Summary
Xenopus uovo estratto è un sistema modello utile per studiare il punto di controllo danno al DNA. Questo protocollo è per la preparazione di estratti di uova di Xenopus e danno del DNA reagenti inducenti checkpoint. Queste tecniche sono adattabili ad una varietà di approcci di danneggiamento del DNA nello studio del DNA segnalazione checkpoint danni.
Abstract
Su base giornaliera, le cellule vengono sottoposte ad una serie di insulti endogeni e ambientali. Per combattere questi insulti, le cellule si sono evoluti danno checkpoint del DNA segnalazione come un meccanismo di sorveglianza per rilevare danni al DNA e dirette risposte cellulari al danno al DNA. Ci sono diversi gruppi di proteine chiamate sensori, trasduttori ed effettori coinvolti nella segnalazione checkpoint danni al DNA (Figura 1). In questo complesso percorso di segnalazione, ATR (ATM e RAD3 correlato) è uno dei principali chinasi che può rispondere al danno del DNA e stress replicazione. Attivato ATR può fosforilare i suoi substrati a valle, come Chk1 (Checkpoint chinasi 1). Di conseguenza, fosforilata e attivata Chk1 porta a molti effetti a valle nel checkpoint danno del DNA compresi arresto del ciclo cellulare, l'attivazione della trascrizione, danni riparazione del DNA, e apoptosi o senescenza (Figura 1). Quando il DNA è danneggiato, non riuscendo ad attivare i risultati danno checkpoint del DNA in unrepdanni in onda e, successivamente, instabilità genomica. Lo studio del punto di controllo danno al DNA chiariranno come le cellule di mantenere l'integrità genomica e fornire una migliore comprensione di come malattie umane, quali il cancro, lo sviluppo.
Xenopus laevis estratti di uova stanno emergendo come un potente sistema acellulare modello estratto nella ricerca checkpoint danni al DNA. A bassa velocità estratto (LSE) è stato inizialmente descritto dal gruppo Masui 1. L'aggiunta di cromatina spermatica demembranated ai risultati LSE in formazione nuclei dove viene replicato DNA in maniera semiconservativa volta per ciclo cellulare.
La via di segnalazione ATR/Chk1-mediated checkpoint viene attivata da danni al DNA o stress replica 2. Due metodi sono attualmente utilizzati per indurre il checkpoint danno al DNA: approcci che danneggiano il DNA e il DNA danni che imitano le strutture 3. Danno al DNA può essere indotta da raggi ultravioletti (UV) di irradiazione, γ-irradiazione, metil metanoesulfonate (MMS), mitomicina C (MMC), 4-nitrochinolina-1-ossido di (4-NQO), o afidicolina 3, 4. MMS è un agente alchilante che inibisce la replicazione del DNA e attiva il checkpoint ATR/Chk1-mediated danno al DNA 4-7. Irradiazione UV innesca anche il danno ATR/Chk1-dependent 8 checkpoint del DNA. Il danno che imitano la struttura del DNA AT70 è un complesso di due oligonucleotidi ricotto-poli (dA) 70 e poli-(dT) 70. AT70 Il sistema è stato sviluppato nel laboratorio di Bill Dunphy ed è ampiamente utilizzato per indurre ATR/Chk1 segnalazione checkpoint 9-12.
Qui, descriviamo protocolli (1) per preparare estratti privi di cellule uovo (LSE), (2) per il trattamento di cromatina spermatica Xenopus con due DNA diversi approcci di danneggiare (MMS e UV), (3) per preparare il danno-imitazione struttura del DNA AT70, e (4) per attivare il checkpoint ATR/Chk1-mediated danno al DNA in LSE con cromatina sperma danneggiato o un danno che imitano la struttura del DNA.
Protocol
1. LSE Preparazione
- Rane donna (Xenopus laevis) sono iniettati due volte per la raccolta delle uova. La prima iniezione (priming) è 100 U PMSG (Pregnant Mare Serum gonadotropina) a rana. Le rane devono essere adescato almeno due giorni prima di uova induce posa e rane innescato sono utilizzabili per un massimo di due settimane. Per prime rane, iniettare per via sottocutanea pMsg nei sacchi linfatici dorsali utilizzando una siringa da 3 ml e 27 ago G.
- Per indurre la deposizione delle uova, iniettare 500 U hCG (gonadotropina corionica umana) a rana innescato per via sottocutanea nei sacchi linfatici dorsali utilizzando un ago 27 G. Incubare rane iniettati in diversi contenitori contenenti 2 litri di soluzione 1x Marc modificato Ringer (MMR). Lasciare rane 14-20 ore per deporre le uova prima della raccolta.
- Rimuovere le rane dai secchi e versare fuori la soluzione MMR fino a circa 100 ml è di sinistra. Ottenere le uova dai secchi trasferendo le uova in un becher da 250 ml.
- Uova Dejelly aggiungendo 100 ml del 2% cisteina (regolarepH a 7,8 con 10 M KOH). Agitare delicatamente le uova con una pipetta Pasteur di vetro invertita (0,7 cm di diametro) circa ogni 30 sec. Decantare e sostituire con cisteina fresco due volte durante l'incubazione. Il processo dejellying è completa in circa 5-15 min quando le uova formare uno strato più condensata sul fondo del bicchiere.
- Eliminare la soluzione di cisteina e lavare le uova tre volte con MMR 0,25 x. Swirl le uova nella soluzione da una pipetta di vetro. "Bad" uova sono determinate mediante una semplice ispezione visiva e sono di colore bianco "gonfio" in apparenza. I "cattivi" uova si accumulano al centro del bicchiere dopo vorticoso. Rimuovere "cattivi" uova da una pipetta Pasteur.
- Lavare le uova con Lysis Buffer Egg (ELB) tre volte. Rimuovere eventuali altri "cattivi" uova da una pipetta Pasteur. Versare le uova in una provetta 14 ml Falcon.
- Gira il tubo Falcon per 55 sec a 188 xg (1.100 rpm) con il CL2 IEC clinico tavolo centrifuga con rotore oscillante per compattare le uova. Rimuovere il tampone in eccesso dalsopra lo strato di uovo. Aggiungere 0,5 ml di Aprotinina / magazzino leupeptina e 0,5 l di brodo Citocalasina B per ml di uova compattati.
- Centrifugare uova a 16.500 xg (10.000 rpm) per 15 min a 4 ° C utilizzando il RC6 Sorvall più centrifuga supervelocità con HB6 rotore oscillante. Dopo centrifugazione, le uova sono frazionati in tre strati nel tubo: lipide, estratto, e tuorlo / pigmento dall'alto verso il basso, rispettivamente. Forare il lato del tubo Falcon nella porzione inferiore dello strato centrale estratto con un ago 21 G. Rimuovere con attenzione l'ago come l'ago puntura può essere ostruito da materiale plastico. Inserire un ago da 21 G fresco attaccato ad una siringa da 1 ml nel sito di puntura per raccogliere l'estratto. Lentamente aspirare l'estratto in siringa per evitare bolle d'aria e la contaminazione con il tuorlo e lipidi / pigmento strati.
- Posizionare gli estratti in un freddo 1,5 ml microcentrifuga tubo. Per ogni millilitro di estratto di uova, aggiungere le seguenti soluzioni madre chimiche al didicata concentrazione finale (mostrato tra parentesi): (1) 10 cicloeximide microlitri (100 mcg / ml), (2) 1 microlitri Aprotinina / leupeptina (10 pg / ml ciascuna), (3) 1 ml Citocalasina B (5 pg / ml ), (4) 1 microlitri di ditiotreitolo (1 mM), e (5) 0,33 Nocodazole microlitri (3 mg / ml). Capovolgere l'uovo estrarre almeno 10 volte con delicatezza. Questa è la LSE, che deve essere fatta fresca e utilizzato entro 4 ore. La qualità della LSE è compromessa dopo 4 ore o di congelamento-scongelamento.
2. Trattamento della cromatina sperma con Approcci danneggiare il DNA
- Preparare cromatina spermatozoi normali secondo il metodo descritto in precedenza 13.
- Preparare MMS trattato con cromatina spermatica
- Risospendere cromatina spermatozoi normali in 0,5 ml di tampone di X.
- Aggiungi ~ 5,5 ml di MMS (9,1 M in magazzino) a 500 microlitri risospeso cromatina ad una concentrazione finale di 100 mM.
- Incubare cromatina spermatozoi in provetta a temperatura ambiente per 30 minuti con rotazione.
- Gira la mtubo icrocentrifuge a 686 xg (2.100 rpm) per 10 minuti a temperatura ambiente utilizzando la centrifuga IEC CL2 clinica con rotore oscillante e adattatori per provette.
- Gettare il surnatante e risospendere il pellet in 0,5 ml di tampone di X più BSA (3%), DTT (0,1 mM) e Aprotinina / leupeptina (10 pg / ml).
- Ripetere i punti (4) e (5) due volte per lavare la cromatina spermatica.
- Determinare la concentrazione di spermatozoi con cromatina un emocitometro e diluire a 100.000 spermatozoi / pl. Salva aliquote di 5 pl in congelatore -80 ° C per un ulteriore uso.
- Preparare UV trattato con cromatina spermatica
- Aggiungere la quantità desiderata (es. 10 pl) della cromatina spermatica normale sulla superficie di un pezzo di Parafilm.
- Posizionare il Parafilm in un reticolante UV. Impostare il parametro energia desiderata, a seconda del tuo esperimento, e iniziare a danneggiare la cromatina degli spermatozoi attraverso la luce UV. Ad esempio, ci vogliono circa 21 secondi per raggiungere 1000 J / m 2.
- Dopo UV irradiazione, UV trattato con cromatina sperma devono essere aggiunte a estratti di uova immediatamente.
3. Preparazione di una struttura di DNA Damage-imitazione (AT70)
- Sciogliere due oligonucleotidi sintetici poli-(dA) 70 (designato come A70) e poli-(dT) 70 (designato come T70) in acqua ad una concentrazione di 2 mg / microlitro, rispettivamente.
- Aggiungere 100 pl di A70 e 100 pl di T70 una provetta 1,5 ml microcentrifuga. Bollire mista soluzione sintetica oligo per 5 min a 95 ° C in un heatblock.
- Prendete il blocco secco bagno fuori (con il tubo contenente miscela in esso), e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente su un banco di laboratorio. Questa regolazione della temperatura dura circa 45-60 min.
- La miscela raffreddata è AT70 con una concentrazione finale di 2 mg / mL. Magazzino 10 pl di AT70 aliquote in congelatore a -20 ° C per un ulteriore uso.
4. Attivazione della Checkpoint danno al DNA in cromatina LSE con sperma danneggiato o di un danno al DNA-Imitazione Struttura
- Indurre il danno checkpoint del DNA in LSE con cromatina degli spermatozoi danneggiati
- Aggiungere 50 ml di LSE in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e integrare con 1 ml di miscela di energia e 2 ml di cromatina degli spermatozoi danneggiati (concentrazione finale ~ 4.000 spermatozoi / reazione microlitri).
- Incubare la provetta di reazione a temperatura ambiente per 90 min e aspirare il tubo ogni 10 min.
- Dispensare 1 ml di miscela di reazione su un vetrino da microscopio integrato con 1 ml di soluzione colorante nucleare dopo 30 minuti di incubazione. Posizionare un vetrino sopra la miscela di reazione e controllare la formazione di nuclei con microscopio a fluorescenza. In genere, nuclei rotondi formerà dopo 30 minuti di incubazione, che indica la replicazione del DNA ha avviato.
- Prendere 10 pl di miscela di reazione in 90 ml di tampone campione. I campioni sono analizzati tramite immunoblotting utilizzando anticorpi anti-P-S344 Chk1 o anti-Chk1 anticorpi.
- Indurre il danno checkpoint del DNA in LSE con ilAT70
- Aggiungere 50 ml di LSE in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga integrata con 1 ml di miscela di energia e 1,6 l di brodo Tautomycin.
- Aggiungere 1,25 ml di pre-made AT70 (2 pg / pl) o acqua (come controllo negativo) ad ogni reazione. Incubare le reazioni a temperatura ambiente per 90 min. Flick le provette di reazione ogni 10 min.
- Aggiungere 10 ml di miscela di reazione in 90 ml di tampone campione. I campioni vengono esaminati tramite immunoblotting utilizzando anticorpi anti-P-S344 Chk1 o anti-Chk1 anticorpi.
5. Risultati rappresentativi
La cromatina sperma danneggiato o danno al DNA che imitano la struttura può attivare il checkpoint ATR/Chk1-mediated danno al DNA nel sistema Xenopus estratto uovo. Figura 2a mostra che induce MMS Chk1 fosforilazione a Ser344 (Chk1 P-S344), che è un indicatore di l'attivazione della chinasi ATR. figura 2B mostra che AT70, come un danno al DNA-imitazione structure, attiva anche Chk1 fosforilazione. Totale campioni Chk1 sono utilizzati come controlli carico in entrambi gli esempi.
Figura 1. Uno schema della segnalazione checkpoint danno al DNA.
Figura 2. Chk1 fosforilazione è indotta da uno o MMS AT70 trattamenti in Xenopus estratti uovo. (A) MMS-danneggiato sperma cromatina (MMS) o cromatina spermatica normale (Con) vengono incubati in estratti di uova per 90 min. Chk1 fosforilazione di Ser344 (Chk1 P-S344) e Chk1 totale in estratti di uova sono esaminati mediante immunoblotting. (B) AT70 o acqua (Con) vengono aggiunti estratti di uova, rispettivamente. I campioni sono analizzati mediante immunoblotting come in (A).
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Discussion
Ci sono diversi vantaggi nello studio il punto di controllo danno al DNA utilizzando estratti di uova di Xenopus. L'uso di estratti di uova fornisce una grande quantità di estratti acellulari sincronizzati al interfase del ciclo cellulare. Gli estratti uovo può essere facilmente ed economicamente realizzato. È relativamente facile danneggiare il DNA o cromatina e per rivelare un difetto del checkpoint danno al DNA dopo immunodepleting una proteina bersaglio estratto da uovo. Successivamente, un difetto di funzione di potenziale può essere "salvato" da addback di tipo selvatico o mutante proteine ricombinanti. Pertanto, Xenopus uovo estratto è un potente sistema modello per la struttura e la funzione di analisi del punto di controllo danno al DNA.
La preparazione LSE è stato dimostrato in precedenza 14, ma il nostro protocollo possiede alcune modifiche. La temperatura di incubazione rane dopo iniezione hCG (18 ° C) è molto importante per la deposizione delle uova. Altre risorse di gestione e iniezione rane si possono trovareda studi precedenti 13,14 e su internet, come tropicalis.berkeley.edu / home / obtaining_embryos / hCG / hCG.html . Generalmente, 1-3 ml di LSE può essere preparato da uova provenienti da una rana. Ci vuole circa un'ora per preparare il LSE e di solito è stabile sul ghiaccio per circa 4 ore. LSE deve essere fatta fresca quando è necessario dal congelamento e scongelamento compromette la qualità della LSE per l'uso in esperimenti checkpoint del danno al DNA. Nella fase 1.9, si consiglia di eseguire soluzioni madre, risparmiando aliquote in congelatori, e l'utilizzo di congelati stock aliquotati per ogni sostanza chimica. Nella nostra esperienza, queste aliquote sono utilizzabili per un massimo di 3 cicli gelo-disgelo.
Reagenti che danneggiano il DNA, come MMS sono stati esaminati in LSE per l'attivazione Chk1 fosforilazione (vedi Figura 2A). Reagenti di danneggiamento del DNA può essere aggiunto direttamente al LSE o usata per danneggiare spcromatina erm prima oltre al LSE. La concentrazione dei reagenti di danneggiamento del DNA molto probabilmente bisogno di essere ottimizzato per esperimenti specifici al fine di ottenere le migliori condizioni per innescare Chk1 fosforilazione. Irradiazione UV può anche essere utilizzato per cromatina danni sperma e attivazione studio del DNA tramite checkpoint danno Chk1 fosforilazione (dati non mostrati). Il Chk1 Ser344 sito di fosforilazione in Xenopus è il sito conservato analoga a Chk1 Ser345 nell'uomo 8.
La miscela sintetica oligo AT70 imita la struttura del danno al DNA. In presenza di Tautomycin (un inibitore di fosfatasi), AT70 indotta fosforilazione Chk1 è stabilizzata e può essere esaminato mediante immunoblotting (come mostrato nella Figura 2B). Il Chk1 endogeno totale viene utilizzato come controllo di caricamento. AT70 innesca un cambiamento nella mobilità Chk1 totale che può essere visualizzato su un Western blot, indicando Chk1 è fosforilata. Anticorpi contro Chk1 fosforilazionee Chk1 totali sono adatti per l'analisi di immunoblotting segnalazione checkpoint danno al DNA in Xenopus.
Nel complesso, l'uovo Xenopus estratti sistema è un potente sistema acellulare modello per studiare il checkpoint danno al DNA. Questo protocollo fornisce le procedure dettagliate per tale analisi. Questo sistema può essere modulata per studiare i meccanismi molecolari del danno al DNA checkpoint utilizzando una varietà di approcci differenti DNA dannosi.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è sostenuto in parte con fondi forniti da The University of North Carolina a Charlotte, Wachovia fondo di base per eccellenza della facoltà, e una borsa di studio NIGMS (R15GM101571).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Anti-Chk1 P-S344 antibody | Cell Signaling | 2348L | |
| Anti-Chk1 antibody | Santa Cruz | SC7898 | |
| Aprotinin | MP Biomedicals | 0219115880 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698-5G | |
| Cytochalasin B | EMD | 250233 | |
| Dithiothreitol (DTT) | VWR | JTF780-2 | |
| hCG | Sigma | CG10-10VL | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-1KG | |
| Leupeptin | VWR | 97063-922 | |
| Methyl methanesulfonate (MMS) | Sigma | 129925-5G | |
| Nocodazole | Sigma | M1404-2MG | |
| PMSG | Calbiochem | 367222 | |
| Sample buffer | Sigma | S3401 | |
| Tautomycin | Wako Chemicals USA | 209-12041 | |
| Equipment | |||
| Bucket for egg laying | Rubbermaid commercial products | 6308 | |
| CL2 IEC centrifuge with swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 004260F | |
| HB6 swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 11860 | |
| Sorvall RC6 plus superspeed centrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| UV crosslinker | UVP | 95-0174-01 | |
| Solutions | |||
| 1x MMR | 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM HEPES, adjust pH to 7.8 with 10 M NaOH | ||
| Aprotinin/Leupeptin stock | 10 mg/ml each in water. Store 20 μl aliquots at -80 °C. | ||
| Buffer X | 0.2 M sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, adjust pH to 7.5 by HCl | ||
| Cycloheximide stock | 10 mg/ml in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
| Cytochalasin B stock | 5 mg/ml in DMSO. Store 20 μl aliquots at -20 °C. | ||
| Dithiothreitol (DTT) stock | 1 M in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
| ELB | 0.25 M sucrose, 1 mM DTT, 50 μg/ml cycloheximide, 2.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7 | ||
| Nocodazole stock | 10 mg/ml in DMSO. Store 5 μl aliquots at -80 °C. | ||
| Energy Mixture | 375 mM creatine phosphate, 50 mM ATP, and 25 mM MgCl2. Aliquots are saved at -80 °C. | ||
| Nuclear dye solution | 0.4 μg/ml H–chst 33258, 25% glycerol (v/v), in 1x PBS | ||
| Tautomycin stock | 100 μM in DMSO. Store 10 μl aliquots at -80 °C. | ||
References
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