Summary
Cette étude décrit les procédures de mise en place d'un axone des neurones et roman (astro) glie plate-forme de co-culture. Dans ce système de co-culture, la manipulation de l'interaction directe entre un axone unique (et unique cellule gliale) devient possible, ce qui permet une analyse mécaniste du neurone mutuelle à la signalisation gliales.
Abstract
Neurone propre à l'interaction glie est essentielle à la fonction physiologique du système nerveux central (SNC). Cette communication bidirectionnelle est subtilement médiée par les voies de signalisation spécifiques entre les neurones et les cellules gliales 1,2. L'identification et la caractérisation de ces voies de signalisation est essentielle à la compréhension de la façon dont l'interaction neurone glie formes physiologie du système nerveux central. Auparavant, des cultures de neurones et de cellules gliales mixtes ont été largement utilisés pour tester et caractériser les voies de signalisation entre les neurones et les cellules gliales. Ce que nous avons appris de ces préparations et autres outils in vivo, cependant, a suggéré que la signalisation mutuelles entre neurones et cellules gliales sont souvent produits dans des compartiments spécifiques à l'intérieur des neurones (c.-à axones, dendrites, ou soma) 3. Il est donc important de développer un nouveau système de culture qui permet la séparation des compartiments neuronaux et étudie spécifiquement l'interaction entre les cellules gliales et neuroaxones internes / dendrites. En outre, le système de culture conventionnel mixte n'est pas capable de différencier les facteurs solubles et directs signaux de contact membranaire entre les neurones et les cellules gliales. En outre, la grande quantité de neurones et des cellules gliales dans le classique système de co-culture n'a pas la résolution nécessaire pour observer l'interaction entre un axone unique et une cellule gliale.
Dans cette étude, nous décrivons une nouvelle axone et les cellules gliales du système de co-culture avec l'utilisation d'une plate-forme microfluidique culture (MCP). Dans ce système de co-culture, les neurones et les cellules gliales sont cultivées dans deux chambres séparées qui sont connectées par le biais de plusieurs canaux centraux. Dans cette plate-forme microfluidique la culture, seuls les processus neuronaux (en particulier les axones) peut entrer dans le côté gliale à travers les canaux centraux. En combinaison avec marquage des protéines fluorescentes puissant, ce système permet un examen direct des voies de signalisation entre les interactions axonales / dendritiques et des cellules gliales, une telles axone médiée par la régulation transcriptionnelle dans les cellules gliales, les cellules gliales trafic des récepteurs induite dans les terminaux de neurones, les cellules gliales et médiée par la croissance axonale. Le petit diamètre de la chambre également interdit de manière significative l'écoulement du fluide enrichi en neurone dans la chambre gliale, facilitant palpage de la protéine membranaire directe interaction entre les axones / dendrites et les surfaces gliales.
Protocol
1. Assemblée de la Chambre Culture microfluidique (MCP)
- MCP (figure 1) sont conçus pour les chambres ouvertes cultures compartimentées de différents types de cellules 4. Il a généralement deux compartiments qui sont reliés par les canaux centraux (3 m de diamètre). Assemblée des MCP avec fond de verre plats est nécessaire pour la préparation de cultures et d'analyse d'images ultérieur.
- Tout d'abord, manteau stériles à fond de verre plats de polyornithine (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) dissous dans le tétraborate de sodium (Sigma-Aldrich, 10 mM, pH 8,5) et on a incubé une nuit à 37 ° C.
- Le lendemain, les enduits à fond de verre plats ont été lavés trois fois avec ddH 2 O et séché sous la hotte stérile fumées. Les plats à fond de verre ont ensuite été en outre revêtues de laminine (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) et séché sous lumière UV pendant 1 heure. Plats couchés sont prêts à l'emploi ou peut être conservé à -20 ° C jusqu'à utilisation. Ce revêtement d'unre nécessaire pour les neurones et les astrocytes de placage dans la co-culture.
- À assembler la plate-forme de la culture, les plates-formes de culture microfluidiques ont été placés au-dessus des enduits à fond de verre plats centraux avec des canaux de liaison sur son côté inférieur pour former un joint étanche. Neurone régulière ou milieux de culture d'astrocytes ont été ajoutées (des zones de placage de cellules) sur les deux côtés (figure 1) dans le MCP assemblé et mis à incuber pendant 2-4 heures à 37 ° C, pour s'assurer qu'il n'ya pas de fuite entre le MCP et le verre Plat à fond. Nous avons testé avec support avant étalement des cellules pour s'assurer qu'il n'y ait pas de fuite. L'assemblage de MCP sur le plat à fond de verre doit être fraîchement préparée avant utilisation.
2. Préparation de la culture neuronale et induction de axones neuronaux en assemblée MCP
- Cultures de cellules neuronales corticales ont été fraîchement préparés à partir de cerveaux de souris embryonnaires 14-16 jours d'âge. Le milieu de culture neurone est composé du milieu neurobasal, 2% B27 neurobasaSupplément l, 2 mM de glutamine en ajoutant 1% de Glutamax 100x, et 1% de pénicilline-streptomysin. Après dissection du cerveau de la souris, les méninges a été retiré du cortex sous la loupe binoculaire. Le tissu est ensuite haché avec une lame de rasoir pour faire les petits blocs de tissus en vue d'augmenter l'aire de surface exposée à la trypsine. Blocs de tissus ont été traitées à la trypsine (Sigma-Aldrich, la trypsine 0,05%) pendant 10 min dans un bain à 37 ° C de l'eau, puis dissociées par trituration doucement avec une pipette Pasteur polie au feu. Les cellules dissociées sont filtrées à travers un filtre 70 microns pour recueillir clair suspension cellulaire neuronale.
- Neurones (2-3 x 10 6 / ml, 150 pi) ont été étalées sur les zones de placage de cellules sur le côté droit (figure 1) de la MCP assemblés de sorte que les neurones peuvent joindre dans la zone de rétention cellulaire (Figure 1). Neurones fraîchement préparés ont été étalées avec un milieu de placage neurone qui est supplémenté avec 5% de sérum fœtal bovin (Hyclone) dans la réglementationmilieu de culture neurone r. Parce que seuls les neurones qui se fixent dans la zone de rétention des cellules sont capables de croître axones vers l'autre côté de l'assemblée MCP par les voies centrales, il est important de densité élevée plaque de neurones dans la zone de placage cellulaire pour assurer suffisamment de neurones sont attachés à la cellule de zone de rétention. Une image représentative de la densité élevée des axones neuronaux est représenté sur la figure 2A.
- Le jour suivant, le milieu d'étalement neurone a été remplacé par du milieu de culture neurone régulière. Milieu changeant a été soigneusement réalisé par aspiration du milieu de la zone de placage cellule de la chambre, mais pas de la zone de retenue de cellules de la MCP assemblés, afin d'éviter les bulles d'air dans la zone de retenue de cellules et les canaux centraux de liaison. Bulles d'air fortement inhiber la croissance axonale et l'entrée subséquente dans les canaux centraux de la MCP. Cellules gliales facteur neurotrophique dérivé de cellules (GDNF, 10-20 ng / ml) a été ajoutée à l'autre (gauche)de la chambre le même jour pour faciliter l'induction de la croissance axonale 5 de la partie neuronale et traverser les canaux centraux de l'assemblée MCP (figure 2A). Mal de la croissance des neurites spontanée sans GDNF est également observé de côté neuronale et transversale à travers les canaux centraux de la MCP assemblé. Les axones qui entrent dans le canal central sont souvent observées 2-3 jours après placage. Une fois que les axones entrer dans le canal central, ils entrent habituellement dans l'autre en une journée. Les axones sont normalement intactes pendant au moins une semaine après la saisie de l'autre côté.
3. Outre une culture d'astrocytes à MCP pour établir une co-culture compartimentée système
Cultures primaires d'astrocytes ont été préparés à partir du cerveau de la souris P1-3 chiot. La procédure de dissociation cerveau est similaire à la procédure d'isolement de cellules neuronales décrit ci-dessus. Les astrocytes ont d'abord été étalées dans des boîte de 10 cm qui ont été préRevêtu de polyornithine (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml). Le milieu de culture des astrocytes (DMEM, 10% de sérum de veau fœtal, 1% de pénicilline-streptomysin) a été changé tous les jours pendant les deux prochains jours pour enlever les débris. Après cela, le milieu a été changé tous les trois jours.
- Astrocytes deviennent confluentes et 90% d'une monocouche après 7 jours. Astrocytes confluentes ont été traitées à la trypsine et 150 ul de re-suspension des astrocytes (1x10 6 / ml) ont été ré-étalées dans la zone de placage cellule du côté gauche de l'assemblée GPE lorsque les axones sont sur le point d'entrer ou venez d'entrer dans le côté gauche de l'assemblée MCP. Les astrocytes sont généralement plaquées 4-5 jours après que les neurones étaient plaqués. GDNF a été éliminée avant la première ré-plaquage des astrocytes dans le côté gauche de la MCP. Re-plaqué astrocytes ont été fixés dans le domaine de la conservation de cellules, comme le montre l'immunomarquage GFAP (Figure 1). Seulement un débit minimal de fluide entre les deux côtés des chambres (déterminée par fluorescence doui) a été trouvé dans le MCP, comme indiqué précédemment 4,6.
- Astrocytes deviennent confluentes et 90% d'une monocouche après 7 jours. Astrocytes confluentes ont été traitées à la trypsine et 150 ul de re-suspension des astrocytes (1 x 10 6 / ml) ont été ré-étalées dans la zone de placage cellule du côté gauche de l'assemblée GPE lorsque les axones sont sur le point d'entrer ou venez d'entrer dans la gauche côté de l'assemblée MCP. Les astrocytes sont généralement plaquées 4-5 jours après que les neurones étaient plaqués. GDNF a été éliminée avant la première ré-plaquage des astrocytes dans le côté gauche de la MCP. Re-plaqué astrocytes ont été fixés dans le domaine de la conservation de cellules, comme le montre l'immunomarquage GFAP (Figure 1). Seulement un débit minimal de fluide entre les deux côtés des chambres (déterminé par des colorants de fluorescence) a été trouvé dans le MCP, comme précédemment indiqué 4,6.
- Après le re-dépôt des astrocytes, les axones qui sont entrées dans la partie gauche de la MCP assemblé interagir directement avec le astrocytes par axonale soit un contact direct ou libération de facteurs solubles. Immunomarquage de la membrane plasmique GLT1 astrogliale glutamate transporteur et neuronale βIII-tubuline a été réalisée afin de visualiser l'interaction entre les axones et les astrocytes, comme le montre la figure 2D-F.
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Representative Results
L'analyse d'imagerie time-lapse de l'activation induite par axone promoteur GLT1 dans les astrocytes
Le neurone compartimenté et co-culture d'astrocytes système ne permet que les processus neuronaux, notamment des axones, d'interagir sélectivement avec les astrocytes. Suite à la mise en place réussie de l'axone et des astrocytes (cellules gliales ou d'autres) co-culture dans l'assemblée des MCP, différents types d'interactions axone-cellules gliales peuvent être étudiés, tels que: axone l'activation induite par l'activation du promoteur du gène astrogliale, guidage axonal des astrocytes induite par , axone induite par le Ca 2 + astrogliale réponse, et des axones induit la synthèse de la myéline dans les oligodendrocytes. Toutes ces applications profiter de la disponibilité de puissants rapporteurs fluorescents disponibles pour les cellules gliales ou des colorants chargés de ces cellules.
Nous décrivons ici axone induite par l'activation transcriptionnelle du promoteur du glutamate astrogliale transporteur 1 (GLT1) en utilisant bactériens artificiels chromocertains (BAC) GLT1 eGFP souris transgéniques et compartimentée ce système de co-culture. Chez les souris transgéniques BAC GLT1 eGFP, un journaliste eGFP fluorescence a été surexprimé sous le contrôle du promoteur GLT1 génomique 7. L'expression du rapporteur de l'EGFP est en corrélation avec l'expression des protéines endogènes GLT1 promoteur d'activation et l'activité fonctionnelle 7 permettant ainsi une évaluation de l'activité dans les astrocytes GLT1 promoteur unique in situ. Astrogliale expression GLT1 dépend fortement de la stimulation neuronale 6,8. Astrocytes primaires expriment des niveaux minimaux de GLT1, mais GLT1 niveaux d'expression (tant ARNm et protéine) sont fortement induites dans les astrocytes qui sont co-cultivés avec des neurones 9. La preuve est représenté ici par augmentation significative GLT1 immunoréactivité dans compartimentée système de co-culture (figure 3). Dans neurones et des astrocytes conventionnelle co-cultures, forte densité de neurones rendre moins idéale pour observer laeffet de axones neuronaux de l'activation transcriptionnelle de GLT1 promoteur.
À contrôler l'activation dépendante du promoteur axone GLT1, les neurones de type sauvage ont été cultivées dans la partie droite de l'assemblage et les axones MCP ont été induite suite à l'application de la GDNF sur le côté gauche de l'assemblage MCP. Astrocytes provenant des souris BAC eGFP GLT1 ont été cultivées dans la partie gauche de la MCP assemblé après que les axones ont été induite et vient d'entrer dans la partie gauche de la MCP assemblé. Un total de 6 jours (24 h à 140 h) time-lapse images ont été recueillies afin de contrôler la variation de l'intensité de fluorescence eGFP en temps réel et la croissance des axones dans le MCP. Comme le montre la figure 4A, très minimale expression fluorescence eGFP dans les astrocytes a été observée 24 heures après le plaquage des astrocytes. Augmentation significative de l'intensité eGFP a été observée 48 h après co-culture (de 24 h à 68 h) lorsque les axones sont bien dans le côté astrocytes et les interactionst directement en contact avec les astrocytes (figure 4 avant JC). D'autre part, l'intensité de fluorescence eGFP a été progressivement réduite une fois axones étaient rentrés et dégénéré par kaïnite (200 uM) induit la mort des cellules neuronales sur le neuronale (à droite) de l'assemblée MCP (figure 4D-F). Le changement dynamique de la EGFP intensité de fluorescence en réponse à des axones clairement démontré que l'activité du promoteur astroglial GLT1 est modulée par l'interaction axone.
Figure 1. Schéma d'un neurone microfluidique et des astrocytes co-culture plateforme. Plateforme microfluidique culture (MCP) a deux compartiments qui sont connectés via les canaux centraux. Cellules peut être plaqué de placage de la zone de cellule de chaque côté et axones neuronaux sont induits à partir de la zone de retenue de cellules et passent à travers les canaux centraux à enter de l'autre côté (insérer une barre d'échelle 50 pm).
Figure 2. Induction de l'axones neuronaux et l'interaction des axones avec des astrocytes dans MCP MCP. (A) à haute densité de neurones dans la zone de rétention cellulaire de l'assemblée MCP, révélée par immunomarquage βIII-tubuline. Barre d'échelle: 50 um (B) vue agrandie d'axones qui traversent les canaux centraux et entrant dans l'autre côté de la MCP. Barre d'échelle: 100 um (C) du cône de croissance Axon révélée par la coloration bIII-tubuline quand les axones entrer dans l'autre côté de la MCP. Barre d'échelle: 100 um (D) faisceaux Axon qui poussent à travers le canal central et entrez dans l'autre côté de la MCP. (E) Les astrocytes révélée par immunomarquage de la GLT1 sur le côté gliales du MCP. (F) l'image fusionnée affiche les contacts entre les axones et les astrocytes GLT1 positifs. Barre d'échelle: 50 um.
Figure 3. Neurone en fonction de l'induction de l'expression GLT1 dans les astrocytes primaires GLT1 immunoréactivité (A) des cultures primaires d'astrocytes, bar Echelle:. 50 pm (B) des cultures neuronales primaires, et (C) des neurones et des astrocytes primaires de co-cultures. Barre d'échelle: Les neurones sont représentés par immunocoloration des βIII-tubuline. Augmentation significative de l'immunoréactivité GLT1 a été observée dans des neurones et des astrocytes co-cultures.
Figure 4. Time-lapse images de l'axone induite GLT1 activation du promoteur de MCP avec astrocytes BAC eGFP GLT1 et les neurones de type sauvage. Changements dynamiques d'intensité eGFP et la croissance des axones ont été recueillies au moyen d'un 6d time-lapse enregistrement suivant placage astrocytes. (A) 24h (B) (C 48h) 68h (D) 92h (E) 112H (F) 140h. L'entrée d'unsignaux XON (mis en évidence par les flèches jaunes) dans le côté astrocytes a été observée à partir de 48h à 92h en corrélation avec une intensité accrue eGFP fluorescence. Diminution de l'intensité de fluorescence eGFP eu lieu de 112h à 140h après kaïnite (200 uM) a été appliquée sur le côté neuronale à 92h pour induire la mort des cellules neuronales et la dégénérescence axonale. Barre d'échelle: 50 um.
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Discussion
Le MCP neurone base et les astrocytes du système de co-culture de neurones permet dissection détaillée de astroglies voies de signalisation en n'autorisant que les axones passent les canaux centraux et interagissant avec les cellules astrocytaires. Ce système de co-culture peut être facilement mis en place avec des neurones classiques et des procédures de culture d'astrocytes. Nous avons également décrit une application pratique de ce système de co-culture en employant un journaliste eGFP base pour démontrer axone activation dépendante promoteur GLT1 dans les astrocytes.
Cette base de MCP neurones et astrocytes co-culture système offre plusieurs avantages par rapport aux classiques de co-culture méthodes: 1) la capacité de visualiser et d'identifier l'interaction explicite morphologique entre les axones et les astrocytes simples en temps réel sous microscopie à haute résolution 2) d'un puits contrôlé par micro-indépendante à appliquer pour la manipulation pharmacologique spécifique de la cellule d'effet 3) Analyse de l'activation de promoteuret l'expression des protéines exclusivement induite / régulée à la hausse dans les astrocytes qui sont modulés par le contact des axones. Comme les procédures de culture primaire de cellules microgliales 10 et oligodendrocytes 11 ont été bien établie, ce MCP système de co-culture peut également être appliquée à neurone à neurone à la microglie et les oligodendrocytes co-cultures. Pendant ce temps, nous reconnaissons également que ce système de co-culture est destinée à l'analyse d'image sensible au niveau de la cellule unique, qui est complémentaire aux approches classiques de l'analyse de grandes quantités de cellules, telles que l'ARN ou de l'analyse des protéines. En outre, notre système simplifie l'interaction considérable entre les neurones et les cellules gliales in vivo par l'interaction entre illustrant seule cellule et des axones. Toutes ces mesures doivent être pris en compte lors de l'interprétation des résultats de ce système de co-culture. Dans le SNC, les interactions entre les axones et les différentes cellules gliales sont largement présents et qui sont cruciaux pour les neurones etfonctions gliales 12,13. Le développement de ce système de co-culture permettra d'imagerie basée sur la dissection de ces interactions.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le Dr Jeffrey Rothstein de fournir BAC GLT1 souris eGFP et GLT1 anticorps; Tufts Center for Neuroscience Research (NIH P30 NS047243; PI, Rob Jackson) pour fournir des installations de base précieuses; New recrutement de professeurs de subvention (NIH P30-02 5P30NS069254 , PI, Phil Haydon) à Tufts Neuroscience Department.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 | for plating neuron for neuron cutlure medium |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F4135 | for astrocyte culture medium |
| Glial derived nerve factor | R&D Systems | 212-GD | Apply 10-20 ng/ml to neuron side of chamber |
| Dulbecco modified eagle medium high glucose | Sigma-Aldrich | 11995 | |
| 70 mm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Sterile glass bottom dish | MatTek Corporation | ||
| Microfluidic culture platforms | Xona Microfluidics LLC | SND150 | |
| 6 wells of the culture plate | Cellstar | 657 160 | |
Neuron culture medium
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| Neuron culture medium for plating cell
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| Astrocyte culture medium
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| Table 1. Materials used in the microfluidic culture platform-based neuronal axon and glia co-culture system. |
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References
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