Summary
Xenopus ägg extrakt är en användbar modell för att undersöka Checkpoint DNA-skador. Detta protokoll är för beredning av Xenopus ägg extrakt och DNA skador checkpoint reagens inducerande. Dessa tekniker är anpassningsbara till en mängd olika DNA-skadande tillvägagångssätt i studien av DNA-skada kontrollpunkt signalering.
Abstract
På en daglig basis, celler utsätts för en mängd av endogena och miljömässiga förolämpningar. För att bekämpa dessa förolämpningar har celler utvecklats checkpoint DNA-skada signalering som en övervakningsmekanism för att känna DNA-skador och direkta cellulära svar på DNA-skador. Det finns flera grupper av proteiner som kallas sensorer, givare och effektorer involverade i DNA-skador kontrollpunkt signalering (figur 1). I denna komplexa signalväg är ATR (ATM och Rad3-relaterade) ett av de största kinaser som kan svara på DNA-skador och replikering stress. Aktiverad ATR kan fosforylera dess nedströms substrat såsom Chk1 (Checkpoint kinas 1). Därför fosforylerat och aktiverad Chk1 leder till många nedströms effekter i DNA-skador checkpoint, inklusive cellcykelstopp, transkriptionsaktivering, DNA-skador reparation och apoptos eller senescens (figur 1). När DNA skadas, om att aktivera DNA resulterar skada kontrollpunkt i unrepsändes skada och därefter genomisk instabilitet. Studien av DNA-skador kontrollpunkten kommer belysa hur celler upprätthåller genomisk integritet och ge en bättre förståelse för hur mänskliga sjukdomar, såsom cancer, utvecklas.
Xenopus laevis ägg extrakt växer fram som en kraftfull cellfritt extrakt modellsystem i DNA-skador kontrollpunkt forskning. Låg hastighet extrakt (LSE) ursprungligen beskrivs av Masui grupp 1. Tillsatsen av demembranated spermier kromatin till LSE resulterar i kärnor bildas där DNA replikeras i en semiconservative sätt en gång per cellcykeln.
Den ATR/Chk1-mediated Checkpoint signalväg utlöses av DNA-skada eller replikering stressen 2. Två metoder används idag för att inducera Checkpoint DNA-skador: DNA-skadande metoder och DNA-skador, härma strukturer 3. DNA-skada kan induceras genom ultraviolett (UV) strålning, γ-strålning, metyl metanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitrokinolin-1-oxid (4-NQO), eller afidikolin 3, 4. MMS är ett alkyleringsmedel som hämmar DNA-replikation och aktiverar ATR/Chk1-mediated DNA-skada kontrollpunkt 4-7. UV-strålning utlöser också ATR/Chk1-dependent DNA-8 skador kontrollpunkt. Den DNA-skada-imitera strukturen AT70 är en glödgad komplex av två oligonukleotider poly-(dA) 70 och poly-(dT) 70. Det AT70-systemet utvecklades i Bill Dunphy laboratorium och används ofta för att framkalla ATR/Chk1 checkpoint signalering 9-12.
Här beskriver vi protokoll (1) att förbereda cellfria ägg extrakt (LSE), (2) att behandla Xenopus spermier kromatin med två olika DNA skada metoder (MMS och UV), (3) att förbereda DNA-skador, imitera struktur AT70, och (4) att utlösa ATR/Chk1-mediated kontrollpunkt DNA-skador i LSE med skadad sperma kromatin eller en DNA-skada-imitera strukturen.
Protocol
1. LSE Förberedelse
- Kvinnliga grodor (Xenopus laevis) injiceras två gånger för insamling av ägg. Den första injektionen (priming) är 100 U PMSG (gravid Mare Serum Gonadotropin) per groda. Grodor måste fyllas minst två dagar innan inducera äggläggning och primade grodor är användbara i upp till två veckor. För prime grodor, injicera PMSG subkutant i den dorsala lymfan säckar med en 3 ml spruta och 27 G nål.
- För att inducera äggläggning, injicera 500 U hCG (humant koriongonadotropin) per primad groda subkutant i den dorsala lymfan säckar med en 27 G nål. Inkubera injicerade grodor i separata hinkar innehållande 2 liter 1x Marcs modifierade Ringers lösning (MMR). Tillåt grodor 14-20 timmar för att lägga ägg innan samlingen.
- Ta bort grodorna från hinkar och häll bort MPR lösning tills cirka 100 ml är kvar. Skaffa ägg från hinkar genom överföring ägg till en 250 ml bägare.
- Dejelly ägg genom att tillsätta 100 ml 2% cystein (justerapH till 7,8 med 10 M KOH). Snurra försiktigt äggen med en inverterad glas Pasteurpipett (0,7 cm i diameter) ungefär var 30 sekund. Dekantera och ersätt med färsk cystein två gånger under inkubation. Den dejellying processen är fullbordad inom ca 5-15 minuter när äggen bildar en mer kondenserad skikt vid botten av bägaren.
- Släng cystein lösningen och tvätta ägg tre gånger med 0.25x MMR. Snurra äggen i lösningen av ett glas pipett. "Dåliga" ägg bestäms genom enkel visuell inspektion och "Puffy" vitt. De "dåliga" ägg kommer att ackumuleras i mitten av bägaren efter virvlande. Ta "dåliga" ägg av en Pasteur-pipett.
- Tvätta ägg med ägg lyseringsbuffert (ELB) tre gånger. Ta bort eventuella extra "dåliga" ägg av en Pasteur-pipett. Häll ägg i en 14 ml Falcon-rör.
- Snurra Falcon röret för 55 sekunder vid 188 xg (1100 rpm) med CL2 IEC kliniska bordsskivan centrifug med svängande hink rotor att packa äggen. Ta bort överflödigt buffert fråntoppen av ägget skiktet. Tillsätt 0,5 pl Aprotinin / Leupeptin lager och 0,5 pl Cytochalasin B beståndet per ml kompakterade ägg.
- Centrifugera ägg vid 16.500 xg (10.000 rpm) under 15 minuter vid 4 ° C med användning av Sorvall RC6 plus SuperSpeed centrifug med HB6 svängande hink rötor. Efter centrifugering, ägg fraktioneras i tre skikt i röret: lipid, extrakt, och äggula / pigment från topp till botten, respektive. Punktering sidan av Falcon-rör i den nedre delen av den mellersta extraktet skiktet med en 21 G nål. Ta försiktigt bort nålen som punkterande nål kan hindras av plast. Sätt i ett nytt 21 G nål fäst vid en 1 ml spruta i punktionsstället för att samla extraktet. Långsamt Aspirera extraktet i sprutan för att undvika luftbubblor och kontaminering med lipid-och gulan / pigment skikt.
- Placera extrakten i en kyld 1,5 ml mikrocentrifugrör. För varje milliliter ägg extrakt, lägg till följande kemiska lösningar lager till idicated slutlig koncentration (inom parentes): (1) 10 pl Cykloheximid (100 pg / ml), (2) 1 ^ il aprotinin / Leupeptin (10 ng / ml vardera), (3) 1 pl Cytochalasin B (5 pg / ml ), (4) 1 pl Ditiotreitol (1 mM), och (5) 0,33 pl Nocodazole (3 pg / ml). Vänd ägget extrahera minst 10 gånger försiktigt. Detta är LSE, som måste göras färskt och användas inom 4 timmar. Kvaliteten på LSE äventyras efter 4 timmar eller frys-tö.
2. Behandling av spermier Chromatin med DNA-skadande Approaches
- Förbered normala spermier kromatin enligt metoden som beskrivits tidigare 13.
- Förbered MMS-behandlad sperma kromatin
- Resuspendera normala spermier kromatin i 0,5 ml buffert X.
- Lägg ~ 5,5 pl MMS (9,1 M i lager) till 500 pl återsuspenderas kromatin till en slutlig koncentration av 100 mM.
- Inkubera spermier kromatin i mikrocentrifugrör vid rumstemperatur under 30 minuter under rotation.
- Snurra microcentrifuge rör vid 686 xg (2100 rpm) under 10 minuter vid rumstemperatur med IEC CL2 klinisk centrifug med svängande hink rotor och adaptrar rör.
- Kasta supernatanten och återsuspendera pelleten i 0,5 ml buffert X plus BSA (3%), DTT (0,1 mM) och aprotinin / Leupeptin (10 ng / ml vardera).
- Upprepa stegen (4) och (5) två gånger för att tvätta spermier kromatin.
- Bestäm koncentrationen av spermier kromatin med en hemocytometer och späd till 100.000 spermier / ul. Spara 5 | il alikvoter vid -80 ° C frys för vidare användning.
- Förbered UV-behandlade spermier kromatin
- Lägg önskad mängd (t.ex. 10 pl) av normala spermier kromatin på ytan av en bit Parafilm.
- Placera Parafilm till en UV-tvärbindare. Ställ önskad energi parametern, beroende på experimentet och börja skada sperman kromatin via UV-ljus. Till exempel tar det ungefär 21 sekunder för att nå 1.000 J / m 2.
- Efter UV irramedling, UV-behandlade spermier kromatin bör läggas till ägg extrakt omedelbart.
3. Beredning av en DNA skador-imitera Struktur (AT70)
- Lös två syntetiska oligonukleotider poly-(dA) 70 (betecknad som A70) och poly-(dT) 70 (betecknad som T70) i vatten till en koncentration av 2 ug / ul, respektive.
- Tillsätt 100 | il av A70 och 100 pl av T70 till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Koka blandad syntetisk oligo-lösning under 5 min vid 95 ° C i en heatblock.
- Ta den torra bad blocket ut (med röret innehåller AT blandning i det), och låt den svalna till rumstemperatur på ett labb bänk. Denna temperatur justering tar ca 45-60 min.
- Den kylda blandningen är AT70 med en slutlig koncentration av 2 ug / ul. Lagra 10 pl alikvoter AT70 i -20 ° C frys för vidare användning.
4. Utlösning Checkpoint DNA-skador i LSE med skadade spermier Chromatin eller en DNA Damage-Imitera Struktur
- Inducera checkpoint DNA-skador i LSE med skadad sperma kromatin
- Lägg 50 pl av LSE till en 1,5 ml mikrocentrifugrör och komplettera den med 1 pl energi beredningen och 2 pl av skadade spermier kromatin (slutlig koncentration ~ 4.000 spermier / il reaktion).
- Inkubera reaktionsröret vid rumstemperatur under 90 min och flick röret var 10 min.
- Dispensera 1 pl av reaktionsblandningen på ett mikroskopobjektglas kompletterat med 1 pl av nukleär färgämneslösning efter 30-min inkubation. Placera ett täckglas över reaktionsblandningen och kontrollera kärnor bildning via fluorescensmikroskop. Typiskt kommer runda kärnor bildas efter 30 minuter av inkubation, visar DNA-replikation har initierat.
- Tag 10 ul av reaktionsblandningen i 90 pl provbuffert. Analyseras genom immunoblotting med anti-Chk1 P-S344 eller anti-Chk1 antikroppar.
- Inducera checkpoint DNA-skador i LSE medAT70
- Lägg 50 pl av LSE till en 1,5 ml mikrocentrifugrör kompletterat med 1 pl energi blandning och 1,6 pl Tautomycin lager.
- Lägg 1,25 il färdiga AT70 (2 pg / pl) eller vatten (som negativ kontroll) till varje reaktion. Inkubera reaktionerna vid rumstemperatur under 90 minuter. Flick reaktionsrören varje 10 min.
- Tillsätt 10 | il av reaktionsblandningen till 90 pl provbuffert. Prover undersöks genom immunoblotting med anti-Chk1 P-S344 eller anti-Chk1 antikroppar.
5. Representativa resultat
Den skadade spermier kromatin eller DNA-skada-imitera strukturen kan utlösa ATR/Chk1-mediated kontrollpunkt DNA-skador i Xenopus äggextrakt systemet. Figur 2a visar att MMS inducerar Chk1 fosforylering vid Ser344 (Chk1 P-S344), vilket är en indikator på ATR kinasaktivering. Figur 2B visar att AT70, som en DNA-skada-imitera structure, även utlöser Chk1 fosforylering. Totalt Chk1 prov används som laddar kontroller i båda exemplen.
Figur 1. Ett diagram av DNA-skada kontrollpunkt signalering.
Figur 2. Chk1 fosforylering induceras av antingen MMS eller AT70 behandlingar i Xenopus ägg extrakt. (A) MMS-skadad sperma kromatin (MMS) eller normala spermier kromatin (Con) inkuberas i ägg extrakt i 90 min. Chk1 fosforylering vid Ser344 (Chk1 P-S344) och total Chk1 i ägg extrakt undersöks genom immunoblotting. (B) AT70 eller vatten (Con) tillsätts i ägg extrakt, respektive. Prover analyseras också genom immunoblotting som i (A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns flera fördelar med att studera checkpoint DNA-skador med Xenopus ägg extrakt. Användningen av ägg extrakt ger en stor mängd av cellfria extrakt synkroniserade vid interfasen av cellcykeln. De ägg extrakt kan enkelt och billigt göras. Det är relativt lätt att skada DNA eller kromatin och att avslöja en defekt i DNA-skador kontrollpunkt efter immunodepleting ett målprotein från äggextrakt. Därefter kan en potentiell funktion defekt vara "räddas" genom addback av vildtyp eller mutant rekombinanta proteiner. Därför är Xenopus äggextrakt ett kraftfullt modellsystem för struktur och funktion analys av DNA-skada kontrollpunkt.
LSE Beredningen har visats tidigare 14, men vår protokollet har vissa ändringar. Temperaturen för inkubation grodor efter hCG-injektionen (18 ° C) är mycket avgörande för äggläggning. Mer resurser att hantera och injicera grodor finnsfrån tidigare studier 13,14 och på internet som tropicalis.berkeley.edu / home / obtaining_embryos / hCG / hCG.html . Generellt kan 1-3 ml av LSE framställas från ägg härledda från en groda. Det tar ungefär en timme att förbereda LSE och det är typiskt stabilt på is under ca 4 timmar. LSE måste göras färska när den behövs, eftersom frysning och upptining kompromisser kvaliteten på LSE för användning i checkpoint DNA skada experiment. I steg 1,9, rekommenderar vi att stamlösningar, spara alikvoter i frysar och använda frysta alikvoter bestånd för varje kemikalie. I vår erfarenhet, dessa alikvoter är användbara i upp till 3 frys-tiningscykler.
DNA-skadande reagens såsom MMS har undersökts i LSE för att utlösa Chk1 fosforylering (se figur 2A). DNA-skadande reagens kan antingen sättas direkt till LSE eller användas för att skada sperm kromatin före tillsats till LSE. Koncentrationen av DNA-skadande reagenser kommer sannolikt att behöva optimeras för specifika experiment för att få de bästa förutsättningarna för att utlösa Chk1 fosforylering. UV-bestrålning kan också användas för att skada spermier kromatin och studera aktivering av DNA-skada genom kontrollpunkt Chk1 fosforylering (data ej visade). Den Chk1 fosforyleringsställe Ser344 i Xenopus är det bevarade området analog med Chk1 Ser345 hos människor 8.
Den syntetiska oligo AT70 blandning härmar strukturen av DNA-skador. I närvaro av Tautomycin (en fosfatasinhibitor), är AT70-inducerad fosforylering Chk1 stabiliserad och kan undersökas genom immunoblotting (såsom visas i figur 2B). Den totala endogena Chk1 används som en belastning kontroll. AT70 utlöser en rörlighet förändring i den totala Chk1 som kan visualiseras på en Western blöt, vilket indikerar Chk1 fosforyleras. Antikroppar mot Chk1 fosforyleringoch totala Chk1 är lämpliga för immunoblotting analys av DNA-skador kontrollpunkt signalering i Xenopus.
Totalt sett är Xenopus ägg extrakt systemet en kraftfull cellfritt modellsystem för att undersöka Checkpoint DNA-skador. Detta protokoll ger detaljerade förfaranden för sådan analys. Detta system kan moduleras för att studera de molekylära mekanismerna i DNA-skador kontrollpunkt med en mängd olika DNA-skadande metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöds delvis av medel från University of North Carolina i Charlotte, Wachovia stiftelse fond för lärare kompetens, och ett bidrag från NIGMS (R15GM101571).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Anti-Chk1 P-S344 antibody | Cell Signaling | 2348L | |
| Anti-Chk1 antibody | Santa Cruz | SC7898 | |
| Aprotinin | MP Biomedicals | 0219115880 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698-5G | |
| Cytochalasin B | EMD | 250233 | |
| Dithiothreitol (DTT) | VWR | JTF780-2 | |
| hCG | Sigma | CG10-10VL | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-1KG | |
| Leupeptin | VWR | 97063-922 | |
| Methyl methanesulfonate (MMS) | Sigma | 129925-5G | |
| Nocodazole | Sigma | M1404-2MG | |
| PMSG | Calbiochem | 367222 | |
| Sample buffer | Sigma | S3401 | |
| Tautomycin | Wako Chemicals USA | 209-12041 | |
| Equipment | |||
| Bucket for egg laying | Rubbermaid commercial products | 6308 | |
| CL2 IEC centrifuge with swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 004260F | |
| HB6 swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 11860 | |
| Sorvall RC6 plus superspeed centrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| UV crosslinker | UVP | 95-0174-01 | |
| Solutions | |||
| 1x MMR | 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM HEPES, adjust pH to 7.8 with 10 M NaOH | ||
| Aprotinin/Leupeptin stock | 10 mg/ml each in water. Store 20 μl aliquots at -80 °C. | ||
| Buffer X | 0.2 M sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, adjust pH to 7.5 by HCl | ||
| Cycloheximide stock | 10 mg/ml in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
| Cytochalasin B stock | 5 mg/ml in DMSO. Store 20 μl aliquots at -20 °C. | ||
| Dithiothreitol (DTT) stock | 1 M in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
| ELB | 0.25 M sucrose, 1 mM DTT, 50 μg/ml cycloheximide, 2.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7 | ||
| Nocodazole stock | 10 mg/ml in DMSO. Store 5 μl aliquots at -80 °C. | ||
| Energy Mixture | 375 mM creatine phosphate, 50 mM ATP, and 25 mM MgCl2. Aliquots are saved at -80 °C. | ||
| Nuclear dye solution | 0.4 μg/ml H–chst 33258, 25% glycerol (v/v), in 1x PBS | ||
| Tautomycin stock | 100 μM in DMSO. Store 10 μl aliquots at -80 °C. | ||
References
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220 (4598), 719-721 (1983).
- Cimprich, K. A., Cortez, D. ATR: an essential regulator of genome integrity. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).
- Lupardus, P. J., Van, C., Cimprich, K. A. Analyzing the ATR-mediated checkpoint using Xenopus egg extracts. Methods. 41 (2), 222-231 (2007).
- Lupardus, P. J., Byun, T., Yee, M. C., Hekmat-Nejad, M., Cimprich, K. A. A requirement for replication in activation of the ATR-dependent DNA damage checkpoint. Genes Dev. 16 (18), 2327-2332 (2002).
- Stokes, M. P., Van Hatten, R., Lindsay, H. D., Michael, W. M. DNA replication is required for the checkpoint response to damaged DNA in Xenopus egg extracts. J. Cell Biol. 158 (5), 863-872 (2002).
- Kato, K., Strauss, B. Accumulation of an intermediate in DNA synthesis by HEp.2 cells treated with methyl methanesulfonate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (5), 1969-1973 (1974).
- Paulovich, A. G., Hartwell, L. H. A checkpoint regulates the rate of progression through S phase in S. cerevisiae in response to DNA damage. Cell. 82 (5), 841-847 (1995).
- Guo, Z., Kumagai, A., Wang, S. X., Dunphy, W. G. Requirement for Atr in phosphorylation of Chk1 and cell cycle regulation in response to DNA replication blocks and UV-damaged DNA in Xenopus egg extracts. Genes Dev. 14 (21), 2745-2756 (2000).
- Jazayeri, A., Balestrini, A., Garner, E., Haber, J. E., Costanzo, V. Mre11-Rad50-Nbs1-dependent processing of DNA breaks generates oligonucleotides that stimulate ATM activity. EMBO. J. 27 (14), 1953-1962 (2008).
- Kumagai, A., Dunphy, W. G. Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts. Mol. Cell. 6 (4), 839-849 (2000).
- Yan, S., Lindsay, H. D., Michael, W. M. Direct requirement for Xmus101 in ATR-mediated phosphorylation of Claspin bound Chk1 during checkpoint signaling. J. Cell Biol. 173 (2), 181-186 (2006).
- Shiotani, B., Zou, L. Single-stranded DNA orchestrates an ATM-to-ATR switch at DNA breaks. Mol. Cell. 33 (5), 547-558 (2009).
- Tutter, A. V., Walter, J. C. Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs. Methods Mol. Biol. 322, 121-137 (2006).
- Cross, M. K., Powers, M. Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts. J. Vis. Exp. (18), e891 (2008).
