Summary
Xenopus яйцо экстракт является полезной модели системы для расследования контрольно-пропускного пункта повреждения ДНК. Этот протокол предназначен для подготовки Xenopus яйцо экстракты и повреждение ДНК реагенты контрольно-пропускном пункте вызывающим. Эти методы могут быть адаптированы к различным повреждающим ДНК подходы в изучении контрольно-пропускного пункта сигнализации повреждения ДНК.
Protocol
1. Подготовка LSE
- Женский лягушек (Xenopus Хепориз) вводится два раза для сбора яиц. Первая инъекция (грунтовка) составляет 100 U PMSG (Беременные Mare сыворотке гонадотропина) в лягушку. Лягушки должны быть загрунтованы по крайней мере, за два дня до вызывающие откладки яиц и загрунтовать лягушки могут использоваться на срок до двух недель. Премьер-лягушки, вводят подкожно ГСЖК в спинной лимфатический мешочки с использованием 3 мл шприц и иглу 27 G.
- Для стимулирования откладки яиц, вводить 500 U ХГЧ (хорионического гонадотропина человека) на загрунтованную лягушки подкожно в спинных мешочков лимфатических использованием 27 G игла. Инкубируйте впрыском лягушек в отдельных ведра, содержащий 2 л раствора 1x Марка изменения Рингера (MMR). Разрешить лягушек 14-20 часов, чтобы отложить яйца до коллекцию.
- Снимите лягушек из ведра и вылить раствор MMR примерно до 100 мл осталось. Получите яйца из ведра, передавая яйца в 250 мл стакан.
- Dejelly яйца, добавляя 100 мл 2% цистеина (настройкарН до 7,8 с 10 М КОН). Осторожно вращать яйца с перевернутой стеклянной пипетки Пастера (0,7 см в диаметре) примерно каждые 30 сек. Слейте и заменить свежим цистеина в два раза во время инкубации. Dejellying процесс завершится примерно через 5-15 минут, когда яйца сформировать более конденсированного слоя на дне стакана.
- Откажитесь от раствора цистеина и мыть яйца три раза 0.25x MMR. Swirl яйца в раствор стеклянной пипетки. "Bad" яйца определяется простым визуальным осмотром и являются "пухлые" белые по внешнему виду. "Плохими" яйца будут накапливаться в центре стакана после закрученной. Удалить "плохих" яйца пипеткой Пастера.
- Мойте яйца с яйцом буфера для лизиса (СОБ) в три раза. Удалите все дополнительные "плохих" яйца пипеткой Пастера. Залейте яйца в 14 мл трубки Falcon.
- Спиновые трубки сокола в течение 55 сек при 188 мкг (1100 оборотов в минуту) с помощью CL2 IEC клинических настольной центрифуге с бакет ротор для уплотнения яйца. Удалите излишки буфера изверхней части яйца слоя. Добавить 0,5 мкл Апротинин / акция лейпептин и 0,5 мкл на складе цитохалазин на мл уплотненного яйца.
- Центрифуга яйца в 16500 мкг (10.000 оборотов в минуту) в течение 15 мин при 4 ° С с использованием Sorvall RC6 плюс сверхскоростные центрифуги с HB6 бакет ротора. После центрифугирования, яйца фракционированного на три слоя в трубку: липиды, экстракт и желток / пигмент сверху вниз, соответственно. Прокол стороне трубки сокола в нижней части среднего слоя экстракта с 21 игл G. Аккуратно извлеките иглу, как прокалывание иглой может быть затруднен пластика. Вставьте новую иглу 21 G прикреплены к 1 мл шприца в месте прокола, чтобы собрать экстракт. Медленно аспирации экстракта в шприц, чтобы избежать пузырьков воздуха и загрязнение липидов и желток / пигмент слоев.
- Поместите экстракты в охлажденный 1,5 трубку микроцентрифужных мл. Для каждого миллилитра экстракта яйцо, добавьте следующие растворы химических Вdicated конечная концентрация (в скобках): (1) 10 мкл Циклогексимид (100 мкг / мл); (2) 1 мкл Апротинин / лейпептин (10 мкг / мл); (3) 1 мкл цитохалазин (5 мкг / мл ); (4) 1 мкл Dithiothreitol (1 мМ) и (5) 0.33 мкл нокодазолом (3 мкг / мл). Переверните яйцо извлечь по крайней мере, в 10 раз мягко. Это LSE, которое должно быть свежим и использовать в течение 4 часов. Качество LSE находится под угрозой после 4 ч или замораживания-оттаивания.
2. Лечение спермы хроматина с ДНК Повреждение подходы
- Подготовка нормального хроматина сперматозоидов в соответствии с методом, описанным ранее 13.
- Подготовить MMS-обработанной спермы хроматина
- Ресуспендируют нормальных хроматина сперматозоидов в 0,5 мл буфера X.
- Добавить ~ 5,5 мкл MMS (9,1 M в наличии) до 500 мкл ресуспендировали хроматина до конечной концентрации 100 мМ.
- Инкубируйте спермы хроматина в микроцентрифуге трубки при комнатной температуре в течение 30 мин с вращением.
- Побочные мicrocentrifuge трубки на 686 мкг (2100 оборотов в минуту) в течение 10 мин при комнатной температуре с использованием IEC CL2 клинической центрифуге с качающимся ротором ведро и трубка адаптеров.
- Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 0,5 мл буфера X плюс BSA (3%), DVB-T (0,1 мм) и Апротинин / лейпептин (10 мкг / мл).
- Повторите шаги (4) и (5) в два раза мыть спермы хроматина.
- Определить концентрацию сперматозоидов хроматина с гемоцитометр и разбавить до 100.000 спермы / мкл. Скидка 5 мкл аликвоты в -80 ° C морозильник для дальнейшего использования.
- Подготовка УФ-обработанной спермы хроматина
- Добавить желаемую сумму (например, 10 мкл) нормальная хроматина сперматозоидов на поверхности куска Parafilm.
- Поместите Parafilm в УФ сшивателя. Установить желаемый энергетический параметр, в зависимости от вашего эксперимента, и начать повредить сперму хроматина с помощью ультрафиолетового света. Например, она занимает около 21 секунд, чтобы достигать 1000 Дж / м 2.
- После УФ-облучениячения, УФ-обработанной спермы хроматина следует добавить яйцо экстрактов немедленно.
3. Подготовка повреждения ДНК имитирующих структуру (AT70)
- Растворите двух синтетических олигонуклеотидов поли-(дА) 70 (обозначается как A70) и поли-(дТ) 70 (обозначается как T70) в воде в концентрации 2 мкг / мл, соответственно.
- Добавить 100 мкл A70 и 100 мкл T70 одной трубке микроцентрифужных 1,5 мл. Отварить смешанных синтетических олиго решение в течение 5 мин при 95 ° С в теплоблока.
- Возьмите сухую ванну из блоков (с трубой, содержащий по меньшей смесь в ней), и дайте ему остыть до комнатной температуры на лабораторном столе. Эта регулировка температуры занимает около 45-60 минут.
- Охлажденную смесь AT70 с конечной концентрации 2 мкг / мкл. Магазин 10 мкл аликвоты в AT70 -20 ° C морозильник для дальнейшего использования.
4. Запуск Checkpoint повреждений ДНК в LSE с повреждением хроматина сперматозоидов или повреждения ДНКИмитирующих структуры
- Вызвать контрольно-пропускном пункте повреждений ДНК в LSE с повреждением хроматина спермы
- Добавить 50 мкл LSE в 1,5 мл трубки микроцентрифужных и дополнить его с 1 мкл энергетики смеси и 2 мкл поврежденных хроматина сперматозоидов (конечная концентрация сперматозоидов ~ 4,000 / мкл реакции).
- Инкубируйте реакционной трубке при комнатной температуре в течение 90 минут и вылить трубку каждые 10 мин.
- Внесите 1 мкл реакционной смеси на предметное стекло микроскопа с добавлением 1 мкл ядерной раствор красителя после 30-минутной инкубации. Поместите крышку скольжения над реакционной смеси и проверить на формирование ядер с помощью флуоресцентного микроскопа. Как правило, круглые ядра будут формироваться после 30 мин инкубации, с указанием репликации ДНК инициировал.
- Возьмите 10 мкл реакционной смеси в 90 мкл буфера для образца. Образцы анализировали с помощью иммуноблоттинга с использованием анти-Chk1 P-S344 или анти-Chk1 антител.
- Вызвать контрольно-пропускном пункте повреждений ДНК в LSE сAT70
- Добавить 50 мкл LSE до 1,5 мл микроцентрифужных трубы с добавлением 1 мкл энергии смеси и 1,6 мкл Tautomycin акций.
- Добавить 1,25 мкл готовых AT70 (2 мкг / мкл) или воды (в качестве отрицательного контроля) для каждой реакции. Инкубируйте реакции при комнатной температуре в течение 90 мин. Флик реакционных труб каждые 10 мин.
- Добавить 10 мкл реакционной смеси в 90 мкл буфера для образца. Образцы исследовали с помощью иммуноблоттинга с использованием анти-Chk1 P-S344 или анти-Chk1 антител.
5. Представитель Результаты
Поврежденного хроматина сперматозоидов или повреждение ДНК имитирующих структуру может вызвать ATR/Chk1-mediated контрольно-пропускном пункте повреждение ДНК в экстракте системе Xenopus яйцо. Рисунок 2А показывает, что MMS вызывает Chk1 фосфорилирования в Ser344 (Chk1 P-S344), который является показателем ATR киназы активации. рис. 2В показывает, что AT70, как повреждение ДНК, имитирующие STRUcture, также вызывает Chk1 фосфорилирования. Всего образцов Chk1 используются в качестве контроля загрузки в обоих примерах.
Рисунок 1. Схема контрольно-пропускного пункта сигнализации повреждения ДНК.
Рисунок 2. Chk1 фосфорилирования индуцированный либо MMS или AT70 лечения в Xenopus экстракты яйцо. (A) MMS-поврежденные сперматозоиды хроматина (MMS) или нормальный хроматина сперматозоидов (Con) инкубируют в яйце экстракт в течение 90 мин. Chk1 фосфорилирования по Ser344 (Chk1 P-S344) и общего Chk1 в яйце экстракты исследовали с помощью иммуноблоттинга. (B) AT70 или воды (Con) будут добавлены в яйце экстракты, соответственно. Пробы также анализировали с помощью иммуноблоттинга, как и в (A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Есть несколько преимуществ в изучении контрольно-пропускного пункта повреждения ДНК использовании Xenopus яйцо экстрактов. Использование яйцо экстракт содержит большое количество бесклеточных экстрактов синхронизированы в интерфазе клеточного цикла. Яйцо экстракты могут быть легко и недорого сделал. Это сравнительно легко повредить ДНК и хроматина и выявить дефект в контрольно-пропускном пункте повреждения ДНК после immunodepleting целевой белок из яйца экстракта. Впоследствии, потенциальный дефект функция может быть "спасен" от addback дикого типа или мутантного рекомбинантных белков. Таким образом, Xenopus яйцо экстракт представляет собой мощную систему модель для структуры и функции анализа ДНК контрольно-пропускного пункта повреждения.
LSE подготовка была продемонстрирована ранее 14, но наш протокол имеет несколько модификаций. Температура инкубации лягушек после инъекции ХГЧ (18 ° C) является очень важным для кладки яиц. Дополнительные ресурсы обработки и инъекционных лягушек можно найтиИз предыдущих исследований 13,14 и в Интернете, таких как tropicalis.berkeley.edu / Главная / obtaining_embryos / ХГЧ / hCG.html . Как правило, 1-3 мл LSE могут быть приготовлены из яиц, полученных от одной лягушки. Она занимает примерно один час, чтобы подготовить LSE, и это, как правило, стабильным на льду в течение около 4 часов. LSE должна быть свежей, когда это необходимо, так как замораживание и оттаивание компромиссов качества LSE для использования в экспериментах повреждения ДНК контрольно-пропускном пункте. В шаге 1.9, мы рекомендуем растворы, экономя аликвоты в морозильных камерах, и использование замороженных аликвоты запасов для каждого химического вещества. По нашему опыту, эти порции могут использоваться для детей до 3 циклов замораживания-оттаивания.
ДНК-повреждающих реагентов, таких как MMS, были рассмотрены в LSE для запуска Chk1 фосфорилирования (см. рисунок 2А). ДНК-повреждающих реагенты могут быть добавлены непосредственно на LSE или использованы для повреждения SPхм хроматина перед добавлением к LSE. Концентрация ДНК-повреждающих реагентами, скорее всего, должны быть оптимизированы для конкретных экспериментов, чтобы получить лучшие условия для запуска Chk1 фосфорилирования. УФ-облучение может также быть использована для повреждение хроматина сперматозоидов и исследование активации контрольно-пропускного пункта повреждения ДНК с помощью Chk1 фосфорилирования (данные не показаны). Chk1 фосфорилирования сайта Ser344 в Xenopus является консервативный сайт аналогичные Chk1 Ser345 в организме человека 8.
Синтетических олиго AT70 смесь имитирует структуру повреждения ДНК. В присутствии Tautomycin (ингибиторы фосфатазы), AT70-индуцированного фосфорилирования Chk1 стабилизируется и может быть рассмотрен через иммуноблоттинга (как показано на рисунке 2B). Общая Chk1 эндогенных используется в качестве управления загрузкой. AT70 вызывает мобильности сдвиг в общей Chk1, которые могут быть визуализированы на Вестерн-блот, указывая Chk1 фосфорилируется. Антитела против Chk1 фосфорилированияи общей Chk1 подходят для иммуноблоттинга анализ ДНК сигнализации контрольно-пропускном пункте ущерб в Xenopus.
В целом, яйца Xenopus экстракты система является мощным бесклеточной модель системы расследования контрольно-пропускного пункта повреждения ДНК. Этот протокол обеспечивает подробные процедуры для такого анализа. Эта система может быть адаптировано с изучения молекулярных механизмов повреждения ДНК контрольно-пропускном пункте использованием различных ДНК-повреждающих подходов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа частично поддержана средств, предоставленных Университетом Северной Каролины в Шарлотте, Wachovia основу фонда для профессорско-преподавательского мастерства, и грант от NIGMS (R15GM101571).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Anti-Chk1 P-S344 antibody | Cell Signaling | 2348L | |
| Anti-Chk1 antibody | Santa Cruz | SC7898 | |
| Aprotinin | MP Biomedicals | 0219115880 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698-5G | |
| Cytochalasin B | EMD | 250233 | |
| Dithiothreitol (DTT) | VWR | JTF780-2 | |
| hCG | Sigma | CG10-10VL | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-1KG | |
| Leupeptin | VWR | 97063-922 | |
| Methyl methanesulfonate (MMS) | Sigma | 129925-5G | |
| Nocodazole | Sigma | M1404-2MG | |
| PMSG | Calbiochem | 367222 | |
| Sample buffer | Sigma | S3401 | |
| Tautomycin | Wako Chemicals USA | 209-12041 | |
| Equipment | |||
| Bucket for egg laying | Rubbermaid commercial products | 6308 | |
| CL2 IEC centrifuge with swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 004260F | |
| HB6 swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 11860 | |
| Sorvall RC6 plus superspeed centrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| UV crosslinker | UVP | 95-0174-01 | |
| Solutions | |||
| 1x MMR | 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM HEPES, adjust pH to 7.8 with 10 M NaOH | ||
| Aprotinin/Leupeptin stock | 10 mg/ml each in water. Store 20 μl aliquots at -80 °C. | ||
| Buffer X | 0.2 M sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, adjust pH to 7.5 by HCl | ||
| Cycloheximide stock | 10 mg/ml in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
| Cytochalasin B stock | 5 mg/ml in DMSO. Store 20 μl aliquots at -20 °C. | ||
| Dithiothreitol (DTT) stock | 1 M in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
| ELB | 0.25 M sucrose, 1 mM DTT, 50 μg/ml cycloheximide, 2.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7 | ||
| Nocodazole stock | 10 mg/ml in DMSO. Store 5 μl aliquots at -80 °C. | ||
| Energy Mixture | 375 mM creatine phosphate, 50 mM ATP, and 25 mM MgCl2. Aliquots are saved at -80 °C. | ||
| Nuclear dye solution | 0.4 μg/ml H–chst 33258, 25% glycerol (v/v), in 1x PBS | ||
| Tautomycin stock | 100 μM in DMSO. Store 10 μl aliquots at -80 °C. | ||
References
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220 (4598), 719-721 (1983).
- Cimprich, K. A., Cortez, D. ATR: an essential regulator of genome integrity. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).
- Lupardus, P. J., Van, C., Cimprich, K. A. Analyzing the ATR-mediated checkpoint using Xenopus egg extracts. Methods. 41 (2), 222-231 (2007).
- Lupardus, P. J., Byun, T., Yee, M. C., Hekmat-Nejad, M., Cimprich, K. A. A requirement for replication in activation of the ATR-dependent DNA damage checkpoint. Genes Dev. 16 (18), 2327-2332 (2002).
- Stokes, M. P., Van Hatten, R., Lindsay, H. D., Michael, W. M. DNA replication is required for the checkpoint response to damaged DNA in Xenopus egg extracts. J. Cell Biol. 158 (5), 863-872 (2002).
- Kato, K., Strauss, B. Accumulation of an intermediate in DNA synthesis by HEp.2 cells treated with methyl methanesulfonate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (5), 1969-1973 (1974).
- Paulovich, A. G., Hartwell, L. H. A checkpoint regulates the rate of progression through S phase in S. cerevisiae in response to DNA damage. Cell. 82 (5), 841-847 (1995).
- Guo, Z., Kumagai, A., Wang, S. X., Dunphy, W. G. Requirement for Atr in phosphorylation of Chk1 and cell cycle regulation in response to DNA replication blocks and UV-damaged DNA in Xenopus egg extracts. Genes Dev. 14 (21), 2745-2756 (2000).
- Jazayeri, A., Balestrini, A., Garner, E., Haber, J. E., Costanzo, V. Mre11-Rad50-Nbs1-dependent processing of DNA breaks generates oligonucleotides that stimulate ATM activity. EMBO. J. 27 (14), 1953-1962 (2008).
- Kumagai, A., Dunphy, W. G. Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts. Mol. Cell. 6 (4), 839-849 (2000).
- Yan, S., Lindsay, H. D., Michael, W. M. Direct requirement for Xmus101 in ATR-mediated phosphorylation of Claspin bound Chk1 during checkpoint signaling. J. Cell Biol. 173 (2), 181-186 (2006).
- Shiotani, B., Zou, L. Single-stranded DNA orchestrates an ATM-to-ATR switch at DNA breaks. Mol. Cell. 33 (5), 547-558 (2009).
- Tutter, A. V., Walter, J. C. Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs. Methods Mol. Biol. 322, 121-137 (2006).
- Cross, M. K., Powers, M. Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts. J. Vis. Exp. (18), e891 (2008).
