induceren. Scale bar: 50 pm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De MCP based neuron en astrocyten co-cultuur systeem maakt dissectie gedetailleerde neuron astroglia signaalwegen door alleen de axons langs de centrale kanalen en interactie met de astrogliale cellen. Deze co-cultuur systeem kan eenvoudig worden ingesteld met conventionele neuron en astrocyte cultuur procedures. We hebben ook beschreef een praktische toepassing van deze co-cultuur systeem door het gebruik van een eGFP gebaseerde reporter voor het aantonen van axon-afhankelijke GLT1 promotor activering in astrocyten.
Dit MCP gebaseerde neuron en astroglia co-cultuur systeem biedt een aantal voordelen ten opzichte van conventionele co-cultuur methoden: 1) vermogen om te visualiseren en te identificeren de expliciete morfologische interactie tussen enkele axonen en astrocyten in real-time onder hoge-resolutie microscopie 2) een goed gecontroleerde onafhankelijke micro de farmacologische manipulatie aanvragen celspecifieke effect 3) analyse van promoter activatieen eiwitexpressie uitsluitend geïnduceerd / up-gereguleerd in astrocyten die gemoduleerd door axonen contact. De cultuur procedures voor primaire microglia 10 en oligodendrocyten 11 zijn goed ingeburgerd kan deze MCP co-cultuur systeem ook worden toegepast op neuron microglia en oligodendrocyten te neuron co-culturen. Ondertussen hebben we ook erkennen dat co-cultuur is bedoeld voor de gevoelige beeldanalyse op enkele cel, die complementair is aan de conventionele benaderingen van analyse van grote hoeveelheden cellen, zoals RNA of eiwit analyse. Bovendien ons systeem vereenvoudigt de enorme interactie tussen neuronen en gliacellen in vivo door tentoonspreiden interactie tussen cellen en axon. Al deze moet worden gehouden bij het interpreteren van de resultaten van deze co-cultuur systeem. In het CNS, interacties tussen axonen en verschillende gliacellen zijn wijdverspreid en zijn van essentieel belang voor zowel neuron engliale functies 12,13. De ontwikkeling van deze co-cultuur systeem zal op basis van beeldvormingstechnieken dissectie van deze interacties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We willen graag Dr Jeffrey Rothstein bedanken voor het verstrekken van BAC GLT1 eGFP muizen en GLT1 antilichaam; Tufts Center for Neuroscience Research (NIH P30 NS047243, PI, Rob Jackson) voor het leveren van waardevolle kernfaciliteiten; Nieuwe faculteit werving subsidie (NIH P30 5P30NS069254-02 , PI, Phil Haydon) in Tufts Neuroscience Department.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 | for plating neuron for neuron cutlure medium |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F4135 | for astrocyte culture medium |
| Glial derived nerve factor | R&D Systems | 212-GD | Apply 10-20 ng/ml to neuron side of chamber |
| Dulbecco modified eagle medium high glucose | Sigma-Aldrich | 11995 | |
| 70 mm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Sterile glass bottom dish | MatTek Corporation | ||
| Microfluidic culture platforms | Xona Microfluidics LLC | SND150 | |
| 6 wells of the culture plate | Cellstar | 657 160 | |
Neuron culture medium
|
|||
| Neuron culture medium for plating cell
|
|||
| Astrocyte culture medium
|
|||
| Table 1. Materials used in the microfluidic culture platform-based neuronal axon and glia co-culture system. |
|||
References
- Stevens, B. Neuron-astrocyte signaling in the development and plasticity of neural circuits. Neuro-Signals. 16, 278-288 (2008).
- Paixao, S., Klein, R. Neuron-astrocyte communication and synaptic plasticity. Current opinion in neurobiology. 20, 466-473 (2010).
- Fields, R. D., Stevens-Graham, B. New insights into neuron-glia communication. Science. 298, 556-562 (2002).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature. 1, 2128-2136 (2006).
- Wang, C. Y. Regulation of neuromuscular synapse development by glial cell line-derived neurotrophic factor and neurturin. The Journal of biological chemistry. 277, 10614-10625 (2002).
- Yang, Y. Presynaptic regulation of astroglial excitatory neurotransmitter transporter GLT1. Neuron. 61, 880-894 (2009).
- Regan, M. R. Variations in promoter activity reveal a differential expression and physiology of glutamate transporters by glia in the developing and mature CNS. The Journal of neuroscience. 27, 6607-6619 (2007).
- Swanson, R. A. Neuronal regulation of glutamate transporter subtype expression in astrocytes. The Journal of neuroscience. 17, 932-940 (1997).
- Schlag, B. D. Regulation of the glial Na+-dependent glutamate transporters by cyclic AMP analogs and neurons. Molecular pharmacology. 53, 355-369 (1998).
- Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state. Journal of immunological. 300, 32-46 (2005).
- Espinosa-Jeffrey, A., Wakeman, D. R., Kim, S. U., Snyder, E. Y., de Vellis, J. Culture system for rodent and human oligodendrocyte specification, lineage progression, and maturation. Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, (2009).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, 430-440 (2008).
- Debanne, D., Rama, S. Astrocytes shape axonal signaling. Science signaling. 4, pe11 (2011).
