Summary
Xenopus ei extract is een nuttig modelsysteem om de DNA schade checkpoint onderzoeken. Dit protocol is voor de bereiding van Xenopus ei extracten en DNA schade checkpoint inducerende reagentia. Deze technieken kunnen worden aangepast aan een verscheidenheid van DNA beschadigende benaderingen in de studie van de DNA schade checkpoint signaling.
Abstract
Op een dagelijkse basis, worden cellen blootgesteld aan verschillende endogene en milieubeschadigingen. Om deze beledigingen bestrijden zijn cellen ontwikkeld DNA schade checkpoint signalering als een controlemechanisme om DNA schade en direct cellulaire responsen waarnemen op DNA schade. Er zijn verschillende groepen van eiwitten genaamd sensoren, transducers en effectors betrokken bij DNA schade checkpoint signalering (figuur 1). In dit complex signaalweg ATR (ATM en Rad3 gerelateerde) is een van de belangrijkste kinases die reageren op DNA schade en replicatie stress. Geactiveerde ATR kan fosforyleren haar downstream substraten zoals Chk1 (Checkpoint kinase 1). Bijgevolg gefosforyleerd en geactiveerd Chk1 leidt tot veel stroomafwaarts gelegen in de DNA schade checkpoint waaronder celcyclus, transcriptie activatie DNA schade herstel en apoptose of senescentie (figuur 1). Als DNA beschadigd is, niet aan de DNA-schade checkpoint resultaten te activeren in unrepuitgezonden schade en vervolgens genomische instabiliteit. De studie van de DNA schade checkpoint verduidelijken hoe cellen genomische integriteit en een beter begrip van menselijke ziekten, zoals kanker, te ontwikkelen.
Xenopus laevis ei extracten ontstaan als krachtig celvrij extract modelsysteem DNA schade checkpoint onderzoek. Lage snelheid extract (LSE) werd aanvankelijk beschreven door de Masui groep 1. De toevoeging van demembranated sperma chromatine te LSE resulteert in vorming kernen waar DNA wordt gerepliceerd in een semiconservatieve wijze eenmaal per celcyclus.
De ATR/Chk1-mediated checkpoint signaleringsroute wordt geactiveerd door DNA-schade of replicatie spanning 2. Twee methoden worden momenteel gebruikt om de DNA schade veroorzaken checkpoint: DNA beschadigende benaderingen en DNA schade gelijkende structuren 3. DNA schade kan worden veroorzaakt door ultraviolet (UV) bestraling, γ-straling, methyl methaanesulfonate (MMS), mitomycine C (MMC), 4-nitrochinoline-1-oxide (4-NQO) of aphidicoline 3, 4. MMS is een alkylerende stof die DNA-replicatie remt en activeert de ATR/Chk1-mediated DNA-schade checkpoint 4-7. UV bestraling activeert ook ATR/Chk1-dependent DNA schade checkpoint 8. De DNA schade gelijkende structuur AT70 is gegloeide complex van twee oligonucleotiden poly-(dA) 70 en poly-(dT) 70. De AT70-systeem is ontwikkeld in het laboratorium van Bill Dunphy's en wordt veel gebruikt om negen-twaalf veroorzaken ATR/Chk1 checkpoint signalering.
We beschrijven protocollen (1) celvrije extracten ei (LSE) te bereiden, (2) Xenopus sperma chromatine behandelen met twee verschillende DNA beschadigen benaderingen (MMS en UV), (3) de DNA schade gelijkende structuur bereiden AT70, en (4) de ATR/Chk1-mediated DNA schade veroorzaken ijkpunt in LSE met beschadigde sperma chromatine of DNA schade-nabootsende structuur.
Protocol
1. LSE Voorbereiding
- Vrouw kikkers (Xenopus laevis) worden twee keer geïnjecteerd voor eieren ophalen. De eerste injectie (priming) is 100 U PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin) per kikker. Kikkers moet worden voorbehandeld ten minste twee dagen voor de inducerende leggen van eieren en gegrond kikkers zijn bruikbaar voor maximaal twee weken. Om prime kikkers, injecteren PMSG subcutaan in de dorsale lymfe zakken met behulp van een 3 ml spuit en 27 G-naald.
- Om eieren leggen te induceren, injecteren 500 U hCG (humaan choriongonadotrofine) per geprimed kikker subcutaan in de dorsale lymfe zakken met behulp van een 27 G naald. Incubeer geïnjecteerde kikkers in aparte emmers met 2 liter oplossing 1x Marc's gemodificeerd Ringer (BMR). Laat kikkers 14 tot 20 uur om eieren te leggen stuk.
- Verwijder de kikkers uit de emmers en giet de BMR-oplossing tot ongeveer 100 ml over is. Verkrijgen eieren uit de emmers door overdracht eieren naar een 250 ml bekerglas.
- Dejelly eieren door toevoeging van 100 ml van 2% cysteine (paspH op 7,8 met 10 M KOH). Zwenk de eieren met een omgekeerde glazen Pasteur pipet (0,7 cm in diameter) ongeveer elke 30 sec. Giet en tweemaal vervangen door vers cysteine tijdens incubatie. Het dejellying is voltooid in ongeveer 5-15 min wanneer de eieren vormen een gecondenseerde laag op de bodem van het bekerglas.
- Gooi de cysteïne oplossing weg en was eieren drie keer met 0,25 x MMR. Swirl de eieren in de oplossing door een glazen pipet. "Bad" eieren worden bepaald door simpele visuele inspectie en "puffy" wit uiterlijk. De "slechte" eieren accumuleren in het midden van het bekerglas na zwenken. Verwijder "slechte" eieren door een Pasteur pipet.
- Was eieren met ei Lysis Buffer (ELB) drie keer. Verwijder eventuele extra "slechte" eieren door een Pasteur pipet. Giet de eieren in een 14 ml Falcon buis.
- Draai de Falcon buis voor 55 sec op 188 xg (1.100 rpm) met behulp van de CL2 IEC klinische table-top centrifuge met een swingende emmer rotor om de eieren te comprimeren. Verwijder overtollig buffer van debovenkant van de legkippen. Voeg 0,5 ul van aprotinine / Leupeptine voorraad en 0,5 pi van cytochalasine B voorraad per ml verdichte eieren.
- Centrifugeer eieren bij 16.500 xg (10.000 rpm) gedurende 15 min bij 4 ° C met de Sorvall supersnelle centrifuge RC6 plus met HB6 slingeren bucket rotor. Na centrifugeren eieren gesplitst in drie lagen in de buis: lipide extract en eigeel / pigment van boven naar beneden, respectievelijk. Prik in de zijkant van de Falcon buis in het onderste gedeelte van de middelste laag extract met een 21 G naald. Verwijder voorzichtig de naald als de punctienaald kan worden belemmerd door plastic. Plaats een nieuwe 21 G naald bevestigd aan een 1 ml spuit in de prikplaats om het extract te verzamelen. Langzaam zuigen het extract in de spuit om luchtbellen en besmetting met het lipide en eigeel / pigment lagen te voorkomen.
- Plaats de extracten in een gekoeld 1,5 ml microcentrifugebuis. Voor elke milliliter ei-extract, voeg de volgende chemische voorraad oplossingen voor de indicated eindconcentratie (tussen haakjes): (1) 10 ul Cycloheximide (100 ug / ml), (2) 1 pl aprotinine / Leupeptin (10 ug / ml elk), (3) 1 pl cytochalasine B (5 ug / ml ) (4) 1 ui Dithiothreitol (1 mM) en (5) 0,33 pl nocodazole (3 ug / ml). Inverteer het ei zacht extract ten minste 10 maal. Dit is de LSE, die dient te geschieden verse en binnen 4 uur. De kwaliteit van LSE gecompromitteerd na 4 uur of vries-dooi.
2. Behandeling van sperma chromatine met DNA-beschadigende Approaches
- Bereid normale zaadcellen chromatine volgens de werkwijze eerder beschreven 13.
- Bereid MMS-behandelde sperma chromatine
- Resuspendeer normale sperma chromatine in 0,5 ml buffer X.
- Voeg ~ 5,5 pl MMS (9,1 M voorraad) 500 ul geresuspendeerd chromatine tot een eindconcentratie van 100 mM.
- Incubeer sperma chromatine in microcentrifugebuis bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten draaien.
- Draai de microcentrifuge buis 686 xg (2.100 rpm) gedurende 10 min bij kamertemperatuur met de IEC klinische centrifuge CL2 met swingende bucket rotor en buis adapters.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 0,5 ml buffer X plus BSA (3%), DTT (0,1 mM) en aprotinine / Leupeptin (10 ug / ml elk).
- Herhaal de stappen (4) en (5) twee keer om het sperma chromatine te wassen.
- De concentratie van zaadcellen chromatine met een hemocytometer en verdun tot 100.000 sperma / ul. Bewaar 5 pi aliquots in -80 ° C vriezer voor verder gebruik.
- Bereid UV-behandelde sperma chromatine
- Voeg de gewenste hoeveelheid (bijv. 10 pl) van normale zaadcellen chromatine op het oppervlak van een stuk Parafilm.
- Plaats de Parafilm een UV crosslinker. Stel de gewenste energie-parameter, afhankelijk van uw experiment, en beginnen om het sperma chromatine via UV-licht beschadigen. Bijvoorbeeld duurt ongeveer 21 sec te bereiken 1.000 J / m 2.
- Na UV bestramediatie, UV-behandelde sperma chromatine worden toegevoegd aan ei extracten onmiddellijk.
3. Voorbereiding van een DNA Damage-nabootsende Structuur (AT70)
- Los twee synthetische oligonucleotiden poly-(dA) 70 (aangeduid als A70) en poly-(dT) 70 (aangeduid als T70) in water tot een concentratie van 2 pg / pl respectievelijk.
- Voeg 100 ul A70 en 100 ul T70 een 1,5 ml microcentrifugebuis. Kook gemengde synthetische oligo-oplossing gedurende 5 minuten bij 95 ° C in een heatblock.
- Neem de droge bad block out (met de buis met AT mengsel erin), en laat het afkoelen tot kamertemperatuur op een lab bank. Deze temperatuur instelling duurt ongeveer 45-60 min..
- Het afgekoelde mengsel AT70 met een eindconcentratie van 2 ug / ul. Store 10 pi aliquots in AT70 -20 ° C vriezer voor verder gebruik.
4. Het activeren van de DNA-schade Checkpoint in LSE met beschadigde Sperma chromatine of een DNA-schade-Nabootsende Structuur
- DNA-beschadigingen induceert controlepost in LSE met beschadigde zaadcellen chromatine
- Voeg 50 ul van LSE een 1,5 ml microcentrifugebuis en aanvullen met 1 pi Energy mengsel en 2 ui beschadigde sperma chromatine (eindconcentratie 4.000 ~ sperma / ul reactie).
- Incubeer de reactiebuis bij kamertemperatuur gedurende 90 min en schudt de buis elke 10 minuten.
- Doseer 1 pi reactiemengsel op een microscoopglaasje aangevuld met 1 pi van nucleaire kleurstof oplossing na 30 min incubatie. Plaats een dekglaasje over het reactiemengsel en controleer kernen vorming via fluorescentiemicroscoop. Typisch zal door atoomkernen na 30 min incubatie, waarin DNA replicatie is gestart.
- Neem 10 pi van het reactiemengsel in 90 pl monsterbuffer. Monsters worden geanalyseerd via immuunblotting met anti-Chk1 P-S344 of anti-Chk1 antilichamen.
- DNA-beschadigingen induceert controlepost in LSE met deAT70
- Voeg 50 ul van LSE een 1,5 ml microcentrifugebuis aangevuld met 1 pi Energy mengsel en 1,6 pl Tautomycin stock.
- Voeg 1,25 pl vooraf gemaakte AT70 (2 pg / pl) of water (als negatieve controle) aan elk reactievat. Incubeer de reacties bij kamertemperatuur gedurende 90 minuten. Flick de reageerbuisjes om de 10 minuten.
- Voeg 10 ul van het reactiemengsel in 90 pl monsterbuffer. De monsters worden onderzocht via immunoblotting met anti-Chk1 P-S344 of anti-Chk1 antilichamen.
5. Representatieve resultaten
De beschadigde sperma chromatine of DNA schade-nabootsende structuur leiden tot de ATR/Chk1-mediated DNA schade checkpoint in de Xenopus ei extract systeem. Figuur 2A toont dat MMS Chk1 fosforylatie op Ser344 (Chk1 P-S344), een indicator van induceert ATR kinase activatie. Figuur 2B toont dat AT70 als DNA schade-nabootsende structure, ook triggers Chk1 fosforylering. Totaal Chk1 monsters worden gebruikt voor het laden controles beide voorbeelden.
Figuur 1. Een diagram van de DNA schade checkpoint signaling.
Figuur 2. Chk1 fosforylering wordt geïnduceerd door een MMS of AT70 behandelingen in Xenopus ei extracten. (A) MMS beschadigde sperma chromatine (MMS) of normale zaadcellen chromatine (Con) geïncubeerd in ei extracten gedurende 90 minuten. Chk1 fosforylatie op Ser344 (Chk1 P-S344) en de totale Chk1 in ei extracten worden onderzocht aan de hand immunoblotting. (B) AT70 of water (Con) worden toegevoegd in ei-extracten, respectievelijk. Monsters ook geanalyseerd via immunoblotting zoals in (A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn verschillende voordelen bij het bestuderen van DNA schade checkpoint met Xenopus ei extracten. Het gebruik van ei extracten biedt een grote hoeveelheid celvrije extracten gesynchroniseerd interfase van de celcyclus. Het ei extracten gemakkelijk en goedkoop worden gemaakt. Het is relatief eenvoudig aan DNA of chromatine beschadigen en een defect in de DNA schade checkpoint blijkt na immunodepleting een doeleiwit uit ei extract. Vervolgens kan een potentiaalfunctie defect worden "gered" door addback van wild type of mutante recombinante eiwitten. Daarom Xenopus ei extract is een krachtig modelsysteem voor structuur en functie analyse van DNA schade checkpoint.
De LSE preparaat is eerder 14 aangetoond, maar ons protocol heeft een aantal wijzigingen. De temperatuur van het incuberen van kikkers na de hCG injectie (18 ° C) is zeer cruciaal voor de eileg. Meer middelen van de behandeling en het injecteren van kikkers kan worden gevondenvan eerdere studies 13,14 en op het internet, zoals tropicalis.berkeley.edu / home / obtaining_embryos / hcg / hCG.html . In het algemeen kan 1-3 ml LSE worden bereid uit eieren afkomstig van een kikker. Het duurt ongeveer een uur voor te bereiden van de LSE en het is meestal stabiel op ijs gedurende ongeveer 4 uur. LSE worden gemaakt wanneer het vers is noodzakelijk aangezien bevriezen en ontdooien compromissen de kwaliteit van de LSE voor gebruik in DNA schade checkpoint experimenten. In stap 1.9, raden wij maken stockoplossingen, het opslaan van monsters in vriezers, en het gebruik van bevroren hoeveelheden verdeeld voorraden voor elke chemische stof. In onze ervaring deze aliquots bruikbaar tot 3 vries-dooi cycli.
DNA beschadigende reagentia zoals MMS zijn onderzocht in LSE voor het activeren Chk1 fosforylering (zie figuur 2A). DNA beschadigende reagentia kan direct worden toegevoegd aan LSE of gebruikt sp beschadigenerm chromatine vóór toevoeging aan LSE. De concentratie van DNA beschadigende reagentia waarschijnlijk moeten worden geoptimaliseerd voor specifieke experimenten om de beste omstandigheden om Chk1 fosforylatie activeren verkrijgen. UV-bestraling kan ook worden gebruikt om schade sperma chromatine en activatie van de studie DNA schade checkpoint via Chk1 fosforylering (data niet getoond). De Chk1 fosforylatieplaats Ser344 in Xenopus de geconserveerde plaats analoog aan Chk1 Ser345 in mensen 8.
De synthetische oligo AT70 mengsel bootst de structuur van DNA schade. In aanwezigheid van Tautomycin (een fosfatase-inhibitor), wordt AT70 geïnduceerde fosforylatie Chk1 gestabiliseerd en kan worden onderzocht via immunoblotting (zie figuur 2B). De totale endogene Chk1 wordt als loading controle. AT70 veroorzaakt een verschuiving in mobiliteit totale Chk1 die kan worden gevisualiseerd op een Western blot, waarin Chk1 gefosforyleerd. Antistoffen tegen Chk1 fosforyleringen totale Chk1 zijn geschikt voor immunoblotting analyse van DNA schade checkpoint signalering in Xenopus.
Algemeen de Xenopus ei extracten is een krachtig celvrij modelsysteem om de DNA schade checkpoint onderzoeken. Dit protocol voorziet in de gedetailleerde procedures voor een dergelijke analyse. Dit systeem kan worden gemoduleerd om de moleculaire mechanismen van DNA schade checkpoint met een verschillende DNA beschadigende benaderingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door fondsen die door de Universiteit van North Carolina in Charlotte, Wachovia stichting fonds voor faculteit excellentie, en een subsidie van NIGMS (R15GM101571).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Anti-Chk1 P-S344 antibody | Cell Signaling | 2348L | |
| Anti-Chk1 antibody | Santa Cruz | SC7898 | |
| Aprotinin | MP Biomedicals | 0219115880 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698-5G | |
| Cytochalasin B | EMD | 250233 | |
| Dithiothreitol (DTT) | VWR | JTF780-2 | |
| hCG | Sigma | CG10-10VL | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-1KG | |
| Leupeptin | VWR | 97063-922 | |
| Methyl methanesulfonate (MMS) | Sigma | 129925-5G | |
| Nocodazole | Sigma | M1404-2MG | |
| PMSG | Calbiochem | 367222 | |
| Sample buffer | Sigma | S3401 | |
| Tautomycin | Wako Chemicals USA | 209-12041 | |
| Equipment | |||
| Bucket for egg laying | Rubbermaid commercial products | 6308 | |
| CL2 IEC centrifuge with swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 004260F | |
| HB6 swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 11860 | |
| Sorvall RC6 plus superspeed centrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| UV crosslinker | UVP | 95-0174-01 | |
| Solutions | |||
| 1x MMR | 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM HEPES, adjust pH to 7.8 with 10 M NaOH | ||
| Aprotinin/Leupeptin stock | 10 mg/ml each in water. Store 20 μl aliquots at -80 °C. | ||
| Buffer X | 0.2 M sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, adjust pH to 7.5 by HCl | ||
| Cycloheximide stock | 10 mg/ml in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
| Cytochalasin B stock | 5 mg/ml in DMSO. Store 20 μl aliquots at -20 °C. | ||
| Dithiothreitol (DTT) stock | 1 M in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
| ELB | 0.25 M sucrose, 1 mM DTT, 50 μg/ml cycloheximide, 2.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7 | ||
| Nocodazole stock | 10 mg/ml in DMSO. Store 5 μl aliquots at -80 °C. | ||
| Energy Mixture | 375 mM creatine phosphate, 50 mM ATP, and 25 mM MgCl2. Aliquots are saved at -80 °C. | ||
| Nuclear dye solution | 0.4 μg/ml H–chst 33258, 25% glycerol (v/v), in 1x PBS | ||
| Tautomycin stock | 100 μM in DMSO. Store 10 μl aliquots at -80 °C. | ||
References
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220 (4598), 719-721 (1983).
- Cimprich, K. A., Cortez, D. ATR: an essential regulator of genome integrity. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).
- Lupardus, P. J., Van, C., Cimprich, K. A. Analyzing the ATR-mediated checkpoint using Xenopus egg extracts. Methods. 41 (2), 222-231 (2007).
- Lupardus, P. J., Byun, T., Yee, M. C., Hekmat-Nejad, M., Cimprich, K. A. A requirement for replication in activation of the ATR-dependent DNA damage checkpoint. Genes Dev. 16 (18), 2327-2332 (2002).
- Stokes, M. P., Van Hatten, R., Lindsay, H. D., Michael, W. M. DNA replication is required for the checkpoint response to damaged DNA in Xenopus egg extracts. J. Cell Biol. 158 (5), 863-872 (2002).
- Kato, K., Strauss, B. Accumulation of an intermediate in DNA synthesis by HEp.2 cells treated with methyl methanesulfonate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (5), 1969-1973 (1974).
- Paulovich, A. G., Hartwell, L. H. A checkpoint regulates the rate of progression through S phase in S. cerevisiae in response to DNA damage. Cell. 82 (5), 841-847 (1995).
- Guo, Z., Kumagai, A., Wang, S. X., Dunphy, W. G. Requirement for Atr in phosphorylation of Chk1 and cell cycle regulation in response to DNA replication blocks and UV-damaged DNA in Xenopus egg extracts. Genes Dev. 14 (21), 2745-2756 (2000).
- Jazayeri, A., Balestrini, A., Garner, E., Haber, J. E., Costanzo, V. Mre11-Rad50-Nbs1-dependent processing of DNA breaks generates oligonucleotides that stimulate ATM activity. EMBO. J. 27 (14), 1953-1962 (2008).
- Kumagai, A., Dunphy, W. G. Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts. Mol. Cell. 6 (4), 839-849 (2000).
- Yan, S., Lindsay, H. D., Michael, W. M. Direct requirement for Xmus101 in ATR-mediated phosphorylation of Claspin bound Chk1 during checkpoint signaling. J. Cell Biol. 173 (2), 181-186 (2006).
- Shiotani, B., Zou, L. Single-stranded DNA orchestrates an ATM-to-ATR switch at DNA breaks. Mol. Cell. 33 (5), 547-558 (2009).
- Tutter, A. V., Walter, J. C. Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs. Methods Mol. Biol. 322, 121-137 (2006).
- Cross, M. K., Powers, M. Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts. J. Vis. Exp. (18), e891 (2008).
