Summary
Denne studien beskriver prosedyrene for å sette opp en ny neuronal axon og (astro) gliaceller co-kultur plattform. I dette samarbeidet kultur systemet, blir manipulering av direkte interaksjon mellom en enkelt axon (og eneste glial celle) gjennomførbart, slik mekanistisk analyse av gjensidig nervecelle til glial signalering.
Abstract
Riktig nervecelle til gliaceller interaksjon er kritisk til fysiologisk funksjon av sentralnervesystemet (CNS). Dette toveiskommunikasjon er sophisticatedly mediert av spesifikke signalveier mellom nevroner og gliaceller 1,2. Identifisering og karakterisering av disse signalveier er viktig for forståelsen av hvordan nervecelle til gliaceller interaksjon former CNS fysiologi. Tidligere har Nevron og gliaceller blandede kulturer blitt mye benyttet til testing og karakterisere signalveier mellom nevroner og gliaceller. Det vi har lært av disse preparatene og andre in vivo verktøy, har imidlertid antydet at gjensidige signalering mellom nevroner og gliaceller ofte skjedd i bestemte avdelinger innenfor nevroner (dvs. axon, dendrite eller soma) 3. Dette gjør det viktig å utvikle en ny kultur system som tillater separasjon av neuronal kamrene og spesielt undersøker samspillet mellom gliaceller og nevronale axons / dendritter. I tillegg er den konvensjonelle blandede kultur systemet ikke i stand til å differensiere de oppløselige faktorer og direkte membran kontakt signaler mellom nevroner og gliaceller. Videre mangler den store mengden av nevroner og gliaceller i konvensjonelle co-kultursystem oppløsningen nødvendig å observere samspillet mellom en enkelt axon og en glial celle.
I denne studien, beskriver vi en roman axon og gliaceller co-kultur-system med bruk av en microfluidic kultur plattform (MCP). I denne co-kultursystem, blir neuroner og gliaceller dyrket i to separate kamre som er forbundet via flere sentrale kanaler. I denne microfluidic kultur plattform, kan bare neuronal prosesser (spesielt axoner) inn i glial side gjennom de sentrale kanalene. I kombinasjon med kraftig fluorescerende protein merking, gjør dette systemet direkte undersøkelse av signalveier mellom aksonal / dendrittiske og glial interaksjoner, for eksempel ens axon-mediert transcriptional regulering i gliaceller, gliaceller-mediert reseptor menneskehandel neuronal terminaler, og gliaceller-mediert axon vekst. Den smale diameter av kammeret også forbyr signifikant flyten av neuron-anrikede medium til glial kammeret, tilrettelegging sondering av direkte membran-protein interaksjon mellom axoner / dendritter og glial overflater.
Protocol
1. Montering av Microfluidic Kultur Chamber (MCP)
- MCP (Figur 1) er åpne kamre utformet for compartmented kulturer av forskjellige typer celler 4. Den har typisk to avdelinger som er forbundet via de sentrale kanaler (3 mikrometer i diameter). Montering av MCP med glass-bunn retter er nødvendig for å forberede kulturer og påfølgende bildebehandling analyse.
- Først, frakk sterile glass-bunn retter med Polyornithine (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) oppløst i natrium tetraborat (Sigma-Aldrich, 10 mM pH 8,5), og ble inkubert over natten ved 37 ° C.
- På den følgende dag, ble de belagte glass-bunn retter vasket tre ganger med DDH 2 O og tørket under sterilt avtrekkshette. De glass-bunn retter var deretter ytterligere belagt med laminin (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) og tørket under UV lys i 1 time. Belagte retter er klar til bruk eller kan lagres ved -20 ° C inntil bruk. Disse belegg enre nødvendig for plating nevroner og astrocytes i co-kultur.
- Å montere kulturen plattformen ble microfluidic kultur plattformer plassert på toppen av de belagte glass-bunn retter med sentrale kobler kanaler på undersiden for å danne en tett forsegling. Regelmessig nevron eller astrocyte kultur medier ble tilsatt (fra cellen plating områder) på begge sider (fig. 1) inn i den sammensatte MCP og inkubert i 2-4 timer ved 37 ° C, for å sikre at det ikke er noen lekkasje mellom MCP og glass- bottomed parabolen. Vi har testet med medium før plating celler å sikre at det er ingen lekkasje. Monteringen av MCP på glassbunn parabolen bør være tilberedes før bruk.
2. Utarbeidelse av Neuronal Kultur og Induksjon av Neuronal Axoner i Assembled MCP
- Kortikale nevronale cellekulturer ble tilberedes fra embryonale 14-16 dager gammel mus hjerner. Neuron kulturmedium er sammensatt av neurobasal medium, 2% B27 neurobasal supplement, 2 mM glutamin ved tilsetning av 1% av 100x GlutaMAX, og 1% penicillin-streptomysin. Etter disseksjon av musen hjernen, ble hjernehinnene fjernet fra cortex under disseksjonsmikroskop. Vevet ble deretter oppdelt med et barberblad for å lage små vevsblokker for å øke arealet eksponert for trypsin. Vevsblokker ble trypsinert (Sigma-Aldrich, 0,05% Trypsin) i 10 min i en 37 ° C vannbad, og deretter dissosiert forsiktig ved triturering med en brann-polert Pasteur pipette. Dissosieres celler ble filtrert gjennom et 70 um sil å samle klare neuronal cellesuspensjonen.
- Nevroner (2-3 x 10 6 / ml, 150 ul) ble platet på cellen plating områdene på høyre side (fig. 1) av det sammensatte MCP slik at nevroner kan legge på cellen retention området (figur 1). Nylagde nevroner ble platet med neuron Plating medium som er supplert med 5% føtalt bovint serum (Hyclone) inn i regular neuron kultur medium. Fordi bare de nevroner som fester i cellen retention området er i stand til å vokse axoner inn den andre siden av den monterte MCP gjennom sentrale kanaler, er det viktig å plate høy tetthet av nevroner i cellen Plating området for å sikre nok nevroner festet til celle oppbevaring området. Et representativt bilde av høy tetthet av neuronmembraner axoner er vist i figur 2A.
- På den påfølgende dagen, ble den nervecellen plating medium erstattet av den vanlige neuron kultur medium. Endre medium ble oppnådd ved forsiktig aspirere mediet fra cellen Plating område av kammeret, men ikke fra cellen oppbevaring området av den monterte MCP, for å unngå luftbobler i cellen oppbevaring området og de sentrale kobler kanalene. Luftbobler vil sterkt hemme axon utvekst og påfølgende inntreden i de sentrale kanaler i MCP. Glial-celle avledet neurotrop faktor (GDNF, 10-20 ng / ml) ble også tilsatt på den andre (venstre) sideav kammeret på den samme dag for å lette induksjon av axon utvekst 5 fra neuronal side og tvers gjennom sentrale kanaler av monterte MCP (figur 2A). God del av spontan neurite utvekst uten GDNF er også observert fra neuronal side og tvers gjennom sentrale kanaler i samlet MCP. Axoner som inngår i den sentrale kanalen er ofte observert 2-3 dager etter plating. Når axons inngå sentralkanalen, de vanligvis inn den andre side innen en dag. Axons er normalt intakt i minst en uke etter inn den andre siden.
3. Tilsetting av Cultured Astrocytes til MCP å opprette en compartmentalized Co-kultur System
Primære astrocyte kulturer ble forberedt fra P1-3 mus valp hjernen. Hjernen dissosiasjon prosedyren er lik den nevronale celleisolasjon prosedyre beskrevet ovenfor. Astrocytes ble først belagt i 10 cm tallerken som ble pre-Belagt med Polyornithine (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml). Den astrocyte kultur medium (DMEM, 10% føtalt bovint serum, 1% Penicillin-streptomysin) ble endret hver dag for de neste to dagene til å fjerne rusk. Etter det, ble mediet forandret hver tredje dag.
- Astrocytes blir 90% sammenflytende og danne et monosjikt etter 7 dager. Konfluente astrocytes ble trypsinert og 150 pl resuspenderes astrocytes (1x10 6 / ml) ble re-platet i cellen Plating området i venstre side av den monterte MCP når axons er i ferd med å gå inn i eller har akkurat kommet inn i den venstre side av den sammensatte MCP. Astrocytes ble vanligvis belagt 4-5 dager etter at nevronene var belagt. GDNF ble først fjernet før re-plating av astrocytes inn i venstre side av MCP. Re-belagt astrocytes ble festet i cellen oppbevaring, som vist ved GFAP farging (figur 1). Bare minimal strømning av medium mellom begge sider av kamrene (bestemt ved fluorescens dja) ble funnet i MCP, som tidligere vist 4,6.
- Astrocytes blir 90% sammenflytende og danne et monosjikt etter 7 dager. Konfluente astrocytes ble trypsinert og 150 pl av resuspendert astrocytes (1 x 10 6 / ml) ble re-platet i cellen Plating området i venstre side av den monterte MCP når axons er i ferd med å gå inn i eller har nettopp inngått venstre side av den sammensatte MCP. Astrocytes ble vanligvis belagt 4-5 dager etter at nevronene var belagt. GDNF ble først fjernet før re-plating av astrocytes inn i venstre side av MCP. Re-belagt astrocytes ble festet i cellen oppbevaring, som vist ved GFAP farging (figur 1). Bare minimal strømning av medium mellom begge sider av kamrene (bestemt ved fluorescens fargestoffer) ble funnet i MCP, som tidligere vist 4,6.
- Etter re-plating av astrocytes, axoner som kom inn i venstre side av den sammensatte MCP direkte samhandler med astrocytes ved enten direkte aksonal kontakt eller frigjøring av løselige faktorer. Farging av astroglial plasmamembranen glutamat transportør GLT1 og neuronal βIII-tubulin ble utført for å visualisere samspillet mellom axoner og astrocytes, som vist i Figur 2D-F.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Time-lapse avbildning analyse av axon-indusert GLT1 promoter aktivering i astrocytes
Den compartmented nevron og astrocyte co-kultur systemet tillater bare neuronal prosesser, spesielt aksoner, til selektivt samhandle med astrocytes. Etter den vellykkede etableringen av axon og astrocyte (eller andre gliacellene) co-kultur i det sammensatte MCP, kan ulike typer axon-gliaceller interaksjoner bli studert som; axon-indusert aktivering av astroglial genpromotoren aktivisering, astrocyte-indusert axon veiledning , axon-indusert astroglial Ca 2 + respons, og axon-indusert myelin syntese i oligodendrocytes. Alle disse programmene dra nytte av tilgjengeligheten av kraftige fluorescerende reportere tilgjengelig for gliacellene eller fargestoffer lastet til disse cellene.
Her beskriver vi axon-indusert transcriptional aktivering av astroglial glutamat transporter 1 (GLT1) promoter ved hjelp bakteriell kunstig chromonoen (BAC) GLT1 eGFP transgene mus og denne compartmentalized co-kultur-systemet. I BAC GLT1 eGFP transgene mus, ble en eGFP fluorescens reporter overexpressed under kontroll av den GLT1 genomiske promotoren 7. Uttrykk for eGFP reporter korrelerer med endogen GLT1 promoter aktivering protein uttrykk og funksjonell aktivitet 7 og dermed tillater en vurdering av GLT1 promoter aktivitet i enkle astrocytes in situ. Astroglial GLT1 uttrykk er svært avhengig neuronal stimulering 6,8. Primære astrocytes uttrykke minimum av GLT1, men er GLT1 uttrykk nivåer (både mRNA og protein) sterkt indusert i astrocytes som er co-kultivert med nevroner 9. Bevisene er her vist ved betydelig økt GLT1 immunoreaktivitet i compartmentalized co-kultur system (figur 3). I konvensjonell nevron og astrocyte co-kulturer, høy tetthet av nevroner gjør det mindre ideell for å observereEffekten av nevrale axoner på transcriptional aktivering av GLT1 promoter.
Å overvåke axon-avhengige GLT1 promotor aktivisering, villtype nevronene ble dyrket i den høyre side av den monterte MCP og axons ble indusert etter anvendelsen av GDNF på venstre side av den sammensatte MCP. Astrocytes utledet fra BAC GLT1 eGFP mus ble dyrket i den venstre side av den monterte MCP etter axons har blitt indusert og bare skrives inn i den venstre side av den sammensatte MCP. Totalt 6 dager (24 timer til 140 timer) time-lapse bilder ble samlet for å overvåke eGFP fluorescensintensiteten endring i sanntid og axon vekst i MCP. Som vist i figur 4A, ble svært minimum eGFP fluorescens uttrykk i astrocytes observert 24 hr etter plettering av de astrocytes. Betydelig økning av eGFP intensitet ble observert 48 timer etter co-kultur (fra 24 timer til 68 timer) når axons er godt inn i astrocyte side og samspillt direkte kontakt med astrocytes (Figur 4 f.Kr.). På den annen side, ble eGFP fluorescensintensitet gradvis redusert gang axoner ble tilbaketrukket og degenerert ved kainitt (200 uM) indusert neuronal celledød på neuronenes (høyre) side av den sammensatte MCP (figur 4D-F). Den dynamiske endring av eGFP fluorescensintensitet i respons til axons tydelig vist at astroglial GLT1 promotor aktivitet er modulert av axon interaksjon.
Figur 1. Skisse av microfluidic nevron og astrocyte co-kultur plattform. Microfluidic kultur plattform (MCP) har to rom som er koblet via sentrale kanaler. Celler kan bli belagt fra cellen plating område på hver side og neuronal axoner induseres fra cellen oppbevaring området og passerer gjennom de sentrale kanaler til enteh den andre siden (sett skala bar 50 mikrometer).
Figur 2. Induksjon av nevrale axoner og samhandling av axoner med astrocyte i MCP MCP. (A) Høy tetthet av nevroner i cellen oppbevaring område av samlet MCP, avslørt av βIII-tubulin farging. Målestokk: 50 mikrometer (B) forstørret bilde av axoner krysser de sentrale kanaler og inn i den andre siden av MCP. Målestokk: 100 pm (C) Axon vekst kjegle avslørt av BIII-tubulin farging når axoner inngå den andre siden av MCP. Målestokk: 100 pm (D) Axon bunter som vokser gjennom den sentrale kanal og inn i den andre siden av MCP. (E) Astrocytes åpenbart av GLT1 farging i glial side av MCP. (F) sammenslåtte bildet viser kontakt mellom axoner og GLT1 positive astrocytes. Målestokk: 50 mikrometer.
Figur 3. Neuron-avhengige induksjon av GLT1 uttrykk i grunnskolen astrocytes GLT1 immunoreaktivitet i (A) primære astrocyte kulturer, Scale bar:. 50 mikrometer (B) primære neuronal kulturer, og (C) primær neuron og astrocyte co-kulturer. Målestokk: Neurons er vist ved farging av βIII-tubulin. Betydelig økning av GLT1 immunoreaktivitet ble observert i nevroner og astrocyte co-kulturer.
Figur 4. Time-lapse bilder av axon-indusert GLT1 promoter aktivering i MCP med BAC GLT1 eGFP astrocytes og villtype nevroner. Dynamiske endringer av eGFP intensitet og veksten av axoner ble samlet gjennom en 6d time-lapse opptak etter astrocyte platekledning. (A) åpen 24 (B) 48h (C) 68h (D) 92h (E) 112h (F) 140H. Oppføring av enXON-signaler (markert med gule piler) inn i astrocyte side ble observert fra 48t til 92h som samvarierer med økt eGFP fluorescens intensitet. Nedgang på eGFP fluorescensintensitet skjedd fra 112h til 140H etter kainitt (200 mikrometer) ble brukt på neuronal side på 92h å indusere neuronal celle død og axon degenerasjon. Målestokk: 50 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MCP baserte neuron og astrocytes co-kultur systemet tillater disseksjon av detaljert nervecelle til astroglia signalveier ved at bare axons passere de sentrale kanalene og samspill med astroglial celler. Dette samarbeidet kultur systemet kan enkelt settes opp med konvensjonell nevron og astrocyte kultur prosedyrer. Vi har også beskrevet en praktisk anvendelse av dette samarbeidet kultur systemet ved å bruke en eGFP basert reporter for å demonstrere axon-avhengige GLT1 promoter aktivering i astrocytes.
Dette MCP baserte nevroner og astroglia co-kultur-systemet tilbyr flere fordeler i forhold til konvensjonelle co-kultur metoder: 1) evne til å visualisere og identifisere eksplisitt morfologiske samspillet mellom enkelt axoner og astrocytes i sanntid under høyt oppløsning mikroskopi 2) et godt -styrt uavhengig mikromiljøet til søke farmakologisk manipulasjon for celle-spesifikk effekt 3) analyse av promotor aktiviseringog protein uttrykk utelukkende indusert / oppregulert i astrocytes som er modulert av axoner kontakt. Som kultur prosedyrer for primær microglia 10 og oligodendrocytes 11 har blitt godt etablert, kan dette MCP co-kultur systemet også brukes til nervecelle til microglia og nervecelle til oligodendrocyte co-kulturer. Mellomtiden vi også innse at denne co-kulturen systemet er ment for den sensitive bildeanalyse på enkelt celle-nivå, som er komplementær til de konvensjonelle tilnærminger analysere stor mengde celler, for eksempel RNA eller protein analyse. I tillegg forenkler systemet vårt enorme samspillet mellom nevroner og gliaceller in vivo ved eksemplifiserer samspillet mellom enkelt celle og axon. Alle disse bør vurderes når man tolker resultatene fra dette samarbeidet kultur systemet. I CNS, interaksjoner mellom axoner og ulike gliaceller er allment stede og er kritisk viktig for både nevroner ogglial funksjoner 12,13. Utvikling av dette samarbeidet kultur system vil tillate avbildning-baserte disseksjon av disse interaksjonene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke dr. Jeffrey Rothstein for å gi BAC GLT1 eGFP mus og GLT1 antistoff, Tufts Center for Neuroscience Research (NIH P30 NS047243, PI, Rob Jackson) for å gi verdifulle kjernefasiliteter, New fakultet rekruttering tilskuddet (NIH P30 5P30NS069254-02 , PI, Phil Haydon) i Tufts Neuroscience avdeling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 | for plating neuron for neuron cutlure medium |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F4135 | for astrocyte culture medium |
| Glial derived nerve factor | R&D Systems | 212-GD | Apply 10-20 ng/ml to neuron side of chamber |
| Dulbecco modified eagle medium high glucose | Sigma-Aldrich | 11995 | |
| 70 mm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Sterile glass bottom dish | MatTek Corporation | ||
| Microfluidic culture platforms | Xona Microfluidics LLC | SND150 | |
| 6 wells of the culture plate | Cellstar | 657 160 | |
Neuron culture medium
|
|||
| Neuron culture medium for plating cell
|
|||
| Astrocyte culture medium
|
|||
| Table 1. Materials used in the microfluidic culture platform-based neuronal axon and glia co-culture system. |
|||
References
- Stevens, B. Neuron-astrocyte signaling in the development and plasticity of neural circuits. Neuro-Signals. 16, 278-288 (2008).
- Paixao, S., Klein, R. Neuron-astrocyte communication and synaptic plasticity. Current opinion in neurobiology. 20, 466-473 (2010).
- Fields, R. D., Stevens-Graham, B. New insights into neuron-glia communication. Science. 298, 556-562 (2002).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature. 1, 2128-2136 (2006).
- Wang, C. Y. Regulation of neuromuscular synapse development by glial cell line-derived neurotrophic factor and neurturin. The Journal of biological chemistry. 277, 10614-10625 (2002).
- Yang, Y. Presynaptic regulation of astroglial excitatory neurotransmitter transporter GLT1. Neuron. 61, 880-894 (2009).
- Regan, M. R. Variations in promoter activity reveal a differential expression and physiology of glutamate transporters by glia in the developing and mature CNS. The Journal of neuroscience. 27, 6607-6619 (2007).
- Swanson, R. A. Neuronal regulation of glutamate transporter subtype expression in astrocytes. The Journal of neuroscience. 17, 932-940 (1997).
- Schlag, B. D. Regulation of the glial Na+-dependent glutamate transporters by cyclic AMP analogs and neurons. Molecular pharmacology. 53, 355-369 (1998).
- Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state. Journal of immunological. 300, 32-46 (2005).
- Espinosa-Jeffrey, A., Wakeman, D. R., Kim, S. U., Snyder, E. Y., de Vellis, J. Culture system for rodent and human oligodendrocyte specification, lineage progression, and maturation. Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, (2009).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, 430-440 (2008).
- Debanne, D., Rama, S. Astrocytes shape axonal signaling. Science signaling. 4, pe11 (2011).
