Summary
Xenopus egg extracto é um sistema modelo útil para investigar o checkpoint danos no DNA. Este protocolo é para a preparação de extractos de ovos de Xenopus e os danos do ADN reagentes indutores de ponto de verificação. Estas técnicas são adaptáveis a uma variedade de abordagens que danificam o ADN no estudo da sinalização checkpoint danificam o DNA.
Abstract
Numa base diária, as células são sujeitas a uma variedade de insultos endógenos e ambientais. Para combater esses insultos, as células desenvolveram posto de controle de danos ao DNA sinalização como um mecanismo de vigilância para detectar danos no DNA e diretos respostas celulares a danos no DNA. Há diversos grupos de proteínas chamados sensores, transdutores e efetores envolvidos na sinalização de DNA checkpoint de dano (Figura 1). Neste caminho complexo de sinalização, ATR (ATM e Rad3-relacionados) é uma das quinases importantes que podem responder a danos no ADN e stress replicação. Activated ATR pode fosforilar os seus substratos a jusante, tais como o Chk1 (Ponto de verificação quinase 1). Consequentemente, fosforiladas e activadas Chk1 conduz a muitos efeitos a jusante do ponto de verificação, incluindo danos no DNA paragem do ciclo celular, a activação da transcrição, reparação de danos do ADN, e a apoptose ou senescência (Figura 1). Quando o DNA é danificado, não para ativar o DNA resultados checkpoint danos em unrepdanos ao ar e, posteriormente, instabilidade genômica. O estudo dos danos de ADN do ponto de verificação será elucidar como as células a manter a integridade do genoma e proporcionar um melhor entendimento de como as doenças humanas, tais como o cancro, se desenvolver.
Extratos de ovos de Xenopus laevis estão surgindo como um poderoso modelo de sistema livre de células extrato no DNA pesquisa checkpoint danos. De baixa velocidade de extracto (LSE) foi inicialmente descrita por grupo Masui 1. A adição de cromatina espermática demembranated para os resultados na formação de núcleos de LSE, onde o DNA é replicado em uma forma semiconservativa uma vez por ciclo celular.
A via de sinalização ATR/Chk1-mediated checkpoint é acionado por dano de DNA ou estresse replicação 2. Dois métodos são usados atualmente para induzir o posto danos ao DNA: abordagens de DNA e DNA danos prejudiciais imitando-estruturas 3. Dano do ADN pode ser induzida por irradiação com ultravioleta (UV), γ-irradiação, metil metanesulfonate (MMS), mitomicina C (MMC), 4-nitroquinolina-1-óxido de (4-NQO), ou afidicolina 3, 4. O MMS é um agente alquilante que inibe a replicação do DNA e ativa o ponto de verificação danos ATR/Chk1-mediated DNA 4-7. Irradiação UV também provoca a ATR/Chk1-dependent DNA 8 checkpoint danos. A estrutura de ADN que imita dano-AT70 é um complexo de recozido de dois oligonucleótidos de poli-(dA) 70 e poli-(dT) 70. O sistema AT70 foi desenvolvido no laboratório Bill Dunphy e é amplamente utilizada para induzir a sinalização de checkpoint ATR/Chk1 9-12.
Aqui, nós descrevemos protocolos (1) para preparar extractos isentos de células de ovos (LSE), (2) para o tratamento de Xenopus com cromatina de esperma dois ADN diferentes abordagens danificar (MMS e UV), (3) para preparar o DNA de danos estrutura imita AT70, e (4) para accionar o ponto de verificação ATR/Chk1-mediated danos no DNA LSE com cromatina espermática danificado ou uma estrutura de ADN que imita danos.
Protocol
1. Preparação LSE
- Rãs do sexo feminino (Xenopus laevis) são injetadas duas vezes para coleta de ovos. A primeira injecção (ferragem) é de 100 U PMSG (gonadotrofina de égua prenhe) por sapo. Rãs deve ser preparada pelo menos dois dias antes de ovo indução assentamento e rãs condicionadas são utilizáveis por até duas semanas. Para rãs primos, injetar por via subcutânea PMSG nos sacos linfáticos dorsal usando uma seringa de 3 ml e 27 agulha G.
- Para induzir a postura de ovos, injetar 500 U hCG (gonadotrofina coriônica humana) por sapo preparado por via subcutânea nos sacos linfáticos dorsal usando uma agulha de 27 G. Incubar rãs injetados em baldes separados contendo 2 litros de solução modificado 1x Marc Ringer (MMR). Permitir rãs 14-20 horas para colocar ovos antes da coleta.
- Retire as rãs dos baldes e despeje a solução MMR até cerca de 100 ml está à esquerda. Obter ovos dos baldes, transferindo os ovos para uma proveta de 250 ml.
- Ovos Dejelly por adição de 100 ml de 2% de cisteína (ajustarpH a 7,8 com KOH 10 M). Agite suavemente os ovos com uma pipeta de vidro invertida Pasteur (0,7 cm de diâmetro), aproximadamente a cada 30 seg. Decantar e substituir com cisteína fresco duas vezes durante a incubação. O processo está completo dejellying em cerca de 5-15 min quando os ovos formar uma camada mais condensada no fundo da proveta.
- Rejeitar a solução cisteína e lavar os ovos três vezes com MMR 0,25 x. Redemoinho os ovos na solução por uma pipeta de vidro. "Bad" ovos são determinadas por inspeção visual simples e são brancos "inchado" na aparência. Os "maus" ovos irá acumular-se no centro do copo, após agitação. Remover "maus" ovos por uma pipeta de Pasteur.
- Lavar os ovos com Lise Egg Buffer (ELB) três vezes. Remover quaisquer adicionais "maus" ovos por uma pipeta de Pasteur. Despeje os ovos em um tubo Falcon 14 ml.
- Gire o tubo de Falcon por 55 segundos a 188 xg (1.100 rpm) com o CL2 IEC centrífuga de mesa clínica com um rotor basculante para compactar os ovos. Remover o excesso de tampãotopo da camada de ovo. Adicione 0,5 ul da Aprotinina estoque Leupeptin / e 0,5 ul de estoque citocalasina B por ml de ovos compactadas.
- Centrifugar ovos em 16.500 xg (10.000 rpm) durante 15 min a 4 ° C utilizando o RC6 Sorvall mais centrifugadora superspeed com HB6 rotor basculante. Após centrifugação, os ovos são fraccionados em três camadas do tubo: extracto de lípidos, e / gema de pigmento a partir de cima para baixo, respectivamente. Perfurar a parede do tubo Falcon na porção inferior da camada de meio de extracto com uma agulha G 21. Remova cuidadosamente a agulha como a agulha de perfuração pode ser obstruída por plástico. Insira uma nova agulha 21 G ligada a uma seringa de 1 ml para o local de punção para recolher o extracto. Lentamente, aspirar o extracto para dentro da seringa, para evitar as bolhas de ar e contaminação com o lípido e / gema de pigmento camadas.
- Colocar-se os extractos num tubo refrigerado microcentrífuga de 1,5 ml. Por cada mililitro de extracto de ovo, adicionar as seguintes soluções de produtos químicos para o emconcentração final dicated (mostrada entre parêntesis): (1) 10 ul de cicloheximida (100 ug / ml), (2) 1 ul de aprotinina / leupeptina (10 | ig / ml de cada), (3) 1 ul de citocalasina B (5 ug / ml ), (4) 1 ul de ditiotreitol (1 mM), e (5) Nocodazole 0,33 ul (3 ug / ml). Inverter o ovo extrair pelo menos 10 vezes, com cuidado. Este é o LSE, a qual deve ser feita e utilizada dentro de 4 hr. A qualidade da LSE é comprometido após 4 h ou congelação-descongelação.
2. Tratamento da cromatina de espermatozóides com abordagens danificar o DNA
- Prepare cromatina espermática normal de acordo com o método descrito previamente 13.
- Prepare MMS-tratado cromatina espermática
- Ressuspender cromatina espermática normal em 0,5 ml de tampão de X.
- Adicionar ~ pi 5,5 de MMS (9,1 M em stock) a 500 ul de cromatina ressuspendidas a uma concentração final de 100 mM.
- Incubar cromatina espermática em tubo de microcentrífuga à temperatura ambiente durante 30 min, com rotação.
- Gire a mtubo icrocentrifuge a 686 xg (2100 rpm) durante 10 min à temperatura ambiente usando a centrífuga IEC CL2 clínico com rotor basculante e adaptadores de tubos.
- Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 0,5 ml de tampão X mais BSA (3%), DTT (0,1 mM) e aprotinina / leupeptina (10 | ig / ml de cada).
- Repetir os passos (4) e (5) duas vezes para lavar a cromatina de esperma.
- Determinar a concentração de cromatina espermática com um hemocitómetro e diluir a 100.000 esperma / ul. Guardar aliquotas de 5 uL a -80 ° C congelador para posterior utilização.
- Prepare UV-tratado cromatina espermática
- Adicionar a quantidade desejada (por exemplo, 10 ul) da cromatina espermática normal sobre a superfície de uma peça de Parafilm.
- Coloque o Parafilm num reticulador de UV. Ajuste o parâmetro de energia desejado, dependendo da sua experiência, e começar a danificar a cromatina de espermatozóides através da luz UV. Por exemplo, demora aproximadamente 21 segundos para atingir 1000 J / m 2.
- Depois de irradiação UVdiação, cromatina espermática UV-tratados devem ser adicionadas a extractos de ovos imediatamente.
3. Preparação de um DNA Damage Estrutura mimetizando-(AT70)
- Dissolver os dois oligonucleótidos sintéticos de poli-(dA) 70 (designada como A70) e poli-(dT) 70 (designado como T70) em água até uma concentração de 2 ug / uL, respectivamente.
- Adicionar 100 ul de A70 e 100 ul de T70 para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Ferver solução mista oligo sintético durante 5 min a 95 ° C em um heatblock.
- Leve o bloco de banho seco para fora (com o tubo contendo EM mistura no mesmo), e deixe esfriar até a temperatura ambiente em um banco de laboratório. Este ajustamento de temperatura leva cerca de 45-60 min.
- A mistura arrefecida é AT70, com uma concentração final de 2 ug / uL. Ul da loja 10 da AT70 alíquotas em congelador -20 ° C para posterior utilização.
4. Provocando o Checkpoint danos no DNA em LSE com cromatina esperma danificado ou um dano de DNAImitando-Estrutura
- Induzir checkpoint danos no DNA em LSE com cromatina de esperma danificado
- Adicionar 50 ul de LSE para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e complementar com 1 ul de mistura de energia e 2 ul de cromatina espermática danificado (concentração final ~ 4000 esperma / ul de reacção).
- Incubar o tubo de reacção à temperatura ambiente durante 90 min e apertar o tubo a cada 10 min.
- Pipetar 1 ul de mistura de reacção sobre uma lâmina de microscópio e suplementado com 1 ul de solução de corante nuclear após 30 min de incubação. Coloque uma lamela sobre a mistura de reacção e verificar se a formação de núcleos de via microscópio de fluorescência. Tipicamente, os núcleos redondos irá formar após 30 min de incubação, indicando que a replicação do ADN tenha iniciado.
- Tomar 10 ul da mistura de reacção em 90 ul de tampão de amostra. As amostras são analisadas através de imunotransf erência utilizando anticorpos anti-P-S344 Chk1 ou anti-anticorpos de Chk1.
- Checkpoint induzir danos no DNA em LSE com aAT70
- Adicionar 50 ul de LSE para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml suplementado com 1 ul de mistura de energia e de 1,6 ul de estoque Tautomycin.
- Adicionar 1,25 ul de pré-fabricados AT70 (2 ug / uL) e água (como controlo negativo) a cada reacção. Incubar as reacções à temperatura ambiente durante 90 min. Flick os tubos de reacção a cada 10 minutos.
- Adicionam-se 10 ul da mistura de reacção em 90 ul de tampão de amostra. As amostras são analisadas por meio de imunoblot utilizando anti-P-S344 Chk1 ou anti-anticorpos de Chk1.
5. Resultados representativos
A cromatina espermática danificadas ou estrutura danificam o DNA imita pode desencadear o checkpoint danos ATR/Chk1-mediated ADN no sistema de extracto de ovo de Xenopus. Figura 2a mostra que o MMS induz fosforilação Chk1 a Ser344 (Chk1 P-S344), o qual é um indicador da ATR activação da cinase. Figura 2B mostra que AT70, como um dano do ADN que imita-structure, também aciona Chk1 fosforilação. Amostras totais Chk1 são usados como controlos de carga em ambos os exemplos.
Figura 1. Um diagrama de ponto de verificação da sinalização de danos ao DNA.
Figura 2. Chk1 fosforilação é induzida por uma ou MMS AT70 tratamentos em extractos de Xenopus ovo. (A) MMS-danificada cromatina espermática (MMS) ou cromatina espermática normal (Con) são incubados em extractos de ovos durante 90 min. Chk1 fosforilação em Ser344 (Chk1 P-S344) e Chk1 total em extractos de ovos são examinadas através de imunotransf erência. (B) ou de água AT70 (Con) são adicionados em extractos de ovos, respectivamente. As amostras são também analisados através de imunotransf erência como em (A).
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Discussion
Existem várias vantagens em estudar o posto danos no DNA utilizando extratos de Xenopus ovo. A utilização de extractos de ovo fornece uma grande quantidade de extractos livres de células sincronizadas em interfase do ciclo celular. Os extractos de ovos pode ser feita fácil e barata. É relativamente fácil para danificar o DNA ou cromatina e revelar um defeito no ponto de verificação, após danos no ADN immunodepleting uma proteína alvo a partir de extracto de ovo. Subsequentemente, um defeito da função potencial pode ser "resgatado" por addback de tipo selvagem ou mutantes, proteínas recombinantes. Portanto, Xenopus egg extracto é um sistema poderoso modelo para a estrutura e função de análise de checkpoint danos no DNA.
A preparação LSE foi demonstrado anteriormente 14, mas o nosso protocolo tem algumas modificações. A temperatura de incubação de rãs após injecção de hCG (18 ° C) é muito importante para a postura de ovos. Mais recursos de manuseio e injeção de rãs podem ser encontradosde estudos anteriores 13,14 e na Internet, tais como tropicalis.berkeley.edu / home / obtaining_embryos / hcg / hCG.html . Geralmente, 1-3 ml de LSE podem ser preparados a partir de ovos derivados de uma rã. Demora cerca de uma hora para preparar o LSE e é tipicamente estável em gelo durante cerca de 4 horas. LSE tem de ser feita quando é necessária uma vez que o congelamento e descongelamento compromete a qualidade do LSE para utilização em experiências de DNA de checkpoint de dano. No passo 1.9, recomendamos fazer soluções de estoque, economizando alíquotas em congeladores, e usando estoques congelados alíquotas para cada substância química. Na nossa experiência, as alíquotas são utilizáveis para um máximo de 3 ciclos de congelação-descongelação.
Reagentes que danificam o ADN, tais como MMS foram examinados em LSE para desencadear Chk1 fosforilação (ver Figura 2A). Reagentes que danificam o ADN pode ser adicionado directamente a LSE ou utilizado para danificar sperm cromatina antes da adição de LSE. A concentração de reagentes que danificam o ADN terá maior probabilidade de ser optimizado para as experiências específicas, de modo a obter as melhores condições para desencadear Chk1 fosforilação. Irradiação UV também pode ser utilizado para danificar o esperma cromatina e activação estudo do checkpoint danos ao DNA através de Chk1 de fosforilação (dados não apresentados). O local de fosforilação Chk1 Ser344 em Xenopus é o local conservado análogo ao Chk1 Ser345 em humanos 8.
A mistura oligo sintético AT70 imita a estrutura do dano do ADN. Na presença de Tautomycin (um inibidor da fosfatase), AT70-fosforilação induzida Chk1 é estabilizado e pode ser analisado através de imunotransf erência (como mostrado na Figura 2B). O Chk1 endógeno total é utilizado como um controlo de carregamento. AT70 provoca um deslocamento na mobilidade Chk1 total que pode ser visualizado numa transferência de Western, indicando Chk1 é fosforilada. Os anticorpos contra a fosforilação Chk1e Chk1 totais são adequados para análise de imunotransf erência de ADN de sinalização checkpoint danos em Xenopus.
No geral, o sistema de extractos de ovos de Xenopus é um sistema poderoso modelo livre de células para investigar o checkpoint danos no DNA. Este protocolo fornece os procedimentos detalhados para tal análise. Este sistema pode ser modulada de modo a estudar os mecanismos moleculares da checkpoint dano do ADN, utilizando uma variedade de abordagens diferentes de ADN prejudiciais.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado em parte por fundos fornecidos pela Universidade de Carolina do Norte em Charlotte, fundo Wachovia base para a excelência do corpo docente, e uma bolsa de NIGMS (R15GM101571).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Anti-Chk1 P-S344 antibody | Cell Signaling | 2348L | |
| Anti-Chk1 antibody | Santa Cruz | SC7898 | |
| Aprotinin | MP Biomedicals | 0219115880 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698-5G | |
| Cytochalasin B | EMD | 250233 | |
| Dithiothreitol (DTT) | VWR | JTF780-2 | |
| hCG | Sigma | CG10-10VL | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-1KG | |
| Leupeptin | VWR | 97063-922 | |
| Methyl methanesulfonate (MMS) | Sigma | 129925-5G | |
| Nocodazole | Sigma | M1404-2MG | |
| PMSG | Calbiochem | 367222 | |
| Sample buffer | Sigma | S3401 | |
| Tautomycin | Wako Chemicals USA | 209-12041 | |
| Equipment | |||
| Bucket for egg laying | Rubbermaid commercial products | 6308 | |
| CL2 IEC centrifuge with swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 004260F | |
| HB6 swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 11860 | |
| Sorvall RC6 plus superspeed centrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| UV crosslinker | UVP | 95-0174-01 | |
| Solutions | |||
| 1x MMR | 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM HEPES, adjust pH to 7.8 with 10 M NaOH | ||
| Aprotinin/Leupeptin stock | 10 mg/ml each in water. Store 20 μl aliquots at -80 °C. | ||
| Buffer X | 0.2 M sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, adjust pH to 7.5 by HCl | ||
| Cycloheximide stock | 10 mg/ml in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
| Cytochalasin B stock | 5 mg/ml in DMSO. Store 20 μl aliquots at -20 °C. | ||
| Dithiothreitol (DTT) stock | 1 M in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
| ELB | 0.25 M sucrose, 1 mM DTT, 50 μg/ml cycloheximide, 2.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7 | ||
| Nocodazole stock | 10 mg/ml in DMSO. Store 5 μl aliquots at -80 °C. | ||
| Energy Mixture | 375 mM creatine phosphate, 50 mM ATP, and 25 mM MgCl2. Aliquots are saved at -80 °C. | ||
| Nuclear dye solution | 0.4 μg/ml H–chst 33258, 25% glycerol (v/v), in 1x PBS | ||
| Tautomycin stock | 100 μM in DMSO. Store 10 μl aliquots at -80 °C. | ||
References
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