Summary
Xenopus अंडा निकालने के लिए डीएनए की क्षति जांच की चौकी की जांच के लिए एक उपयोगी मॉडल प्रणाली है. इस प्रोटोकॉल Xenopus अंडा अर्क और डीएनए की क्षति जांच की चौकी उत्प्रेरण अभिकर्मकों की तैयारी के लिए है. इन तकनीकों में डीएनए की क्षति जांच की चौकी संकेतन के अध्ययन में डीएनए हानिकारक दृष्टिकोण की एक किस्म के लिए अनुकूलनीय हैं.
Protocol
1. लंदन स्कूल आफ इकोनॉमिक्स तैयारी
- महिला मेंढ़कों (Xenopus laevis) अंडा संग्रह के लिए दो बार इंजेक्शन हैं. 1 इंजेक्शन (भड़काना) मेंढक प्रति 100 यू PMSG (गर्भवती घोड़ी सीरम Gonadotropin) है. मेंढक कम से कम दो दिनों primed किया जाना चाहिए पहले उत्प्रेरण अंडा बिछाने और primed मेंढ़क दो सप्ताह तक के लिए उपयोगी हैं. प्रधानमंत्री मेंढ़क, पृष्ठीय लसीका 3 मिलीलीटर सिरिंज और 27 जी सुई का उपयोग थैलियों में subcutaneously PMSG इंजेक्षन.
- अंडे बिछाने के लिए प्रेरित करने के लिए, 500 यू एचसीजी (मानव chorionic gonadotrophin) इंजेक्षन primed मेंढक प्रति subcutaneously पृष्ठीय लसीका एक 27 जी सुई का उपयोग कर थैलियों में. अलग 1x मार्क संशोधित घंटी समाधान (एमएमआर) के 2 लीटर युक्त बाल्टी में इंजेक्शन मेंढ़कों सेते हैं. मेंढ़क 14-20 घंटे की अनुमति दें संग्रह से पहले अंडे देना.
- बाल्टी से मेंढ़क निकालें और एमएमआर समाधान डालना करीब 100 मिलीलीटर तक छोड़ दिया है. बाल्टी से एक 250 मिलीलीटर बीकर अंडे स्थानांतरित अंडे प्राप्त करते हैं.
- 2% सिस्टीन के 100 मिलीलीटर (को समायोजित जोड़कर Dejelly अंडे10 एम KOH के साथ 7.8 पीएच). एक औंधा कांच पाश्चर pipet (व्यास में 0.7 सेमी) लगभग हर 30 सेकंड के साथ धीरे अंडे ज़ुल्फ़. पसाना और ताजा सिस्टीन साथ ऊष्मायन के दौरान दो बार की जगह. dejellying प्रक्रिया के बारे में 5-15 मिनट में पूरा है जब अंडे बीकर के नीचे एक और अधिक गाढ़ा परत के रूप में है.
- सिस्टीन समाधान त्यागें और अंडे 0.25x एमएमआर के साथ तीन बार धो लो. अंडे भंवर एक गिलास pipet द्वारा समाधान में. "" बुरा अंडे साधारण दृश्य निरीक्षण द्वारा निर्धारित कर रहे हैं और दिखने में झोंके में आने वाला "सफेद हैं. "" बुरा अंडे बीकर के केंद्र में घूमता के बाद जमा करेंगे. एक पाश्चर pipet द्वारा "" बुरा अंडे निकालें.
- अंडा lysis बफर (ईएलबी) तीन बार के साथ अंडे धो लें. एक पाश्चर pipet द्वारा किसी भी अतिरिक्त "" बुरा अंडे निकालें. एक 14 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब में अंडे डालो.
- 55 सेकंड के लिए 188 XG (1100 आरपीएम) फाल्कन ट्यूब एक बाल्टी रोटर झूल साथ CL2 आईईसी नैदानिक टेबल टॉप अपकेंद्रित्र का उपयोग करने के लिए अंडे कॉम्पैक्ट स्पिन. से अतिरिक्त बफर निकालेंअंडा परत के ऊपर. Aprotinin / Leupeptin स्टॉक के 0.5 μl और जमा अंडे की मिलीलीटर प्रति Cytochalasin बी स्टॉक के 0.5 μl जोड़ें.
- 4 बजे 15 मिनट के लिए +१६५०० XG (10,000 rpm) पर अंडे अपकेंद्रित्र ° C HB6 झूल बाल्टी रोटर के साथ Sorvall RC6 प्लस superspeed अपकेंद्रित्र का उपयोग कर. Centrifugation के बाद, अंडे ट्यूब में तीन परतों में fractionated हैं: लिपिड, निकालने, और जर्दी / ऊपर से नीचे तक वर्णक, क्रमशः. फाल्कन ट्यूब की ओर एक 21 जी सुई के साथ मध्यम निकालने परत के निचले हिस्से में पंचर. ध्यान सुई हटाने puncturing सुई के रूप में प्लास्टिक के द्वारा बाधित किया जा सकता है. एक ताजा 21 जी पंचर साइट में 1 मिलीलीटर सिरिंज को निकालने के इकट्ठा करने के लिए संलग्न सुई डालें. धीरे धीरे सिरिंज में निकालने aspirate हवा बुलबुले और लिपिड और जर्दी / वर्णक परतों के साथ संक्रमण से बचने के.
- एक ठंडा 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में अर्क रखें. अंडे निकालने की मिली लीटर प्रत्येक के लिए, के लिए निम्नलिखित रासायनिक स्टॉक समाधान जोड़नेdicated अंतिम एकाग्रता (कोष्ठकों में दिखाया गया है): (1) 10 μl (100 ग्राम / एमएल) Cycloheximide, (2) एक μl Aprotinin / (10 ग्राम / मिलीलीटर प्रत्येक) Leupeptin, (3) 1 μl Cytochalasin (बी 5 ग्राम / मिलीलीटर ), (4) 1 μl (1 मिमी) Dithiothreitol, और (5) 0.33 μl Nocodazole (3 ग्राम / एमएल). उलटें अंडा कम से कम 10 बार धीरे निकालने. यह लंदन स्कूल आफ इकोनॉमिक्स, जो ताजा किया जाना चाहिए और 4 घंटे के भीतर इस्तेमाल किया है. लंदन स्कूल आफ इकोनॉमिक्स की गुणवत्ता 4 घंटा या फ्रीज पिघलना के बाद समझौता किया है.
2. शुक्राणु chromatin की डीएनए हानिकारक दृष्टिकोण के साथ उपचार
- पहले 13 वर्णित विधि के अनुसार सामान्य शुक्राणु chromatin तैयार.
- एमएमएस का इलाज शुक्राणु chromatin तैयार
- 0.5 मिलीलीटर बफर एक्स में सामान्य शुक्राणु chromatin Resuspend
- एमएमएस के 5.5 μl जोड़ें (9.1 स्टॉक में एम) 500 100 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता chromatin resuspended μl.
- Microcentrifuge ट्यूब में शुक्राणु chromatin रोटेशन के साथ 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- मीटर स्पिनकमरे में झूल बाल्टी रोटर और ट्यूब एडेप्टर के साथ आईईसी CL2 नैदानिक अपकेंद्रित्र का उपयोग कर के तापमान पर 10 मिनट के लिए 686 XG (2100 आरपीएम) में icrocentrifuge ट्यूब.
- तैरनेवाला त्यागें और बफर एक्स BSA प्लस (3%), डीटीटी (0.1 मिमी) और Aprotinin / Leupeptin (10 ग्राम / मिलीलीटर प्रत्येक) के 0.5 मिलीलीटर में गोली resuspend.
- दोहराएँ कदम (4) और (5) दो बार शुक्राणु chromatin धोने के लिए.
- एक hemocytometer साथ शुक्राणु chromatin की एकाग्रता का निर्धारण और 100.000 शुक्राणु / μl को पतला. आगे उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में 5 μl aliquots सहेजें.
- यूवी इलाज शुक्राणु chromatin तैयार
- Parafilm का एक टुकड़ा के सतह पर सामान्य शुक्राणु chromatin के वांछित राशि (जैसे 10 μl) जोड़ें.
- एक यूवी crosslinker में Parafilm रखें. वांछित ऊर्जा पैरामीटर, अपने प्रयोग पर निर्भर करता है, सेट और यूवी प्रकाश के माध्यम से शुक्राणु chromatin नुकसान शुरू. उदाहरण के लिए, यह लगभग 21 सेकंड लेता हज़ार जम्मू / 2 मीटर तक पहुँचने.
- यूवी irra के बादdiation, शुक्राणु यूवी इलाज chromatin अंडा निष्कर्षों को तुरंत जोड़ा जाना चाहिए.
3. एक डीएनए संरचना क्षति नकल उतार की तैयारी (AT70)
- दो सिंथेटिक oligonucleotides भंग पाली (डीए) 70 (A70 के रूप में नामित) और पाली - 70 (डीटी) (T70 के रूप में नामित) 2 ग्राम / μl की एकाग्रता के लिए पानी में, क्रमशः.
- एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब A70 के 100 μl और T70 के 100 μl जोड़ें. 5 मिनट में 95 डिग्री सेल्सियस के लिए मिश्रित एक heatblock में सिंथेटिक oligo समाधान उबाल लें.
- सूखी स्नान ब्लॉक बाहर (में मिश्रण युक्त ट्यूब के साथ) ले लो, और यह कमरे के तापमान को नीचे एक प्रयोगशाला बेंच पर शांत. इस तापमान समायोजन 45-60 मिनट के आसपास लेता है.
- ठंडा मिश्रण AT70 2 ग्राम / μl के अंतिम एकाग्रता के साथ है. स्टोर आगे उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में AT70 aliquots के 10 μl.
4. एलएसई में क्षतिग्रस्त शुक्राणु chromatin या डीएनए की क्षति के साथ डीएनए की क्षति चेकप्वाइंट ट्रिगरनकल उतार संरचना
- एलएसई में क्षतिग्रस्त शुक्राणु chromatin साथ डीएनए की क्षति जांच की चौकी के लिए प्रेरित
- एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब एलएसई के 50 μl जोड़ें और यह ऊर्जा मिश्रण का 1 μl और क्षतिग्रस्त शुक्राणु chromatin (अंतिम एकाग्रता ~ 4000 शुक्राणु / μl प्रतिक्रिया) के 2 μl के साथ पूरक.
- कमरे के तापमान पर 90 मिनट के लिए प्रतिक्रिया ट्यूब और ट्यूब सेते हर 10 मिनट झटका.
- एक खुर्दबीन स्लाइड पर 30 मिनट ऊष्मायन के बाद परमाणु डाई समाधान के 1 μl के साथ पूरक प्रतिक्रिया मिश्रण के 1 μl बांटना. प्रतिक्रिया मिश्रण पर एक आवरण पर्ची प्लेस और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के माध्यम से नाभिक गठन के लिए जाँच करें. आमतौर पर, गोल नाभिक ऊष्मायन के 30 मिनट के बाद फार्म, संकेत है डीएनए प्रतिकृति शुरू कर दी है.
- नमूना बफर के 90 μl में प्रतिक्रिया मिश्रण के 10 μl लो. नमूने विरोधी Chk1 पी S344 या विरोधी Chk1 एंटीबॉडी का उपयोग immunoblotting के माध्यम से विश्लेषण कर रहे हैं.
- साथ एलएसई में डीएनए की क्षति जांच की चौकी प्रेरितAT70
- एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ऊर्जा मिश्रण का 1 μl और Tautomycin स्टॉक के 1.6 μl के साथ पूरक ट्यूब एलएसई के 50 μl जोड़ें.
- प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए पूर्व बनाया (2 ग्राम / μl) AT70 या पानी (नकारात्मक नियंत्रण के रूप में) की 1.25 μl जोड़ें. 90 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रियाओं सेते हैं. प्रतिक्रिया ट्यूब हर 10 मिनट झटका.
- नमूना बफर के 90 μl में प्रतिक्रिया मिश्रण के 10 μl जोड़ें. नमूने विरोधी Chk1 पी S344 या विरोधी Chk1 एंटीबॉडी का उपयोग immunoblotting के माध्यम से जांच कर रहे हैं.
5. प्रतिनिधि परिणाम
क्षतिग्रस्त शुक्राणु chromatin या डीएनए संरचना क्षति नकल उतार Xenopus अंडा निकालने प्रणाली में ATR/Chk1-mediated डीएनए की क्षति जांच की चौकी ट्रिगर चित्रा 2A शो है कि एमएमएस Ser344 में Chk1 phosphorylation (Chk1 P-S344), जो का एक संकेतक है लाती है. एटीआर kinase सक्रियण चित्रा 2B से पता चलता है कि AT70, एक डीएनए के रूप में क्षति नकल उतार structure, भी Chk1 phosphorylation चलाता है. कुल Chk1 नमूने दोनों उदाहरणों में नियंत्रण लोड के रूप में उपयोग किया जाता है.
चित्रा 1. डीएनए की क्षति जांच की चौकी संकेतन का एक चित्र.
चित्रा 2. Phosphorylation Chk1 या तो एमएमएस या Xenopus अंडा अर्क में AT70 उपचार से प्रेरित है (ए) एमएमएस क्षतिग्रस्त शुक्राणु chromatin (एमएमएस) या सामान्य शुक्राणु chromatin (कोन) 90 मिनट के लिए अंडे के अर्क में incubated हैं. Phosphorylation Chk1 (Ser344 में पी Chk1-S344) और अंडे के अर्क में कुल Chk1 immunoblotting के माध्यम से जांच कर रहे हैं. (बी) AT70 या पानी (कोन) अंडा अर्क में जोड़ रहे हैं, क्रमशः. नमूने भी (ए) के रूप में immunoblotting के माध्यम से विश्लेषण कर रहे हैं.
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Discussion
डीएनए की क्षति Xenopus अंडा अर्क का उपयोग कर जांच की चौकी के अध्ययन में कई फायदे हैं. अंडे के अर्क का उपयोग सेल से मुक्त कोशिका चक्र के अंतरावस्था पर सिंक्रनाइज़ निष्कर्षों की एक बड़ी मात्रा प्रदान करता है. अंडा अर्क आसानी से और सस्ते में बनाया जा सकता है. यह अपेक्षाकृत आसान करने के लिए डीएनए या chromatin नुकसान और अंडे निकालने से एक लक्ष्य प्रोटीन immunodepleting के बाद डीएनए की क्षति जांच की चौकी में एक दोष प्रकट. बाद में, एक संभावित समारोह दोष जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती पुनः संयोजक प्रोटीन के addback से कर सकते हैं "बचाया" सकता है. इसलिए, Xenopus अंडा निकालने संरचना और डीएनए की क्षति जांच की चौकी के समारोह विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है.
एलएसई तैयारी पहले 14 का प्रदर्शन किया है, लेकिन हमारे प्रोटोकॉल कुछ संशोधनों है. एचसीजी इंजेक्शन (18 डिग्री सेल्सियस) के बाद मेंढ़क incubating के तापमान अंडे बिछाने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है. हैंडलिंग और इंजेक्शन मेंढ़कों की अधिक संसाधनों को पाया जा सकता हैपिछले 13,14 अध्ययन से और इस तरह के रूप में इंटरनेट पर tropicalis.berkeley.edu घर / / / / obtaining_embryos एचसीजी hCG.html . आम तौर पर, लंदन स्कूल आफ इकोनॉमिक्स के 1-3 मिलीलीटर एक मेंढक से व्युत्पन्न अंडे से तैयार किया जा सकता है. यह लगभग एक घंटा लगता है के लिए लंदन स्कूल आफ इकोनॉमिक्स के लिए तैयार है और यह आम तौर पर लगभग 4 घंटे के लिए बर्फ पर स्थिर है. लंदन स्कूल आफ इकोनॉमिक्स के लिए नए सिरे से बनाया जा सकता है जब यह ठंड और विगलन समझौते के बाद से डीएनए की क्षति जांच की चौकी प्रयोगों में इस्तेमाल के लिए लंदन स्कूल आफ इकोनॉमिक्स की गुणवत्ता की जरूरत है. 1.9 चरण में, हम शेयर समाधान कर रही है, फ्रीजर में बचत aliquots, और प्रत्येक रसायन के लिए जमे हुए aliquoted शेयरों का उपयोग करने की सलाह देते हैं. हमारे अनुभव में, इन aliquots 3 फ्रीज पिघलना चक्र के लिए उपयोगी हैं.
एलएसई में एमएमएस के रूप में डीएनए हानिकारक अभिकर्मकों Chk1 phosphorylation (चित्रा 2A देखें) को ट्रिगर करने के लिए किया गया है की जांच की. डीएनए हानिकारक अभिकर्मकों या तो लंदन स्कूल आफ इकोनॉमिक्स के लिए सीधे कर सकते हैं जोड़ा जा या सपा को नुकसान पहुंचा उपयोगलंदन स्कूल आफ इकोनॉमिक्स के अलावा पहले एर्म chromatin. डीएनए हानिकारक अभिकर्मकों की एकाग्रता सबसे अधिक संभावना को विशिष्ट प्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा क्रम में सबसे अच्छा Chk1 phosphorylation ट्रिगर शर्तों प्राप्त की आवश्यकता होगी. पराबैंगनी विकिरण Chk1 phosphorylation (नहीं दिखाया डेटा) के माध्यम से भी क्षति शुक्राणु chromatin और डीएनए की क्षति जांच की चौकी के अध्ययन सक्रियण के लिए उपयोग किया जा सकता है. Xenopus में Chk1 phosphorylation साइट Ser344 8 मनुष्यों में Ser345 Chk1 के लिए संरक्षित अनुरूप साइट है.
सिंथेटिक oligo AT70 मिश्रण डीएनए की क्षति की संरचना mimics. (फॉस्फेट अवरोध करनेवाला) Tautomycin की उपस्थिति में, AT70 प्रेरित Chk1 phosphorylation स्थिर है और immunoblotting (चित्रा 2B में दिखाया गया है) के माध्यम से जांच की जा सकती है. कुल अंतर्जात Chk1 एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है. AT70 कुल Chk1 में एक गतिशीलता बदलाव है कि एक पश्चिमी धब्बा पर देखे जा सकता है, यह दर्शाता है Chk1 phosphorylated है चलाता है. Chk1 phosphorylation के खिलाफ एंटीबॉडीऔर कुल Chk1 Xenopus में डीएनए की क्षति जांच की चौकी संकेतन विश्लेषण immunoblotting के लिए उपयुक्त हैं.
कुल मिलाकर, Xenopus अंडा अर्क प्रणाली एक शक्तिशाली मॉडल सेल से मुक्त करने के लिए डीएनए की क्षति जांच की चौकी की जांच प्रणाली है. इस प्रोटोकॉल ऐसे विश्लेषण के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं प्रदान करता है. इस प्रणाली के डीएनए की क्षति अलग डीएनए हानिकारक दृष्टिकोण की एक किस्म का उपयोग कर जांच की चौकी के आणविक तंत्र का अध्ययन modulated किया जा सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम के हिस्से में Charlotte में उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय, वाचोविया संकाय उत्कृष्टता के लिए नींव निधि, और NIGMS (R15GM101571) से एक अनुदान द्वारा उपलब्ध कराई गई निधियों द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Anti-Chk1 P-S344 antibody | Cell Signaling | 2348L | |
| Anti-Chk1 antibody | Santa Cruz | SC7898 | |
| Aprotinin | MP Biomedicals | 0219115880 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698-5G | |
| Cytochalasin B | EMD | 250233 | |
| Dithiothreitol (DTT) | VWR | JTF780-2 | |
| hCG | Sigma | CG10-10VL | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-1KG | |
| Leupeptin | VWR | 97063-922 | |
| Methyl methanesulfonate (MMS) | Sigma | 129925-5G | |
| Nocodazole | Sigma | M1404-2MG | |
| PMSG | Calbiochem | 367222 | |
| Sample buffer | Sigma | S3401 | |
| Tautomycin | Wako Chemicals USA | 209-12041 | |
| Equipment | |||
| Bucket for egg laying | Rubbermaid commercial products | 6308 | |
| CL2 IEC centrifuge with swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 004260F | |
| HB6 swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 11860 | |
| Sorvall RC6 plus superspeed centrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| UV crosslinker | UVP | 95-0174-01 | |
| Solutions | |||
| 1x MMR | 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM HEPES, adjust pH to 7.8 with 10 M NaOH | ||
| Aprotinin/Leupeptin stock | 10 mg/ml each in water. Store 20 μl aliquots at -80 °C. | ||
| Buffer X | 0.2 M sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, adjust pH to 7.5 by HCl | ||
| Cycloheximide stock | 10 mg/ml in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
| Cytochalasin B stock | 5 mg/ml in DMSO. Store 20 μl aliquots at -20 °C. | ||
| Dithiothreitol (DTT) stock | 1 M in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
| ELB | 0.25 M sucrose, 1 mM DTT, 50 μg/ml cycloheximide, 2.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7 | ||
| Nocodazole stock | 10 mg/ml in DMSO. Store 5 μl aliquots at -80 °C. | ||
| Energy Mixture | 375 mM creatine phosphate, 50 mM ATP, and 25 mM MgCl2. Aliquots are saved at -80 °C. | ||
| Nuclear dye solution | 0.4 μg/ml H–chst 33258, 25% glycerol (v/v), in 1x PBS | ||
| Tautomycin stock | 100 μM in DMSO. Store 10 μl aliquots at -80 °C. | ||
References
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