Summary
Данное исследование описывает процедуры создания новых нейронных аксонов и (ASTRO) глии совместного культивирования платформы. В этой совместной системе культуры, манипуляции прямого взаимодействия между одним аксона (и единственной глиальных клеток) становится возможным, позволяя механистического анализа взаимного нейрона к глиальных сигнализации.
Abstract
Правильное нейрона к глии взаимодействие имеет решающее значение для физиологических функций центральной нервной системы (ЦНС). Это двусторонняя связь изощренно опосредовано конкретных сигнальных путей между нейроном и глии 1,2. Идентификация и характеристика этих сигнальных путей имеет важное значение для понимания того, как нейрон глия взаимодействия физиологии ЦНС формы. Ранее нейронов и глии смешанных культур были широко использованы для тестирования и характеризующие сигнальные пути между нейроном и глии. То, что мы узнали из этих препаратов и других инструментов в естественных условиях, однако, предположил, что взаимное сигнализации между нейроном и глии часто происходило в конкретных отделений в нейронах (т.е., аксон, дендритов, или сома) 3. Это делает его важным для разработки новой системы культуры, которые позволяют разделение отсеков нейронов и, в частности исследует взаимодействие между глии и нейровнутренней аксоны / дендритов. Кроме того, обычные смешанной системе культуры не способны дифференцироваться растворимых факторов и прямой контакт мембраны сигналы между нейроном и глии. Кроме того, большое количество нейронов и глиальных клеток в обычных совместного культивирования системе отсутствует разрешение, необходимое для наблюдения за взаимодействием между одним аксонов и глиальных клеток.
В этой работе мы описываем новую аксонов и глии совместного культивирования системы с использованием платформы микрофлюидных культуре (MCP). В этой совместного культивирования системы, нейроны и глиальные клетки культивируют в двух отдельных камер, которые подключены через несколько центральных каналов. В этом микрофлюидных платформе культуры, только нейронных процессов (особенно аксоны) может войти в глиальных стороне через центральные каналы. В сочетании с мощной флуоресцентной маркировки белков, эта система позволяет непосредственного изучения сигнальных путей между аксональной / дендритные и глиальные взаимодействия, такие,с аксон-опосредованной регуляции транскрипции в глии, глия-опосредованной рецепторами нейронов торговли терминалы, и глии-опосредованного роста аксонов. Узкого диаметра камеры также значительно запрещает поток нейронов обогащенной среды в глиальных камеры, облегчая зондирования прямого мембранного белка взаимодействия между аксонами / дендритов и глиальных поверхности.
Protocol
1. Собрание Микрофлюидных палата культуры (MCP)
- MCP (рис. 1) открытые камеры предназначены для отсеки культур разных типов клеток 4. Она обычно состоит из двух отсеков, которые подключены через центральные каналы (3 мкм в диаметре). Собрания MCP со стеклянным дном блюда необходимо для подготовки культур и последующего анализа изображений.
- Во-первых, слой стерильной стеклянным дном блюда с полиорнитином (Sigma-Aldrich, 1 мг / мл), растворенных в тетрабората натрия (Sigma-Aldrich, 10 мМ рН 8,5) и инкубировали в течение ночи при 37 ° C.
- На следующий день, покрытый стеклянным дном блюда промывают три раза DDH 2 O и сушат в стерильном вытяжном шкафу. Стеклянным дном блюда были затем дополнительно покрыты ламинин (Sigma-Aldrich, 1 мг / мл) и сушат под УФ-светом в течение 1 часа. Покрытые блюда готовые к использованию или может храниться при температуре от -20 ° C до использования. Эти покрытияповторно необходимый для покрытия нейронов и астроцитов в совместной культуре.
- Чтобы собрать культуры платформы, платформы микрофлюидных культуры были размещены на верхней части стекла с покрытием дном блюда с центральным подключением каналов на его нижней стороне, чтобы сформировать уплотнение. Регулярные нейронов или астроцитов средах культуры были добавлены (из районов ячейки покрытия) с обеих сторон (рис. 1) в собранном MCP и выдерживают в течение 2-4 часов при температуре 37 ° C, чтобы убедиться в отсутствии утечки между МКП и стекло дном блюдо. Мы протестировали со средним перед покрытием клетки убедиться в отсутствии утечки. Сборка MCP на стеклянным дном блюдо должно быть свежеприготовленным перед использованием.
2. Подготовка нейронов культуры и индукция аксонов в собранном MCP
- Кортикальных нейронов, клеточные культуры были недавно получены из эмбриональных 14-16 дневных мозга мыши. Средой нейрона культуры состоит из Neurobasal среду, 2% B27 neurobasaл добавки, 2 мМ глутамина путем добавления 1% 100x Glutamax, и 1% пенициллин-streptomysin. После вскрытия мозга мыши, мозговых оболочек была удалена из коры под рассекает микроскопом. Затем ткань фарш с лезвием для создания небольших блоков ткани для того, чтобы увеличить площадь поверхности воздействию трипсина. Ткань блоков трипсинизировали (Sigma-Aldrich, 0,05% трипсина) в течение 10 мин при 37 ° С водяной бане, а затем диссоциированных мягко растиранием с огневой полировкой пипетки Пастера. Диссоциированных клеток фильтруют через 70 мкм фильтр для сбора ясно нейронной клеточной суспензии.
- Нейроны (2-3 х 10 6 / мл, 150 мкл) помещают в клетку покрытие области на правой стороне (рис. 1) собранных MCP, так что нейроны можно прикрепить в области сохранения ячейки (рис. 1). Свежеприготовленный нейроны были покрыты нейрона покрытие среда, которая с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки (Hyclone) в регуляцииГ нейрона культуральной среде. Потому что только нейроны, которые прикрепляются в области сохранения клетки способны к росту аксонов в другую сторону собравшихся MCP через центральные каналы, важно, чтобы плиты высокой плотности нейронов в области покрытия ячейки для обеспечения достаточного количества нейронов, ассоциируются с ячейку сохранения области. Представитель изображений высокой плотности аксонов показано на рисунке 2А.
- На следующий день, среда нейрона покрытие было заменено регулярной культуральной среде нейронов. Изменение среды осуществляется путем тщательно аспирационных среду из зоны покрытия ячейки в камере, но не из области ячейки сохранения собранного MCP, для того, чтобы избежать образования воздушных пузырей в области ячейки хранения и центральных соединительных каналов. Пузырьки воздуха будет сильно повлиять на результат аксонов и последующее вступление в центральных каналов в MCP. Глиальных клеток нейротрофический фактор (GDNF, 10-20 нг / мл) был добавлен на другой (левой) сторонев камере в тот же день для облегчения индукции аксона результатом 5 из нейронных стороны и крест через центральные каналы собранных MCP (рис. 2A). Изрядное количество спонтанных вырост нейритов без GDNF наблюдается также от нейронов стороны и крест через центральные каналы собранных MCP. Аксоны, которые входят в центральный канал часто наблюдаются 2-3 дней после посева. Как только аксоны входят в центральный канал, они обычно вступают в другую сторону в течение одного дня. Аксоны обычно нетронутым в течение не менее одной недели после вступления в другую сторону.
3. Добавление Искусственный астроциты с MCP, чтобы установить разобщенным Co-культуре системы
Первичный астроцитов культур были получены из P1-3 мыши щенка мозга. Процедура мозга диссоциации похож на нейронную процедуры изоляторе описанных выше. Астроциты были впервые высевали в 10 см блюдо, которые были предварительноПокрытие с полиорнитином (Sigma-Aldrich, 1 мг / мл). Астроцитов культуральной среде (DMEM, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% пенициллин-streptomysin) был изменен каждый день в течение следующих двух дней, чтобы удалить мусор. После этого в среду меняли каждые три дня.
- Астроциты стать 90% вырожденная и формирования монослоя через 7 дней. Confluent астроциты трипсинизировали и 150 мкл повторно приостановил астроциты (1х10 6 / мл) были повторно высевали в области ячейки обшивки левой части собраны MCP, когда аксоны собираются вводить или только вступили в левой части собранном MCP. Астроциты, как правило, покрыты 4-5 дней после того, как нейроны были покрытием. GDNF впервые был удален перед повторным покрытием из астроцитов в левую сторону MCP. Re покрытием астроциты были прикреплены в области сохранения ячейки, как показано на иммуноокрашивания GFAP (рис. 1). Только минимальным потоком среды между обеими сторонами камер (определяется флуоресценции Dда) было найдено в MCP, как было показано ранее 4,6.
- Астроциты стать 90% вырожденная и формирования монослоя через 7 дней. Confluent астроциты трипсинизировали и 150 мкл повторно приостановил астроциты (1 х 10 6 / мл) были повторно высевали в области ячейки обшивки левой части собраны MCP, когда аксоны собираются вводить или только что вошли в левую стороны собрались MCP. Астроциты, как правило, покрыты 4-5 дней после того, как нейроны были покрытием. GDNF впервые был удален перед повторным покрытием из астроцитов в левую сторону MCP. Re покрытием астроциты были прикреплены в области сохранения ячейки, как показано на иммуноокрашивания GFAP (рис. 1). Только минимальным потоком среды между обеими сторонами камер (определяется флуоресценции красителей) был найден в MCP, как было показано ранее 4,6.
- После повторного покрытия на астроциты, аксоны, которые вошли в левой части собраны MCP непосредственно взаимодействовать с астрономическийocytes либо прямого контакта аксональной или высвобождение растворимых факторов. Иммуноокрашивание астроглиальных плазматической мембраны глутамата GLT1 транспортер и нейронных βIII-тубулина был выполнен для визуализации взаимодействия между аксонами и астроциты, как показано на рисунке 2D-F.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Время изображений в заданный промежуток анализ Аксон-индуцированной GLT1 промоутер активации астроцитов
Отсеки нейронов и астроцитов совместного культивирования система позволяет только нейронных процессов, особенно аксоны, чтобы избирательно взаимодействовать с астроцитов. После успешного создания аксон и астроцитов (или других клеток глии) совместного культивирования в собранном MCP, различные типы Аксон-глии взаимодействия могут быть изучены, такие как: Аксон-индуцированной активации астроглиального активации промотора гена, астроцитов вызванных аксона руководства , аксон-индуцированной астроглиального Ca 2 + ответ, и аксон-индуцированный синтез миелина в олигодендроциты. Все эти приложения используют преимущества наличия мощного флуоресцентные журналистам доступны для глиальных клеток или красители загружаются в этих клетках.
Здесь мы опишем Аксон-индуцированной активации транскрипции астроглиальных промоутера транспортера глутамата 1 (GLT1) с помощью бактериальной искусственной хромосомынекоторые (BAC) GLT1 УЗФБ трансгенных мышей, и это разобщенным совместного культивирования системы. В BAC GLT1 УЗФБ трансгенных мышей, репортер УЗФБ флуоресценции экспрессия под контролем промотора GLT1 геномной 7. Выражение репортер УЗФБ коррелирует с эндогенными GLT1 промоутер активации экспрессии белка и функциональной деятельности 7 позволяя таким образом оценку GLT1 активность промотора в одном астроциты на месте. Астроглиального выражение GLT1 сильно зависит от стимуляции нейронов 6,8. Первичный астроциты выразить минимального уровня GLT1, однако, GLT1 уровни экспрессии (как мРНК и белка) сильно индуцируется в астроциты, которые совместно культивировали с нейронами 9. Свидетельство показано здесь значительно увеличилось GLT1 иммунореактивности в обособленных совместного культивирования системы (рис. 3). В обычных нейронов и астроцитов совместно культур, высокая плотность нейронов сделать его менее идеальными для наблюденияЭффект аксонов на транскрипционной активации GLT1 промоутер.
Для контроля аксон-зависимых GLT1 промоутер активации, дикий тип нейронов культивировали в правой части собраны MCP и аксоны были индуцированные после применения GDNF на левой стороне собрались MCP. Астроциты, полученные от BAC GLT1 мышей УЗФБ культивировали в левой части собраны MCP после аксоны были вызваны и только что вступил в левой части собраны MCP. В общей сложности за 6 дней (24 часов до 140 часов) покадровой изображения были собраны для мониторинга УЗФБ изменения интенсивности флуоресценции в реальном времени и аксон роста в MCP. Как показано на рисунке 4A, очень минимальное выражение УЗФБ флуоресценции в астроциты наблюдалось 24 часа после нанесения покрытия из астроцитов. Значительное увеличение интенсивности УЗФБ наблюдалось 48 часов после совместного культивирования (с 24 часов до 68 часов), когда аксоны хорошо в астроциты стороне и взаимодействият, непосредственно контактирующих с астроциты (рис. 4 г. до н.э.). С другой стороны, УЗФБ интенсивности флуоресценции постепенно уменьшалась раз аксонов убирались и выродились по каинит (200 мкм), индуцированные гибель нейронов в нейронной (правой) стороне собрались MCP (рис. 4D-F). Динамическое изменение УЗФБ интенсивности флуоресценции в ответ на аксоны наглядно продемонстрировал, что астроглиального GLT1 активность промотора модулируется аксона взаимодействия.
Рисунок 1. Принципиальная схема микрофлюидных нейронов и астроцитов совместного культивирования платформы. Микрофлюидных платформе культуры (MCP) имеет два отсека, которые подключены через центральные каналы. Клетки могут быть покрыты из зоны покрытия клетки с каждой стороны и аксоны нейронов вызываются из района ячейки хранения и проходят через центральные каналы для ЛОРER другой стороне (вставить шкалы 50 мкм).
Рисунок 2. Индукция аксонов и взаимодействия аксонов с астроцитов в MCP MCP. (A) Высокая плотность нейронов в области ячейки сохранения собранного MCP, выявленных βIII-тубулина иммуноокрашивания. Шкала бар: 50 мкм (B) Увеличенный вид аксонов пересечении центральных каналов и вступления в другую сторону MCP. Шкала бар: 100 мкм (C) Axon конуса роста выявленных BIII-тубулина окрашивания, когда аксоны войти в другую сторону MCP. Шкала бар: 100 мкм (D) Axon пучки, которые растут по центральному каналу и войти в другую сторону MCP. (E) астроциты, выявленных GLT1 иммуноокрашивания в глиальных стороны MCP. (F) объединенного изображения отображаются контакты между аксонами и GLT1 положительные астроцитов. Шкала бар: 50 мкм.
Рисунок 3. Нейрон-зависимой индукции GLT1 выражение в первичных астроцитах GLT1 иммунореактивности (А) первичные культуры астроцитов, масштабная линейка. 50 мкм (б) первичной нейронов культур, и (C) первичных нейронов и астроцитов совместно культур. Шкала бар: Нейроны показаны иммунной из βIII-тубулина. Значительное увеличение GLT1 иммунореактивности наблюдается в нейрон и астроцитов совместно культур.
Рисунок 4. Покадровый изображений аксон-индуцированной GLT1 промоутер активации в MCP с BAC GLT1 астроциты УЗФБ и диких нейронов типа. Динамическое изменение интенсивности УЗФБ и рост аксонов были собраны через 6d записи со сжатием времени после астроцитов покрытия. (А) 24 часа (B) 48 (C) 68h (D) 92h (E) 112H (F) 140h. ВступлениеXons (выделено желтые стрелки) в астроциты стороне наблюдалось с 48 часов до 92h, которые коррелируют с повышенным УЗФБ интенсивности флуоресценции. Снижение интенсивности флуоресценции УЗФБ произошло от 112H до 140h после каинит (200 мкМ) была применена на нейронную стороны на 92h, чтобы вызвать гибель нейронов и аксонов дегенерации. Шкала бар: 50 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MCP на основе нейронов и астроцитов совместного культивирования система позволяет рассечение подробную нейрона к астроглии сигнальных путей, позволяя только аксоны проходят центральные каналы и взаимодействия с астроглиальных клеток. Это сотрудничество культура система может быть легко создана с обычными нейронов и астроцитов процедур культуры. Мы также описано практическое применение этого совместного культивирования системы, используя УЗФБ журналистом, для демонстрации Аксон-зависимых GLT1 промоутер активации астроцитов.
Это MCP на основе нейронных и астроглии совместного культивирования система имеет ряд преимуществ по сравнению с обычными совместного культивирования методов: 1) способность визуализировать и определить явного морфологического взаимодействия между отдельными аксонов и астроцитов в режиме реального времени при микроскопии высокого разрешения 2) и контролируемых независимыми микроокружения применять фармакологические манипуляции для сотовых конкретного эффекта 3) анализ промоутер активациии экспрессии белка исключительно индуцированные / UP-регулируется в астроциты, которые модулируются при контакте аксонов. В культуре процедуры первичного микроглии 10 и олигодендроциты 11 из них были хорошо разработаны, это MCP совместного культивирования система может быть также применен к нейрона к нейрону микроглии и в олигодендроцитов со-культуры. Между тем, мы также признаем, что это сотрудничество культуру Система предназначена для чувствительной анализа изображений на одном уровне клетки, которая является дополнением к традиционным подходам анализа большого количества клеток, таких как РНК или белка анализа. Кроме того, наша система упрощает взаимодействие между огромными нейронов и глиальных клеток в естественных условиях на иллюстрирующие взаимодействие между одной клетки и аксон. Все это следует учитывать при интерпретации результатов этого сотрудничества системе культуры. В центральной нервной системе, взаимодействия между аксонов и глиальных клетках различных широко представлены и имеют критически важное значение для обоих нейронов иглиальных функции 12,13. Развитие этого сотрудничества культура система позволит изображений на основе вскрытия этих взаимодействий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить д-р Джеффри Ротштейн для обеспечения BAC GLT1 УЗФБ мышей и GLT1 антитела; Тафтса Центр Neuroscience Research (NIH P30 NS047243, PI, Rob Jackson) за ценные объекты ядра; Новый факультет набора гранта (NIH P30 5P30NS069254-02 , PI, Фил Хей) в Тафтса Neuroscience департамента.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 | for plating neuron for neuron cutlure medium |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F4135 | for astrocyte culture medium |
| Glial derived nerve factor | R&D Systems | 212-GD | Apply 10-20 ng/ml to neuron side of chamber |
| Dulbecco modified eagle medium high glucose | Sigma-Aldrich | 11995 | |
| 70 mm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Sterile glass bottom dish | MatTek Corporation | ||
| Microfluidic culture platforms | Xona Microfluidics LLC | SND150 | |
| 6 wells of the culture plate | Cellstar | 657 160 | |
Neuron culture medium
|
|||
| Neuron culture medium for plating cell
|
|||
| Astrocyte culture medium
|
|||
| Table 1. Materials used in the microfluidic culture platform-based neuronal axon and glia co-culture system. |
|||
References
- Stevens, B. Neuron-astrocyte signaling in the development and plasticity of neural circuits. Neuro-Signals. 16, 278-288 (2008).
- Paixao, S., Klein, R. Neuron-astrocyte communication and synaptic plasticity. Current opinion in neurobiology. 20, 466-473 (2010).
- Fields, R. D., Stevens-Graham, B. New insights into neuron-glia communication. Science. 298, 556-562 (2002).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature. 1, 2128-2136 (2006).
- Wang, C. Y. Regulation of neuromuscular synapse development by glial cell line-derived neurotrophic factor and neurturin. The Journal of biological chemistry. 277, 10614-10625 (2002).
- Yang, Y. Presynaptic regulation of astroglial excitatory neurotransmitter transporter GLT1. Neuron. 61, 880-894 (2009).
- Regan, M. R. Variations in promoter activity reveal a differential expression and physiology of glutamate transporters by glia in the developing and mature CNS. The Journal of neuroscience. 27, 6607-6619 (2007).
- Swanson, R. A. Neuronal regulation of glutamate transporter subtype expression in astrocytes. The Journal of neuroscience. 17, 932-940 (1997).
- Schlag, B. D. Regulation of the glial Na+-dependent glutamate transporters by cyclic AMP analogs and neurons. Molecular pharmacology. 53, 355-369 (1998).
- Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state. Journal of immunological. 300, 32-46 (2005).
- Espinosa-Jeffrey, A., Wakeman, D. R., Kim, S. U., Snyder, E. Y., de Vellis, J. Culture system for rodent and human oligodendrocyte specification, lineage progression, and maturation. Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, (2009).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, 430-440 (2008).
- Debanne, D., Rama, S. Astrocytes shape axonal signaling. Science signaling. 4, pe11 (2011).
