Summary
Xenopus 계란 추출물은 DNA 손상 검사 점을 조사 할 수있는 유용한 모델 시스템입니다. 이 프로토콜은 Xenopus의 알 추출물과 DNA 손상 검사 점 유도 시약의 준비입니다. 이 기술은 DNA 손상 검사 점 신호의 연구에서 DNA 손상 방식의 다양한에 적용 할 수 있습니다.
Abstract
매일, 세포 내생과 환경 모욕 다양한를 받게됩니다. 이러한 모욕을 방지하기 위해, 세포가 DNA 손상에 DNA 손상 및 직접 세포 반응을 감지 할 수있는 감시 장치로 신호 DNA 손상 검사 점을 발전시켜 왔습니다. DNA 손상 검사 점 신호 (그림 1)에 참여 센서, 트랜스 듀서 및 effectors라는 단백질의 여러 그룹이 있습니다. 이 복잡한 신호 경로에서 ATR (ATM 및 Rad3 관련)은 DNA 손상 및 복제 스트레스에 응답 할 수있는 주요 kinases 중 하나입니다. 활성화 ATR은 Chk1 아니라 그 하류 기판 (세키 키나제 1) phosphorylate 할 수 있습니다. 따라서, phosphorylated 및 세포주기 체포, 전사 활성화, DNA 손상 수리 및 apoptosis 또는 노화 (그림 1)을 포함하여 DNA 손상 검사 점의 여러 다운 스트림 효과 Chk1 리드를 활성화. DNA가 손상되면 unrep에서 DNA 손상 검사 점 결과를 활성화하기 위해 실패방송 손상과, 이후, 게놈 불안정성. DNA 손상 검사 점의 연구는 세포 게놈 무결성을 유지하는 방법 명료하게하다와 같은 암 등 인간의 질병이 개발 방법에 대한 이해를 제공 할 것입니다.
Xenopus laevis 계란 추출물은 DNA 손상 검사 점의 연구에 강력한 셀 - 무료 추출 모델 시스템으로 등장하고 있습니다. 저속 추출물 (LSE)가 처음 Masui 그룹 1에 의해 설명되었다. DNA 한 번 세포주기 당 semiconservative 방식으로 복제 핵 형성에 LSE 결과 demembranated 정자 염색질의 추가.
ATR/Chk1-mediated 검사 점 신호 경로는 DNA가 손상되거나 복제 스트레스를 2로 실행됩니다. DNA 손상 접근 방식과 DNA 손상 - 모방 구조 3 : 두 가지 방법은 현재 DNA 손상 검사 점을 유발하는 데 사용됩니다. DNA 손상은 자외선 (UV) 조사, γ-방사선, 메틸 나게 의해 유도 될 수esulfonate (MMS), 미토 마이신 C (MMC), 4 nitroquinoline-1-산화물 (4 NQO) 또는 aphidicolin 3, 4. MMS는 DNA 복제를 억제하고 ATR/Chk1-mediated DNA 손상 검사 점은 4-7 활성화 alkylating 요원입니다. UV 조사는 또한 ATR/Chk1-dependent DNA 손상 검사 점 8 트리거합니다. DNA 손상 - 모방 구조 AT70 두 oligonucleotides 폴리 (DA) 70 폴리 (DT) 70 annealed 복잡합니다. AT70 시스템은 빌 Dunphy의 연구실에서 개발 된 널리 9-12 ATR/Chk1 검사 점 (Checkpoint) 신호를 유도하는 데 사용됩니다.
여기, 우리는 (2) DNA 손상 - 모방 구조를 준비하기 위해 두 개의 서로 다른 DNA 손상 방식 (MMS와 UV), (3) Xenopus의 정자 염색질을 치료하는 세포 무료 달걀 추출물 (LSE)를 준비하는 프로토콜은 (1) 설명 AT70, 그리고 (4) 손상된 정자 염색질 또는 DNA 손상 - 모방 구조 LSE에 ATR/Chk1-mediated DNA 손상 검사 점을 실행할 수 있습니다.
Protocol
1. LSE 준비
- 여성 개구리 (Xenopus laevis)는 계란 수집을 위해 두 번 주입하고 있습니다. 첫 번째 주입 (프라이밍)는 개구리 당 100 U PMSG (임산부 마레 세럼 생식샘 자극 호르몬)입니다. 유도 난자 놓고 중이오 개구리가 2 주에 사용할되기 전에 개구리는 최소한 이틀 중이오해야합니다. 주요 개구리에게, 3 ML의 주사기 27 G 바늘을 사용하여 등쪽 림프 주머니에 피하 주사 PMSG.
- 누워있는 달걀을 유도하기 위해 27 G 바늘을 사용하여 등쪽 림프 주머니에 피하 중이오 개구리 당 500 U hCG (인간 Chorionic Gonadotrophin)을 주입. 1X 마크의 수정 벨소리의 솔루션 (MMR) 2 리터를 포함하는 별도의 물통에 주입 개구리를 품다. 수집하기 전에 알을 낳기 위해 개구리에게 14-20 시간을 허용합니다.
- 버킷에서 개구리를 제거하고 약 100 ML가 왼쪽 때까지 MMR 솔루션을 부어. 250 ML의 비커에 달걀을 전송하여 양동이에서 알을 얻습니다.
- 2 % 시스테인의 100 ML (조정을 추가하여 Dejelly 달걀10 M 코와 7.8에 PH). 역 유리 파스퇴르 pipet (직경 0.7 cm) 약 매 30 초와 부드럽게 소용돌이 계란을. 가만히 따르다과 부화하는 동안 두 번 신선한 시스테인로 교체하십시오. 달걀 비커의 맨 아래에있는 더 압축 된 층을 형성 할 때 dejellying 과정은 5-15 분 정도에 완료됩니다.
- 시스테인 솔루션을 무시하고 0.25x MMR과 계란을 세 번 씻는다. 유리 pipet하여 솔루션의 소용돌이 계란합니다. "나쁜"달걀은 간단한 육안 검사에 의해 결정 및 외관의 "띵띵 한"하얀 있습니다. "나쁜"달걀은 회전 후 비커의 중심에 축적됩니다. 파스퇴르 pipet으로 "나쁜"계란을 제거합니다.
- 달걀 용해 버퍼 (ELB) 세 번에 알을 씻으십시오. 파스퇴르 pipet하여 추가 "나쁜"계란을 제거합니다. 14 ML 팔콘 튜브에 달걀을 넣어.
- 달걀을 압축 스윙 버킷 로터로 CL2 IEC 임상 테이블 상단 원심 분리기를 사용하여 188 XG (1,100 RPM)에서 55 초 동안 매 관을 봐. 에서 초과 버퍼를 제거계란 층의 꼭대기. Aprotinin / 류 펩틴 주식의 0.5 μl와 콤팩트 달걀 ML 당 Cytochalasin B 주식의 0.5 μl를 추가합니다.
- 4에 15 분에 16,500 XG (10,000 RPM)에 달걀을 원심 분리기 ° C HB6 스윙 버킷 로터로 Sorvall RC6 플러스 빠른 속도의 원심 분리기를 사용합니다. 원심 분리 한 후, 계란은 관 3 층에 fractionated입니다 각각 지질, 추출 및 난황 / 위로부터 아래로 안료,. 21 G 바늘로 중간 추출물 층의 낮은 부분에 구멍 팔콘 튜브의 측면을. 펑 쳐링 바늘은 플라스틱에 의해 가려 수 있으므로 조심스럽게 바늘을 제거합니다. 추출물을 수집 할 수있는 주사 사이트에 1 ML의 주사기에 부착 된 새로운 21 G 바늘을 삽입합니다. 천천히 지방질과 난황 / 안료 레이어 기포 및 오염을 방지하기 위해 주사기로 추출물을 대기음.
- 차가운 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 추출물를 놓습니다. 계란 추출물의 각 밀리리터를 들어,에서 다음 화학 주식 솔루션을 추가dicated 최종 농도 (괄호에 표시) : (1) 10 μl Cycloheximide (100 μg / ML), (2) 1 μl Aprotinin / 류 펩틴 (10 μg / ML 각), (3) 1 μl Cytochalasin B (5 μg / ML ), (4) 1 μl Dithiothreitol (1 MM) 및 (5) 0.33 μl Nocodazole (3 μg / ML). 계란이 부드럽게 적어도 10 배의 압축을 풉니 반전. 이 신선한 만들어 4 시간 이내에 사용하셔야합니다 LSE입니다. LSE의 품질은 4 시간이나 동결 - 해동 후 손상됩니다.
2. DNA 손상 접근법과 정자 염색질의 치료
- 이전 13 설명한 방법에 따라 정상적인 정자 염색질을 준비합니다.
- MMS - 처리 정자 염색질을 준비
- 0.5 ML 버퍼 X.에서 정상적인 정자 염색질을 Resuspend
- 100 mm의 최종 농도에 염색질을 resuspended 500 μl에 MMS의 ~ 5.5 μl (재고 9.1 M)을 추가합니다.
- 회전 30 분 동안 실온에서 microcentrifuge 관 정자 염색질을 품다.
- m을 돌려스윙 버킷 회 전자와 튜브 어댑터와 IEC CL2 임상 원심 분리기를 사용하여 실온에서 10 분에 686 XG (2,100 RPM)에서 icrocentrifuge 관.
- 표면에 뜨는 취소하고 버퍼 X 플러스 BSA (3 %), DTT (0.1 ㎜) 및 Aprotinin / 류 펩틴 (10 μg / ML 각)의 0.5 ML에서 펠렛을 resuspend.
- 단계 (4) 반복 (5) 두 번 정자 염색질을 씻어합니다.
- hemocytometer로 정자 염색질의 농도를 결정하고 100,000 정자 / μl로 희석. 자세한 사용을위한 -80 ° C의 냉동고에 5 μl aliquots를 저장합니다.
- UV-처리 정자 염색질을 준비
- Parafilm의 한 부분의 표면에 정상적인 정자 염색질의 원하는 금액을 (예 : 10 μl)를 추가합니다.
- UV crosslinker로 Parafilm를 놓습니다. 실험에 따라 원하는 에너지 매개 변수를, 설정하고 UV 빛을 통해 정자 염색질을 손상하기 시작한다. 예를 들어, 1000 J / m 2에 도달하기 약 21 초 정도 소요됩니다.
- UV irra 후diation, UV-처리 정자 염색질은 즉시 계란 추출물에 추가해야합니다.
3. DNA 손상 - 모방 구조의 준비 (AT70)
- 이 합성 oligonucleotides를 해산 폴리 - (다) 각각 70 (A70으로 지정) 및 폴리 (DT) 70 (T70로 지정) 2 μg / μl의 농도로 물에.
- 한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 A70의 100 μl와 T70 100 μl를 추가합니다. heatblock에서 95시 5 분 ° C에 혼합 합성 oligo 솔루션을 끓일.
- 건조 목욕 블록 아웃을 (거기에 혼합 AT가 포함 된 튜브 사용) 해,하고 실험실 벤치에 실내 온도로 식혀 보자. 이 온도 조정은 45-60 분 주위에 걸립니다.
- 냉각 혼합물은 2 μg / μl의 최종 농도에 AT70입니다. 자세한 사용을위한 -20 ° C의 냉동고에 AT70 aliquots의 스토어 10 μl.
4. 손상된 정자 염색질 또는 DNA의 손상과 LSE에서 DNA의 손상 세키가 실행- 모방 구조
- 손상된 정자 염색질과 LSE에 DNA 손상 검사 점을 유도
- 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 LSE의 50 μl를 추가하고 에너지 혼합물의 1 μl 및 손상된 정자 염색질 (최종 농도 ~ 4,000 정자 / μl 반응) 2 μl로 보완합니다.
- 90 분 동안 실온에서 반응 관을 배양하고 관마다 10 분 버려야지.
- 30 분 부화 후 핵 염색 솔루션의 1 μl를 보충 현미경 슬라이드에 반응 혼합물의 1 μl을 투여. 반응 혼합물을 통해 커버 슬립을 놓고 형광 현미경을 통해 핵 형성을 확인합니다. 일반적으로 둥근 핵은 DNA 복제가 시작했습니다 나타내는 부화 후 30 분 이후에 형성됩니다.
- 샘플 버퍼의 90 μl로 반응 혼합물 10 μl보십시오. 샘플을 방지 Chk1 P-S344 또는 안티 Chk1 항체를 사용하여 immunoblotting을 통해 분석하고 있습니다.
- 와 LSE에 DNA 손상 검사 점을 유도AT70
- 에너지 혼합물의 1 μl와 Tautomycin 주식의 1.6 μl를 보충 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 LSE의 50 μl를 추가합니다.
- 각 반응에 미리 만든 AT70 (2 μg / μl) 또는 물 (대조군) 중 1.25 μl를 추가합니다. 90 분 동안 실온에서 반응을 품다. 반응 관마다 10 분 영화.
- 샘플 버퍼의 90 μl로 반응 혼합물 10 μl를 추가합니다. 샘플을 방지 Chk1 P-S344 또는 안티 Chk1 항체를 사용하여 immunoblotting을 통해 검토하고 있습니다.
5. 대표 결과
손상된 정자 염색질 또는 DNA 손상 - 모방 구조는 Xenopus 계란 추출물 시스템에서 ATR/Chk1-mediated DNA 손상 검사 점을 실행할 수 있습니다. MMS는의 지표 Ser344에서 Chk1 인산화 (Chk1 P-S344)를 유도하는 그림 2A 쇼는 ATR의 키나제의 활성화. 그림 2B는 AT70, DNA 등의 손상 - 모방 stru 보여줍니다cture도 Chk1 인산화를 트리거합니다. 총 Chk1 샘플은 두 예에서 컨트롤을로드로 사용됩니다.
1 그림. DNA 손상 검사 점 신호의 다이어그램.
그림 2. Chk1 인산화는 MMS 또는 Xenopus 달걀 추출물의 AT70 치료에 의해 유도된다. (A) MMS-손상된 정자 염색질 (MMS) 또는 일반 정자 염색질 (절약)가 90 분에 계란 추출물에 incubated 수 있습니다. Chk1 Ser344의 인산화 (Chk1 P-S344)과 계란 추출물의 총 Chk1는 immunoblotting을 통해 조사하고 있습니다. (B) AT70 또는 물 (절약) 각각, 달걀 추출물에 추가됩니다. 샘플도 (A)에서와 같이 immunoblotting을 통해 분석하고 있습니다.
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Discussion
Xenopus 계란 추출물을 사용하여 DNA 손상 검사 점을 연구의 몇 가지 장점이 있습니다. 계란 추출물의 사용은 세포주기의 계면에서 동기화 셀 - 무료 추출물 대량를 제공합니다. 계란 추출물 쉽게 저렴한 비용으로 만들 수 있습니다. 이 DNA 나 염색질을 손상하고 계란 추출물에서 대상 단백질을 immunodepleting 후 DNA 손상 검사 점의 결함을 나타 내기 위해 상대적으로 쉽습니다. 그 후, 잠재적 인 기능 결함은 야생 유형 또는 돌연변이 재조합 단백질의 addback하여 "구조"가 될 수 있습니다. 따라서, Xenopus 계란 추출물은 DNA 손상 검사 점의 구조와 기능 분석을위한 강력한 모델 시스템입니다.
LSE 준비는 이전에 14 시연,하지만 우리 프로토콜은 일부 수정이되었습니다. hCG 주사 (18 ° C) 한 후 개구리 잠복기의 온도는 누워있는 계란 매우 중요합니다. 개구리를 처리하고 주입의 더 많은 리소스를 찾을 수 있습니다이전 연구 13,14에서와 같은 인터넷에서 tropicalis.berkeley.edu / home에 / obtaining_embryos / hCG.html / hcg . 일반적으로, LSE 1-3의 ML은 한 개구리에서 파생 된 계란에서 준비하실 수 있습니다. 이 LSE를 준비 약 1 시간 소요하고 주변을 4 시간 동안 얼음에 일반적으로 안정적이다. LSE는이 DNA 손상 검사 점 실험에 사용 LSE의 품질을 동결 타협을 해동 후 필요한 경우 신선한 만들어해야합니다. 단계 1.9에서 우리는, 주식 솔루션을 냉동고에 aliquots를 저장하고 각 화학 물질에 대한 냉동 aliquoted 주식을 사용하는 것이 좋습니다. 우리의 경험에서 이러한 aliquots에는 최대 3 개의 냉동 해동 사이클에 대한 사용할 수 있습니다.
이러한 MMS와 같은 DNA 손상 시약은 Chk1 인산화를 (그림 2A 참조) 실행을 위해 LSE에서 검사되었습니다. DNA 손상 시약은 어느 LSE에 직접 추가하거나 SP를 손상하는 데 사용할 수 있습니다LSE에 추가하기 전에 음의 염색질. DNA 손상 시약의 농도는 가능성이 가장 높은 Chk1 인산화를 실행하는 가장 좋은 조건을 얻기 위해 특정 실험에 최적화해야합니다. UV 조사도 Chk1 인산화 (데이터 미도시)를 통해 피해 정자 염색질과 DNA 손상 검사 점의 연구 활성화에 활용 할 수 있습니다. Xenopus의 Chk1 인산화 사이트 Ser344 인간 8 Chk1 Ser345에 유사 보존 사이트입니다.
합성 oligo AT70의 혼합물은 DNA 손상의 구조를 모방 한 것이 었지요. Tautomycin (인산 가수 분해 효소 억제제)의 존재에 AT70 유발 Chk1의 인산화가 안정화되고 (그림 2B 참조) immunoblotting을 통해 검사를 할 수 있습니다. 총 내생의 Chk1은로드 제어로 사용됩니다. AT70는 Chk1이 phosphorylated된다 나타내는 서양 얼룩에 시각화 할 수 있습니다 총 Chk1의 이동 변화를 트리거합니다. Chk1 인산화에 대한 항체그리고 총 Chk1는 Xenopus의 DNA 손상 검사 점 신호의 분석을 immunoblotting에 적합합니다.
전반적으로, Xenopus의 알 추출물 시스템은 DNA 손상 검사 점을 조사 할 수있는 강력한 셀 - 무료 모델 시스템입니다. 이 프로토콜은 분석을위한 자세한 절차를 제공합니다. 이 시스템은 서로 다른 DNA 손상 방법의 다양한 사용하여 DNA 손상 검사 점의 분자 메커니즘을 연구 할 수 조절 할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 샬롯 노스 캐롤라이나 대학 교수 우수성 Wachovia 기초 기금, 그리고 NIGMS (R15GM101571)에서 교부금에 의해 제공 자금에 의해 부분적으로 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Anti-Chk1 P-S344 antibody | Cell Signaling | 2348L | |
| Anti-Chk1 antibody | Santa Cruz | SC7898 | |
| Aprotinin | MP Biomedicals | 0219115880 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698-5G | |
| Cytochalasin B | EMD | 250233 | |
| Dithiothreitol (DTT) | VWR | JTF780-2 | |
| hCG | Sigma | CG10-10VL | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-1KG | |
| Leupeptin | VWR | 97063-922 | |
| Methyl methanesulfonate (MMS) | Sigma | 129925-5G | |
| Nocodazole | Sigma | M1404-2MG | |
| PMSG | Calbiochem | 367222 | |
| Sample buffer | Sigma | S3401 | |
| Tautomycin | Wako Chemicals USA | 209-12041 | |
| Equipment | |||
| Bucket for egg laying | Rubbermaid commercial products | 6308 | |
| CL2 IEC centrifuge with swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 004260F | |
| HB6 swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 11860 | |
| Sorvall RC6 plus superspeed centrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| UV crosslinker | UVP | 95-0174-01 | |
| Solutions | |||
| 1x MMR | 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM HEPES, adjust pH to 7.8 with 10 M NaOH | ||
| Aprotinin/Leupeptin stock | 10 mg/ml each in water. Store 20 μl aliquots at -80 °C. | ||
| Buffer X | 0.2 M sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, adjust pH to 7.5 by HCl | ||
| Cycloheximide stock | 10 mg/ml in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
| Cytochalasin B stock | 5 mg/ml in DMSO. Store 20 μl aliquots at -20 °C. | ||
| Dithiothreitol (DTT) stock | 1 M in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
| ELB | 0.25 M sucrose, 1 mM DTT, 50 μg/ml cycloheximide, 2.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7 | ||
| Nocodazole stock | 10 mg/ml in DMSO. Store 5 μl aliquots at -80 °C. | ||
| Energy Mixture | 375 mM creatine phosphate, 50 mM ATP, and 25 mM MgCl2. Aliquots are saved at -80 °C. | ||
| Nuclear dye solution | 0.4 μg/ml H–chst 33258, 25% glycerol (v/v), in 1x PBS | ||
| Tautomycin stock | 100 μM in DMSO. Store 10 μl aliquots at -80 °C. | ||
References
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