Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Undersøgelse af DNA beskadigelse checkpoint'et ved hjælp Published: November 5, 2012 doi: 10.3791/4449
* These authors contributed equally

Summary

Xenopus æggeekstrakt er et nyttigt model-system til at undersøge DNA beskadigelse checkpoint'et. Denne protokol er til fremstilling af Xenopus æg ekstrakter og DNA beskadigelse checkpoint'et inducerende reagenser. Disse teknikker kan tilpasses til en række DNA-ødelæggende fremgangsmåder i undersøgelsen af ​​DNA beskadigelse checkpoint'et signalering.

Abstract

På daglig basis, er celler underkastes en række forskellige endogene og miljømæssige fornærmelser. For at bekæmpe disse fornærmelser er celler udviklet DNA beskadigelse checkpoint signalering som en overvågningsmekanisme til at fornemme DNA-skader og direkte cellulære reaktioner på DNA-skader. Der er flere grupper af proteiner kaldet sensorer, transducere og effektorer er involveret i DNA beskadigelse checkpoint'et signalering (fig. 1). I denne komplekse signalvejen, er ATR (ATM og Rad3-relateret) en af ​​de store kinaser der kan reagere på DNA-beskadigelse og replikation stress. Aktiveret ATR kan phosphorylere dens downstream substrater såsom Chk1 (Checkpoint kinase 1). Følgelig phosphoryleret og aktiveret Chk1 fører til mange downstream effekter i DNA beskadigelse checkpoint'et herunder cellecyklusstandsning, transkriptionsaktivering, DNA-beskadigelse reparation, og apoptose eller fremadskridende alderdom (figur 1). Når DNA er beskadiget, ikke at aktivere DNA beskadigelse checkpoint'et resulterer i unrepluftet skade og efterfølgende genomisk ustabilitet. Undersøgelsen af ​​DNA skade checkpoint vil belyse, hvordan cellerne opretholder genomisk integritet og give en bedre forståelse af, hvordan humane sygdomme, såsom kræft, udvikle sig.

Xenopus laevis æg ekstrakter dukker op som en kraftfuld cellefri ekstrakt modelsystem i DNA beskadigelse checkpoint'et forskning. Lav hastighed ekstrakt (LSE) blev oprindeligt beskrevet af Masui gruppe 1. Tilsætningen af ​​demembranated sperm chromatin til LSE resulterer i kerner dannelse hvor DNA replikeres i en semi måde gang pr cellecyklus.

Den ATR/Chk1-mediated checkpoint signalvejen udløses af DNA-beskadigelse eller replikation stress 2. To metoder anvendes for tiden til at inducere DNA beskadigelse checkpoint: DNA-ødelæggende metoder og DNA-skader der efterligner strukturer 3. DNA-beskadigelse kan induceres af ultraviolet (UV) bestråling, γ-bestråling, methyl methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinolin-1-oxid (4-NQO), eller aphidicolin 3, 4. MMS er et alkyleringsmiddel, der inhiberer DNA-replikation og aktiverer ATR/Chk1-mediated DNA beskadigelse checkpoint'et 4-7. UV-bestråling også udløser ATR/Chk1-dependent DNA-skader checkpoint 8. Den DNA-beskadigelse-efterlignende struktur AT70 er et udglødet kompleks af to oligonucleotider poly-(dA) 70 og poly-(dT) 70. Det AT70-systemet blev udviklet i Bill Dunphy laboratorium og er almindeligt anvendt til at fremkalde ATR/Chk1 checkpoint signalering 9-12.

Her beskriver vi protokoller (1) til fremstilling af cellefrie ekstrakter æg (LSE), (2) at behandle Xenopus spermakromatin med to forskellige DNA-ødelæggende fremgangsmåder (MMS og UV), (3) til fremstilling af DNA-beskadigelse-efterlignende struktur AT70, og (4) at udløse ATR/Chk1-mediated DNA beskadigelse checkpoint'et i LSE med beskadiget spermakromatin eller en DNA-beskadigelse-efterlignende struktur.

Protocol

1. LSE Forberedelse

  1. Kvindelige frøer (Xenopus laevis) injiceres to gange for ægudtagning. Den første injektion (priming) er 100 U PMSG (Gravid Mare Serum Gonadotropin) per frø. Frøer primes mindst to dage før induktion æglægning og primede frøer kan anvendes i op til to uger. Til premierminister frøer, PMSG subkutant i de dorsale lymfeknuder sacs anvendelse af en 3 ml sprøjte og 27 G nål injiceres.
  2. For at inducere æglægning, injiceres 500 U hCG (humant choriongonadotropin) pr primet frøen subkutant i de dorsale lymfeknuder sacs med en 27 G nål. Inkuber injicerede frøer i separate spande indeholdende 2 liter 1x Marc modificeret Ringers opløsning (MMR). Tillad frøer 14-20 timer at lægge æg før samling.
  3. Fjern frøer fra spande og hæld MFR løsning indtil omkring 100 ml er tilbage. Anskaf æg fra de spande ved at overføre æggene til et 250 ml bægerglas.
  4. Dejelly æg ved tilsætning af 100 ml 2% cystein (justerepH til 7,8 med 10 M KOH). Ryst forsigtigt æggene med en omvendt glas Pasteur-pipette (0,7 cm i diameter) cirka hver 30. sek. Fradekanteres og erstatte med frisk cystein to gange under inkubation. Den dejellying er fuldført i omkring 5-15 minutter, når æggene danne en mere koncentreret lag på bunden af ​​bægerglasset.
  5. Kassér cystein opløsning og vaske æg tre gange med 0,25 x MMR. Swirl æggene i opløsningen af ​​et glas pipette. "Dårlige" æg bestemmes ved simpel visuel inspektion og er "puffy" hvidt i udseende. De "dårlige" æg vil akkumuleres i midten af ​​bægeret, efter omrystning. Fjern "dårlige" æg med en Pasteur-pipette.
  6. Vaske æg med Egg Lysis Buffer (ELB) tre gange. Fjern eventuelle yderligere "dårlige" æg med en Pasteur-pipette. Hæld æg i et 14 ml Falcon-rør.
  7. Spin Falcon-rør for 55 sekunder ved 188 xg (1.100 rpm) ved hjælp af CL2 IEC kliniske bordplade centrifuge med en svingende spand rotor at komprimere æggene. Fjern overskydende puffer fratoppen af ​​ægget lag. Tilsæt 0,5 ul Aprotinin / Leupeptin lager og 0,5 pi Cytochalasin B bestand pr ml komprimerede æg.
  8. Centrifuger æg ved 16.500 x g (10.000 rpm) i 15 minutter ved 4 ° C under anvendelse af Sorvall RC6 plus SuperSpeed ​​centrifuge med HB6 svingende spand rotor. Efter centrifugering er æg fraktioneret i tre lag i røret: lipid, ekstrakt og blomme / pigment fra top til bund, henholdsvis. Punktere siden af ​​Falcon-rør i den nedre del af den midterste ekstrakt lag med en 21 G nål. Fjern forsigtigt nålen som punkteringsnålen kan være spærret af plast. Isæt et nyt 21 G nål fastgjort til en 1 ml sprøjte i punkturstedet at indsamle ekstraktet. Langsomt sug ekstrakten i sprøjten for at undgå luftbobler og kontaminering med lipid og blomme / pigment lag.
  9. Anbring af ekstrakterne i en afkølet 1,5 ml mikrocentrifugerør. For hver milliliter æggeekstrakt, tilføje følgende kemiske stamopløsninger til idicated slutkoncentration (vist i parenteser): (1) 10 ul cycloheximid (100 ug / ml), (2) 1 pi Aprotinin / Leupeptin (10 ug / ml hver) (3) 1 pi Cytochalasin B (5 ug / ml ), (4) 1 pi Dithiothreitol (1 mM) og (5) 0,33 pi Nocodazole (3 ug / ml). Vend ægget udvinde mindst 10 gange forsigtigt. Dette er LSE, som skal gøres friske og anvendes inden for 4 timer. Kvaliteten af ​​LSE kompromitteres efter 4 timer eller fryse-tø.

2. Behandling af spermakromatin med DNA-ødelæggende Approaches

  1. Forbered normal spermakromatin ifølge fremgangsmåden beskrevet tidligere 13.
  2. Forbered MMS-behandlet spermakromatin
    1. Resuspendere normal spermakromatin i 0,5 ml puffer X.
    2. Tilføj -5,5 pi MMS (9,1 M i lager) til 500 pi resuspenderet kromatin til en slutkoncentration på 100 mM.
    3. Inkuber spermakromatin i mikrocentrifugerør ved stuetemperatur i 30 minutter med rotation.
    4. Centrifuger microcentrifuge rør ved 686 x g (2100 rpm) i 10 minutter ved stuetemperatur under anvendelse af IEC CL2 klinisk centrifuge med svingende spand rotor og rør adaptere.
    5. Kasser supernatanten og resuspender pellet i 0,5 ml puffer X plus BSA (3%), DTT (0,1 mM) og Aprotinin / Leupeptin (10 ug / ml hver).
    6. Gentag trin (4) og (5) to gange for at vaske spermakromatin.
    7. Bestemme koncentrationen af ​​spermakromatin med et hæmocytometer og fortyndet til 100.000 sædceller / ul. Spar 5 ul portioner i -80 ° C fryseren til senere brug.
  3. Forbered UV-behandlet spermakromatin
    1. Læg ønskede mængde (fx 10 ul) af den normale spermakromatin på overfladen af et stykke Parafilm.
    2. Anbring Parafilm til en UV tværbindingsmiddel. Indstil den ønskede energi parameter, afhængigt af dit eksperiment, og begynde at beskadige spermakromatin via UV-lys. For eksempel tager det ca 21 sek til at nå 1.000 J / m 2.
    3. Efter UV strålingsdosisstråling, UV-behandlet spermakromatin bør tilføjes til æg ekstrakter samme.

3. Fremstilling af en DNA Damage-efterlignende Structure (AT70)

  1. Opløs to syntetiske oligonukleotider poly-(dA) 70 (betegnet A70) og poly-(dT) 70 (betegnet T70) i ​​vand til en koncentration på 2 pg / pl hhv.
  2. Tilsæt 100 pi af A70 og 100 pi T70 til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Kog blandet syntetisk oligo opløsningen i 5 minutter ved 95 ° C i en heatblock.
  3. Tag den tørre bad blok ud (med rør, der indeholder AT blanding i det), og lad det køle ned til stuetemperatur på en lab bænk. Denne temperatur justering tager ca 45-60 min.
  4. Den afkølede blanding er AT70 med en slutkoncentration på 2 pg / pl. Store 10 pi AT70 alikvoter i -20 ° C fryseren for yderligere anvendelse.

4. Udløsning DNA Damage Checkpoint i LSE med beskadigede spermakromatin eller en DNA Damage-Efterlignende struktur

  1. Inducerer DNA-skader checkpoint i LSE med beskadiget spermakromatin
    1. Der tilsættes 50 ul LSE til et 1,5 ml mikrocentrifugerør og supplere det med 1 ml af energi Blanding og 2 pi af beskadiget spermakromatin (slutkoncentration ~ 4000 sperm / pi reaktion).
    2. Inkuber reaktionsrøret ved stuetemperatur i 90 minutter og svippe røret hver 10 min.
    3. Dispensér 1 ml af reaktionsblandingen på et mikroskopobjektglas suppleret med 1 pi af nuklear farvestofopløsning efter 30 minutters inkubation. Placere et dækglas over reaktionsblandingen og kontroller for kerner formation via fluorescensmikroskop. Typisk vil runde kerner dannes efter 30 minutters inkubation, hvilket viser DNA-replikation har indledt.
    4. Tag 10 gl af reaktionsblandingen i 90 pi prøvepuffer. Prøver analyseres via immunoblotting under anvendelse af anti-Chk1 P-S344 eller anti-Chk1 antistoffer.
  2. Inducerer DNA-skader checkpoint i LSE medAT70
    1. Der tilsættes 50 ul LSE til et 1,5 ml mikrocentrifugerør tilsat 1 pi of Energy blanding og 1,6 pi Tautomycin lager.
    2. Tilsættes 1,25 ul præfremstillet AT70 (2 pg / pl) eller vand (som negativ kontrol) til hver reaktion. Inkubér reaktionerne ved stuetemperatur i 90 min. Svirp reaktionsrørene hver 10 min.
    3. Der tilsættes 10 ul af reaktionsblandingen i 90 pi prøvepuffer. Prøverne undersøges ved hjælp af immunoblotting under anvendelse af anti-Chk1 P-S344 eller anti-Chk1 antistoffer.

5. Repræsentative resultater

Den beskadigede spermakromatin eller DNA-beskadigelse-efterlignende struktur kan udløse ATR/Chk1-mediated DNA beskadigelse checkpoint'et i Xenopus æggeekstrakt system. Figur 2a viser, at MMS inducerer Chk1 phosphorylering ved Ser344 (Chk1 P-S344), hvilket er en indikator for ATR kinase aktivering. Figur 2B viser, at AT70, som DNA-beskadigelse-efterlignende structure, også udløser Chk1 phosphorylering. Samlede Chk1 prøver anvendes som lastning kontrol i begge eksempler.

Figur 1
Figur 1. En skitse af DNA beskadigelse checkpoint'et signalering.

Figur 2
Figur 2. Chk1 phosphorylering induceres af enten MMS eller AT70 behandlinger i Xenopus æg ekstrakter. (A) MMS-beskadiget spermakromatin (MMS) eller normal spermakromatin (Con) inkuberes i æg ekstrakter i 90 min. Chk1 phosphorylering ved Ser344 (Chk1 P-S344) og total Chk1 i æg ekstrakter undersøges via immunoblotting. (B) AT70 eller vand (Con) tilsættes til ægprodukter ekstrakter hhv. Prøver analyseres også via immunoblotting som i (A).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der er flere fordele ved at studere DNA beskadigelse checkpoint ved hjælp af Xenopus æg ekstrakter. Anvendelsen af ​​æg ekstrakter giver en stor mængde cellefri ekstrakter synkroniseret ved interfasen af ​​cellecyklussen. Ægget ekstrakter kan let og billigt fremstillet. Det er relativt let at beskadige DNA eller kromatin og at afsløre en fejl i DNA beskadigelse checkpoint'et efter immunodepleting et målprotein fra æggeekstrakt. Efterfølgende kan en potentiel funktion defekt blive "reddet" af addback af vildtype eller mutante rekombinante proteiner. Derfor Xenopus æggeekstrakt er et stærkt modelsystem for struktur og funktion analyse af DNA beskadigelse checkpoint'et.

LSE præparat er påvist tidligere 14, men vores protokol har nogle modifikationer. Temperaturen af ​​inkubere frøer efter hCG injektion (18 ° C) er meget afgørende for æglægning. Flere ressourcer til håndtering og injektion frøer kan findesfra tidligere undersøgelser 13,14 og på internettet, såsom tropicalis.berkeley.edu / home / obtaining_embryos / hCG / hCG.html . Generelt kan 1-3 ml LSE fremstilles fra æg afledt fra et frø. Det tager omkring en time til fremstilling af LSE, og det er typisk stabilt på is i omkring 4 timer. LSE skal fremstilles friskt, når det er nødvendigt, eftersom frysning og optøning kompromiser kvaliteten af ​​LSE til anvendelse i DNA beskadigelse checkpoint'et eksperimenter. I trin 1,9, anbefaler vi at gøre stamopløsninger, hvilket sparer portioner i frysere, og ved hjælp frosne alikvoteredes bestandene til hver kemikalie. Det er vores erfaring, er disse portioner kan bruges i op til 3 fryse-tø cykler.

DNA-beskadigende reagenser, såsom MMS er blevet undersøgt i LSE til aktivering Chk1 phosphorylering (se figur 2A). DNA-beskadigende reagenser kan enten tilsættes direkte til LSE eller anvendes til at beskadige sperm chromatin før tilsætning til LSE. Koncentrationen af ​​DNA-ødelæggende reagenser vil højst sandsynligt skal optimeres til specifikke eksperimenter for at opnå de bedst mulige betingelser for at udløse Chk1 phosphorylering. UV-bestråling kan også anvendes til beskadigelse spermakromatin og undersøgelse aktivering af DNA beskadigelse checkpoint'et via Chk1 phosphorylering (data ikke vist). The Chk1 phosphoryleringssted Ser344 i Xenopus er den bevarede sted analog med Chk1 Ser345 hos mennesker 8.

Den syntetiske oligo AT70 blanding efterligner strukturen af ​​DNA-skader. I nærvær af Tautomycin (en phosphatase-inhibitor), er AT70-induceret Chk1 phosphorylering stabiliseret og kan blive belyst ved immunoblotting (som vist i figur 2B). Den samlede endogene Chk1 anvendes som en loading kontrol. AT70 udløser et mobilitetsskift i alt Chk1, der kan visualiseres på en Western blot, hvilket viser Chk1 phosphoryleres. Antistoffer mod Chk1 phosphoryleringog samlede Chk1 er egnede til immunoblotting-analyse af DNA beskadigelse checkpoint'et signalering i Xenopus.

Samlet set Xenopus æg ekstrakter system er en kraftfuld cellefrit modelsystem til at undersøge DNA beskadigelse checkpoint'et. Denne protokol giver de detaljerede procedurer for en sådan analyse. Dette system kan moduleres til at undersøge de molekylære mekanismer i DNA beskadigelse checkpoint'et ved anvendelse af en række forskellige DNA-ødelæggende fremgangsmåder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Dette arbejde er delvist understøttet af midler fra The University of North Carolina i Charlotte, Wachovia fundament fond til fakultet ekspertise, og et tilskud fra NIGMS (R15GM101571).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Anti-Chk1 P-S344 antibody Cell Signaling 2348L
Anti-Chk1 antibody Santa Cruz SC7898
Aprotinin MP Biomedicals 0219115880
Cycloheximide Sigma C7698-5G
Cytochalasin B EMD 250233
Dithiothreitol (DTT) VWR JTF780-2
hCG Sigma CG10-10VL
L-Cysteine Sigma C7352-1KG
Leupeptin VWR 97063-922
Methyl methanesulfonate (MMS) Sigma 129925-5G
Nocodazole Sigma M1404-2MG
PMSG Calbiochem 367222
Sample buffer Sigma S3401
Tautomycin Wako Chemicals USA 209-12041
Equipment
Bucket for egg laying Rubbermaid commercial products 6308
CL2 IEC centrifuge with swinging bucket rotor Thermo Scientific 004260F
HB6 swinging bucket rotor Thermo Scientific 11860
Sorvall RC6 plus superspeed centrifuge Thermo Scientific 46910
UV crosslinker UVP 95-0174-01
Solutions
1x MMR 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM HEPES, adjust pH to 7.8 with 10 M NaOH
Aprotinin/Leupeptin stock 10 mg/ml each in water. Store 20 μl aliquots at -80 °C.
Buffer X 0.2 M sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, adjust pH to 7.5 by HCl
Cycloheximide stock 10 mg/ml in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C.
Cytochalasin B stock 5 mg/ml in DMSO. Store 20 μl aliquots at -20 °C.
Dithiothreitol (DTT) stock 1 M in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C.
ELB 0.25 M sucrose, 1 mM DTT, 50 μg/ml cycloheximide, 2.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7
Nocodazole stock 10 mg/ml in DMSO. Store 5 μl aliquots at -80 °C.
Energy Mixture 375 mM creatine phosphate, 50 mM ATP, and 25 mM MgCl2. Aliquots are saved at -80 °C.
Nuclear dye solution 0.4 μg/ml H–chst 33258, 25% glycerol (v/v), in 1x PBS
Tautomycin stock 100 μM in DMSO. Store 10 μl aliquots at -80 °C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220 (4598), 719-721 (1983).
  2. Cimprich, K. A., Cortez, D. ATR: an essential regulator of genome integrity. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).
  3. Lupardus, P. J., Van, C., Cimprich, K. A. Analyzing the ATR-mediated checkpoint using Xenopus egg extracts. Methods. 41 (2), 222-231 (2007).
  4. Lupardus, P. J., Byun, T., Yee, M. C., Hekmat-Nejad, M., Cimprich, K. A. A requirement for replication in activation of the ATR-dependent DNA damage checkpoint. Genes Dev. 16 (18), 2327-2332 (2002).
  5. Stokes, M. P., Van Hatten, R., Lindsay, H. D., Michael, W. M. DNA replication is required for the checkpoint response to damaged DNA in Xenopus egg extracts. J. Cell Biol. 158 (5), 863-872 (2002).
  6. Kato, K., Strauss, B. Accumulation of an intermediate in DNA synthesis by HEp.2 cells treated with methyl methanesulfonate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (5), 1969-1973 (1974).
  7. Paulovich, A. G., Hartwell, L. H. A checkpoint regulates the rate of progression through S phase in S. cerevisiae in response to DNA damage. Cell. 82 (5), 841-847 (1995).
  8. Guo, Z., Kumagai, A., Wang, S. X., Dunphy, W. G. Requirement for Atr in phosphorylation of Chk1 and cell cycle regulation in response to DNA replication blocks and UV-damaged DNA in Xenopus egg extracts. Genes Dev. 14 (21), 2745-2756 (2000).
  9. Jazayeri, A., Balestrini, A., Garner, E., Haber, J. E., Costanzo, V. Mre11-Rad50-Nbs1-dependent processing of DNA breaks generates oligonucleotides that stimulate ATM activity. EMBO. J. 27 (14), 1953-1962 (2008).
  10. Kumagai, A., Dunphy, W. G. Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts. Mol. Cell. 6 (4), 839-849 (2000).
  11. Yan, S., Lindsay, H. D., Michael, W. M. Direct requirement for Xmus101 in ATR-mediated phosphorylation of Claspin bound Chk1 during checkpoint signaling. J. Cell Biol. 173 (2), 181-186 (2006).
  12. Shiotani, B., Zou, L. Single-stranded DNA orchestrates an ATM-to-ATR switch at DNA breaks. Mol. Cell. 33 (5), 547-558 (2009).
  13. Tutter, A. V., Walter, J. C. Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs. Methods Mol. Biol. 322, 121-137 (2006).
  14. Cross, M. K., Powers, M. Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts. J. Vis. Exp. (18), e891 (2008).

Tags

Genetik Molecular Biology Cellular Biology Developmental Biology DNA-skader kontrolpost, Chk1 phosphorylering ATR AT70 MMS UV immunoblotting
Undersøgelse af DNA beskadigelse checkpoint&#39;et ved hjælp<em&gt; Xenopus</em&gt; Æg Ekstrakter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Willis, J., DeStephanis, D., Patel,More

Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts. J. Vis. Exp. (69), e4449, doi:10.3791/4449 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter