Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

التصوير pHluorin الموسومة الإدراج مستقبلات غشاء البلازما إلى الخلايا العصبية في الابتدائية الماوس مثقف

Published: November 20, 2012 doi: 10.3791/4450
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1The Jackson Laboratory

Summary

من علامات المجالات خارج الخلية من مستقبلات الغشاء مع pHluorin superecliptic، والتصوير هذه المستقبلات في الخلايا العصبية الماوس الانصهار مثقف، يمكننا تصور الأحداث مباشرة الفردية الإدراج حويصلي في المستقبلات إلى غشاء البلازما. هذه التقنية سوف يكون مفيدا في توضيح الآليات الجزيئية التي تحكم الإدراج مستقبلات للغشاء البلازما.

Abstract

A فهم أفضل للآليات التي تحكم الاتجار مستقبلات بين غشاء البلازما (PM) ومقصورات داخل الخلايا يتطلب المنهج التجريبي مع ممتازة الدقة المكانية والزمانية. وعلاوة على ذلك، يجب أن هذا النهج أيضا لديها القدرة على التمييز المستقبلات المترجمة على PM عن تلك الموجودة في حجرات داخل الخلايا. الأهم من ذلك، كشف المستقبلات في حويصلة واحدة يتطلب المعلقة حساسية الكشف، لأن كل حويصلة يحمل سوى عدد قليل من المستقبلات. نهج قياسية لدراسة الاتجار مستقبلات تشمل biotinylation سطح تليها الكشف الكيمياء الحيوية، والتي تفتقر إلى كل القرارات اللازمة المكانية والزمانية، ومضان المجهري الفحص من المستقبلات السطحية immunolabeled، الأمر الذي يتطلب التثبيت الكيميائي للخلايا وبالتالي تفتقر إلى القرار الزمنية الكافية 1-6. للتغلب على هذه القيود، وضعنا وغيرهم وتوظيف سترا جديدةtegy أن تمكن من التصور الدينامي للمستقبلات الإدراج في قرارات PM مع ممتازة المكانية والزمانية 7-17. يشمل النهج علامات من GFP درجة الحموضة حساسة، وpHluorin superecliptic 18، إلى المجال N-محطة خارج الخلية من المستقبلات. Superecliptic pHluorin له خاصية فريدة من كونها الفلورسنت في الرقم الهيدروجيني محايدة وغير الفلورسنت، في الرقم الهيدروجيني الحمضية (الرقم الهيدروجيني <6.0). ولذلك، فإن مستقبلات المفتاحية هي غير الفلورسنت عندما الحمضية داخل التجويف من الحويصلات الاتجار داخل الخلايا أو الأجزاء endosomal، وتصبح بسهولة تصور فقط عندما تتعرض للبيئة محايد الرقم الهيدروجيني خارج الخلية، على السطح الخارجي للPM. استراتيجيتنا يسمح بالتالي لنا أن نميز بين مستقبلات سطح PM من داخل تلك الحويصلات الاتجار داخل الخلايا. لتحقيق ما يكفي من القرارات المكانية والزمانية، وكذلك الحساسية اللازمة لدراسة الاتجار ديناميكية من المستقبلات، قمنا بتوظيف الداخلية تعكس إجماليأيون المجهر الفلورسنت (TIRFM)، والتي مكنتنا من تحقيق القرار الأمثل المكاني للتصوير الضوئي (~ 170 نانومتر)، والقرار الزمني للفيديو معدل المجهري (30 إطارات / ثانية)، وحساسية للكشف عن مضان GFP من واحد جزيء. عن طريق التصوير pHluorin الموسومة تحت المستقبلات TIRFM، كنا قادرين على تصور الأحداث مباشرة الفردية الإدراج في مستقبلات الخلايا العصبية مثقف PM في. يمكن أن يحتمل هذا النهج التصوير تطبيقها على أي بروتين الغشاء مع مجال خارج الخلية التي يمكن أن يكون المسمى مع pHluorin superecliptic، وسوف تسمح تشريح آليات مفصلة الرئيسية التي تحكم الإدراج من البروتينات الغشاء مختلفة (المستقبلات، وقنوات أيون، نقل، الخ) ل وPM.

Protocol

1. إعداد الماوس الثقافة الدبقية لتكييف ثقافة العصبية

  1. والمغلفة T75 القوارير مع الحل الكولاجين (1:3 التخفيف من Purecol في DDH 2 O). يتم تعيين قوارير تستقيم وتترك لتجف ليلة وضحاها في نسيج الثقافة هود.
  2. تشريح العازلة (ACSF: 119 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 30 مم سكر العنب، HEPES 25 مم، ودرجة الحموضة 7.4، دون الكالسيوم) وسائل الإعلام الدبقية (DMEM تستكمل مع FBS 10٪، ووحدات 10 / البنسلين مل، 10 يتم إعداد ميكروغرام / مل الستربتوميسين، وGlutamax) وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للاستخدام.
  3. في يوم الثقافة الدبقية، وتحسنت وسائل الإعلام الدبقية لمدة لا تقل 30 دقيقة في حمام مائي 37 ° C تشريح أدمغة قبل الماوس. يصرح باستخدامها في الفئران الجنينية أو بقطع الرأس حديثي الولادة السريعة. واللحاء الدماغي من تشريح تحت المجهر تشريح.
  4. يتم هضمها تشريح أنسجة المخ في حل غراء (100 مل و 20 ميكرولتر غراء 1٪ الدناز I في 2 مل العازلة تشريح) في 37 ° C FOص 20 دقيقة.
  5. بعد الهضم غراء، وتشطف أنسجة المخ مع 10 مل وسائل الاعلام قبل تحسنت الخلايا الدبقية. ثم يتم إضافة وسائل الإعلام الدبقية الطازجة (2 مل) إلى أنسجة المخ هضمها، وtriturated الأنسجة مع ماصة باستور النار مصقول الزجاج.
  6. يضاف سائل الإعلام الدبقية الطازجة (8 مل) إلى الأنسجة فصلها. ويستخدم 70 ميكرومتر مصفاة الخلية لتصفية التعليق الأنسجة فصلها. والمصنف ثم الخلايا في قوارير T75 (عادة 2-3 الأجنة يمكن البذور من قارورة T75)، ووضع في 37 ° C الخلية الحاضنة الثقافة.
  7. في اليوم التالي، ويستنشق وسائل الإعلام من قوارير T75. وشطف القوارير مع PBS مل 10. ثم يتم إضافة وسائل الإعلام الدبقية الطازجة (10-15 مل) إلى كل القارورة.
  8. في غضون 10-12 يوما، ينبغي الدبقية في قوارير T75 تكون متموجة. وتشطف الخلايا الدبقية مع PBS، ويضاف 5 مل من التربسين 0.05٪ لكل قارورة T75.
  9. بعد مرور فترة الحضانة التربسين عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، والخلايا الدبقية هي تقسيم الخلايا الدبقية وفصلها عن بعضها قارورة T75 إلى قسمينالكولاجين مختلفة المغلفة T75 القوارير.
  10. وتعد إدراج الثقافة (ميليبور PICM03050) عن طريق وضعها في لوحات 6 حسنا، طلاء لهم الكولاجين، وتجفيف الهواء بين عشية وضحاها. يتم وضع وسائل الإعلام الدبقية (2 مل لكل منهما) تحت كل إدراج الثقافة.
  11. وtrypsinized الدبقية من قوارير T75 متكدسة والمصنف على وإدراج الثقافة (واحد T75 قارورة في لوحة 6 جيدا، 2 مل كل إدراج). وسوف تستخدم هذه الثقافة الدبقية لإدراج شرط الثقافات العصبية.

2. العصبية الثقافة

  1. يتم تنظيف الزجاج coverslips للثقافة العصبية عن طريق نقع في 70٪ على الأقل HNO 3 ليلة وضحاها. ثم تغسل مع Coverslips 2 مرات على الأقل DDH 3 O، وتجفف في فرن Isotemp (> 200 ° C) بين عشية وضحاها.
  2. توضع في coverslips تنظيف لوحة 6 جيدا، واحدة ساترة لكل بئر. والمغلفة مع البولي Coverslips-L-يسين الحل (2 مل، 0.1٪ في حامض البوريك 100 ملم، ودرجة الحموضة = 8.5) بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية الحاضنة.
  3. التتم إزالة بولي-L-يسين حل من coverslips وتغسل coverslips 3 مرات مع 2 تعقيمها O. DDH ثم يتم تحضين Coverslips في 37 ° C حاضنة ليلة وضحاها في وسائل الإعلام الطلاء (Neurobasal تستكمل مع 5٪ من مصل الحصان للحرارة المعطل، ووحدات 10 / البنسلين مل، 10 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، Glutamax، 2٪ B27 الملحق يضاف إلى الطلاء المتوسطة في اليوم يتم استخدامه).
  4. وأضاف في اليوم التالي، وسائل الإعلام والطلاء تتم إزالة 2 مل من وسائل الإعلام الطلاء الطازجة مع B-27 لكل بئر يحتوي على ساترة الزجاج.
  5. يصرح باستخدامها في الفئران الحوامل (E15-18) مع CO 2، ويصرح باستخدامها في الفئران الجنينية بقطع الرأس. يتم تشريح قرن آمون أو المخطط من أنسجة المخ، ووضع في أنبوب 15 مل المخروطية مع الثلج الباردة العازلة تشريح، للثقافة من الخلايا العصبية قرن آمون أو الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة الجسم المخطط، على التوالي.
  6. تشريح أنسجة المخ هي فصل مع غراء كما هو موضح في الخطوات 1.4) و 1.5).
  7. Following التفكك، يتم حساب عدد الخلايا العصبية في كل التعليق مع عدادة الكريات. والمصنف ثم الخلايا العصبية على كل ساترة في مناطق ذات كثافة الخلايا قدره 0.4 × 6 10 في جانب من لوحة 6 جيد، ومثقف في 37 ° C حاضنة ليلة وضحاها (الخلايا العصبية هي DIV 0).
  8. لإعداد إدراج الثقافة الدبقية لتكييف الثقافات العصبية، تتم إزالة وسائل الإعلام من الخلايا الدبقية إدراج الثقافة الدبقية ويضاف الطازجة المتوسطة الطلاء (2 مل في إدراج و2 مل تحت إدراج).
  9. في اليوم التالي (DIV 1)، يتم وضعها coverslips مع الخلايا العصبية تحت إدراج الثقافة الدبقية، واحدة في كل ساترة أيضا.
  10. ويتم تغذية الخلايا العصبية مع حجم نصف الطازجة وسائل الاعلام قبل تحسنت التغذية (مع B-27) كل 3-4 أيام حتى تكون جاهزة للتجارب ترنسفكأيشن والتصوير.

3. ترنسفكأيشن

  1. يتم تنفيذ ترنسفكأيشن العصبية باستخدام Lipofectamine 2000. لكل ثقافة العصبية (ثقافة واحدة في ساترة)، 2 ميكرولتروتستخدم Lipofectamine 2000 و 1 ميكروغرام من الحمض النووي. ويستخدم المتوسط ​​Neurobasal الطازجة مع عدم وجود ملحق لتخفيف Lipofectamine وDNA.
  2. ويتم تحضين DNA Lipofectamine لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعد الخلط.
  3. حفظ 1 مل من وسائل الإعلام من تحت كل الدبقية إدراج الثقافة، و1 مل من داخل كل إدراج، ونقل وسائل الإعلام لأنبوب مخروطي الشكل. إضافة وحدة التخزين نفسها من وسائل الاعلام تغذية + B27 إلى حفظ المتوسطة واحتضان عند 37 درجة مئوية. يتم استخدام هذه الوسيلة للثقافة العصبية بعد ترنسفكأيشن.
  4. بعد الحضانة Lipofectamine / 20-DNA دقيقة، يتم إزالة إدراج الثقافة الدبقية حظات من 6 لوحات جيدا. يتم إضافة 200 ميكرولتر Lipofectamine / DNA الخليط إلى كل ساترة مع الخلايا العصبية. يتم إرجاع ثم إدراج الثقافة الدبقية إلى كل بئر، فوق الخلايا العصبية. وينبغي تجنب توليد فقاعات تحت غشاء من إدراج الثقافة. يتم تحضين الخلايا العصبية مع خليط Lipofectamine / C DNA في ° 37 لمدة 2-4 ساعة.
  5. بعد اله الحضانة 2-4 ساعة فترة، تتم إزالة الخلايا الدبقية إدراج مرة أخرى. تتم إزالة وسائل الإعلام والثقافة مع خليط Lipofectamine / DNA من كل بئر. وأضاف وسائل الإعلام بحفظه في الخطوة 3.3) إلى الخلايا العصبية (2 مل لكل بئر). يتم إرجاع إدراج الثقافة الدبقية إلى كل بئر، وتتم إزالة الخلايا الدبقية وسائل الإعلام من كل إدراج، ويضاف 2 مل من وسائل الإعلام من الخطوة 3.3) في كل إدراج.
  6. يتم استزراع الخلايا العصبية لساعة إضافية للسماح 24-72 يتم تنفيذ التعبير عن [كدنا] تقاس قبل التصوير TIRF على هذه الخلايا العصبية.

4. TIRF التصوير

  1. وسوف تستخدم لتصوير تجارب حية: السائل النخاعي الاصطناعي (119 ملي كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي بوكل، 30 ملم الجلوكوز، 2 مم CaCl 2، 1 ملم MgCl 2 و 25 ملي HEPES، ودرجة الحموضة = 7.4 ACSF). نظامنا التصوير TIRF هو العرف انشاء مع ليزر ازرق سماوي 100-ميغاواط لالإثارة، وضرب شحنة الإلكترون إلى جانب جهاز (EMCCD) وكاميرا للكاشف.
  2. قبل التجارب والتصوير، وحذر ACSF في 37 و دعلى سبيل المثال؛ C حمام الماء لمدة لا تقل عن 30 دقيقة. يتم وضع إدراج التدفئة للتصوير حية على المسرح المجهر، ويتم إدراج حرارة التسخين، ليزر، والكاميرا ما لا يقل عن 30 دقيقة قبل بدء التجارب التصوير.
  3. يتم تجميع الخلايا العصبية مع ساترة بالنقل الى غرفة التصوير الحية. يتم وضع ACSF قبل تحسنت في غرفة بعد غرفة يتم تجميعها، وينبغي أن تكتمل هذه الخطوة في أسرع وقت ممكن.
  4. مرة واحدة يتم وضع دائرة على إدراج التدفئة على المسرح المجهر، ويتم تحديد الخلايا العصبية بالنقل بصريا تحت وضع التصوير برنامج التحصين الموسع-الفلورسنت.
  5. بعد تحديد الخلايا العصبية بالنقل صحية (يرجى الرجوع إلى الأرقام 1 و 2)، ونحن عادة ما تؤدي 1 دقيقة من التبييض، صور للقضاء على القائمة من قبل pHluorin مضان على الغشاء البلازمي، وpHluorin المستقبلات على غشاء البلازما لديهم مستويات عالية جدا عندما مضان وبدأت لأول مرة TIRF التصوير، والتي تتعارض مع التصور من الوظائف الفرديةertion الأحداث.
  6. بعد photobleach، تم تعيين إعداد مكسب مضاعف من الإلكترون على الكاميرا EMCCD إلى الحد الأقصى، ويتم تنفيذ التسجيل لمدة 1 دقيقة في 10 هرتز.
  7. سوف تحتوي على 600 تسجيل كل الصور. يتم تحديد الأحداث الفردية من خلال اللعب الإدراج الجزء الخلفي التسجيل باستخدام يماغيج. يتم تحليل الأحداث الإدراج الفردية يدويا باستخدام يماغيج.

5. ممثل النتائج

ثقافة العصبية يتفق هو المفتاح لتجارب حية للتصوير ناجحة. ويظهر الشكل 1 الخلايا العصبية قرن آمون الماوس مثقف باستخدام بروتوكول لدينا من 11 إلى DIV DIV 18. يبدو واضحا من الصور التي وضعت الخلايا العصبية عمليات واسعة النطاق والتي يتم تناولها في عمليات كثيفة مع شجيري العمود الفقري شجيري، مؤشرات على أن هذه الخلايا العصبية في صحة جيدة في الثقافة. ويمكن أيضا بروتوكول ثقافتنا أن تستخدم لأنواع أخرى من الخلايا العصبية في الدماغ. على سبيل المثال، كنا في الآونة الأخيرة هذا البروتوكول للثقافةالجسم المخطط الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة في دراسة مستقبلات D2 لدراسة الدوبامين (DRD2) الإدراج في الجسم المخطط الماوس مثقف الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة 9. ويبين الشكل 2 الماوس الجسم المخطط المتوسطة الخلايا العصبية الشوكية مثقف باستخدام بروتوكول لدينا في DIV 8. لدينا أيضا أجريت بنجاح TIRF تصوير superecliptic DRD2s pHluorin الموسومة في هذا النوع من الخلايا العصبية. ويبين الشكل 3 التعبير عن pHluorin الموسومة DRD2 (درجة الحموضة، DRD2) في الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة والتصور من درجة الحموضة DRD2-الإدراج في هذه الخلايا العصبية.

الشكل 1
ثقافة الرقم الماوس 1. الحصين باستخدام طريقة اجهة الثقافة. DIV: أيام في المختبر، ويعتبر اليوم من ثقافة وDIV 0. من الصور، من الواضح أن الخلايا العصبية قرن آمون ناضجة في هذا النوع من الثقافة بين 11 و DIV DIV 15. في DIV 11 و 13، وتغطي التشعبات العصبية والعمود الفقري مع filipodia غير ناضجة. و 15 في DIV18، وتغطي التشعبات العصبية مع العمود الفقري كبيرة، مؤشرا على الخلايا العصبية أكثر نضجا. لوحات من الزمن: منخفضة التكبير الصور من الخلايا العصبية قرن آمون الماوس في أعمار مختلفة. لوحات اليمين: عالية التكبير الصور (التكبير في التشعبات العصبية من اللوحة اليسرى) من عمليات شجيري الخلايا العصبية مع العمود الفقري شجيري في أعمار مختلفة.

الشكل 2
الشكل 2. ماوس الجسم المخطط مستنبت الخلايا العصبية الشوكية باستخدام طريقة اجهة الثقافة. الخلايا العصبية في الصور هي في DIV 8.

الشكل 3
الشكل 3. فأر الجسم المخطط الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة transfected مع مسير الشمس السوبر مستقبلات D2 pHluorin الموسومة الدوبامين (درجة الحموضة، DRD2). الصورة على اليسار هو الحد الأقصى الإسقاط كثافة تسجيل الوقت الفاصل بين (600 الصور، 100 ميللي ثانية لكل صورة). رؤوس سهام بيضاء تشير الإدراج حويصلي الفردية من درجة الحموضة-DRD2. هذه الصورة يحتفظ المعلومات الإدراج في البعد XY لكن يفقد معلومات الوقت. الصورة على اليمين يظهر YT الإسقاط كثافة الحد الأقصى، الذي هو مكدس xyt استدارة 90 درجة حول محور y، ويتوقع أن الحد الأقصى بكسل في كل سطر على محور س ص بكسل محور واحد. هذه الصورة يحتفظ المعلومات الإدراج على طول محور YT لكن يفقد المعلومات محور س.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لأسباب غير معروفة، الخلايا العصبية الماوس دائما أكثر صعوبة من الخلايا العصبية في الثقافة الفئران. في تجربتنا، وثقافة مختلطة من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية يعمل بشكل جيد لالخلايا العصبية الأولية الماوس مثقف. ومع ذلك، هذه الثقافة المختلطة ليست مناسبة للتجارب التصوير TIRF، كما هو الحال في هذا النوع من الخلايا العصبية الثقافة وعملياتها تميل إلى النمو على أعلى من الخلايا الدبقية، وتوضيع somata العصبية والعمليات شجيري بعيدا عن متناول المجهر TIRF. ولذلك، وثقافة أقل كثافة الخلايا العصبية مع الخلايا الدبقية قليلة على ساترة مثالية للتصوير TIRF. نحن أول اختبار الأسلوب بانكر 19؛ 20، التي بذرت الجزء السفلي من صحن الثقافة مع الخلايا الدبقية، والخلايا العصبية المصنف على ساترة وضعت رأسا على عقب في طبق الثقافة. يتم فصل ساترة وطبقة الخلايا الدبقية التي كتبها ثلاث قطرات صغيرة من الشمع على ساترة. هذا الأسلوب يعمل بشكل جيد لأصغر حجم coverslips (مثل coverslips 15-مم أو 18 مم)، ولكن عندما تم اختبار استخدام 25 ملم المشتركverslips، كانت الخلايا العصبية بالقرب من مركز للcoverslips يست صحية مثل تلك القريبة من حواف ساترة.

في حين أن سبب هذا الاختلاف في صحة الخلايا العصبية لم يكن واضحا بالنسبة لنا، نحن مسبب أنه قد يكون بسبب انتشار محدود من المواد المغذية إلى وسط منطقة ساترة. ولذلك لجأنا إلى واجهة أسلوب الثقافة وصفها في هذا المخطوط، وغشاء من الثقافة يسمح إدراج نشرها خالية من المواد المغذية إلى الخلايا العصبية على coverslips. نحن الخلايا العصبية المصنفة في 25 ملم coverslips، مع الخلايا العصبية التي تواجه التصاعدي. نحن المصنف الدبقية على إدراج الثقافة، ووضع الإدراج تغذية الخلايا الدبقية على رأس ساترة. قررنا أن الطريقة الثقافة اجهة متفوقة على وسائل أخرى اختبرناها عند استخدام 25-مم coverslips للثقافة الماوس منخفض الكثافة العصبية، وتعطي نتائج متسقة للتصوير TIRF. لتحديد خصائص الإدراج مستقبلات (التردد، السعة)، والمجموعة الضابطة مع الخلايا العصبية تقاس ثوينبغي دائما إيث المستقبلات wildtype pHluorin الموسومة إدراجها. هذه المجموعة الضابطة أيضا بمثابة اختبار الجودة للثقافة العصبية.

هي التي شيدت نظامنا يعتمد على TIRFM المجهر دليل AxioObserver زايس (كارل زايس MicroImaging، وشركة، Thornwood، NY). ليزر الإثارة هو 488nm-100MW نيوبورت سيان ليزر نظام (نيوبورت شركة، إرفين، CA). ويقترن الليزر لشريط التمرير عبر الألياف TIRF زايس بصري KineFLEX-P-2-S-488-640-0،7-FCP-P2 (المصدر نقطة، نقطة ميتشل، HAMBLE، UK). واستخدم مرآة مزدوج اللون Z488RDC (صفاء شركة تكنولوجيا، الخوار شلالات، VT) لعكس الليزر واردة على خطة α-100X زايس عدسة الهدف (NA = 1.46 كارل زايس). تم استخدام ET525/50 الانبعاثات تصفية (صفاء شركة تكنولوجيا) للكشف مضان GFP. تم استخدام الكاميرا EMCCD تتطور (Photometrics، توكسون، من الألف إلى الياء) كما كشف. أضيفت عدسة تتابع 2.5X بين المجهر والكاميرا منفذ كام فيعهد من أجل تحقيق القرار المكانية الأمثل (0.064 ميكرون لكل بكسل عند استخدام NA = 1،46 الهدف 100X). واستمر الكاميرا في C ° -80 خلال تجارب التصوير. تم دمج A LS6 Uniblitz مصراع تسيطر عليها وحدة تحكم VMM-D3 (فنسنت شركاه، روتشستر، نيويورك) بين رأس الليزر والألياف قاذفة. تم الحصول عليها باستخدام البيانات μManager البرمجيات ( http://www.micro manager.org / ).

أجريت جميع التجارب في التصوير C ° 37 في حل ACSF تحتوي على 2 مم CaCl 2. ويتم تعديل هذا الحل ACSF لدرجة الحموضة = 7.4 في درجة حرارة الغرفة. عندما تحسنت إلى 37 درجة مئوية، ودرجة الحموضة من هذا ACSF يصبح 7.2، وهو الأمثل لالخلايا العصبية في الثقافة. خلال الاستحواذ، تم تعيين الحد الأقصى ليزر الطاقة في، سواء بالنسبة للمواد التبييض، وصور لحيازة البيانات. تم تعيين التعرض الكاميرا في 100 ميللي ثانية، ومعدل الاستحواذ كان 10 صور في الثانية (10 هرتز). تم تعيين مكسب على EMCCDر القصوى. وقد تم تحليل التسجيلات باستخدام يماغيج البرمجيات (Rasband، WS، NIH، http://rsb.info.nih.gov/ij/ ، 1997-2012)، وسجلت الأحداث وتحليلها الإدراج يدويا. واتخذت الأحداث الإجمالية للدقيقة الواحدة لكل وحدة مساحة وتواتر الإدراج، وكانت تطبيع مع مجموعة التحكم إلى 100٪. وقد تم توليد الصور YT المقدمة في يماغيج عن طريق تناوب المكدس xyt الأصلي 90 درجة على طول المحور Y، وكان من المتوقع كثافة القصوى من كل سطر X على بكسل واحد من المحور ص باستخدام الإسقاط كثافة الحد الأقصى الخوارزمية في يماغيج.

ويلاحظ عادة الأحداث الإدراج والظهور المفاجئ لبونتا الفلورسنت (سريع مرحلة ارتفاع)، تليها مرحلة المتحللة التي تمثل مستقبلات نشر على غشاء البلازما 7؛ 9. ظهور بونتا الفلورسنت مع ارتفاع مرحلة بطيئة أو تلك دون مرحلة اضمحلال واضح (disappe المفاجئويستثنى arance) من تحليل البيانات، وهذه الأحداث تمثل المرجح الاتجار حويصلات داخل الخلايا التي تحتوي على تجويف أقل الحمضية (مثل تلك الموجودة في الشبكة الإندوبلازمية). سوف Photobleach الموجودة من قبل السكان مستقبلات سطح تقليل أيضا المساهمة القائمة من قبل المجموعات سطح مستقبلات على غشاء البلازما. حتى الآن، ويتم تحليل جميع البيانات يدويا باستخدام لدينا يماغيج. سوف التنمية المستقبلية للخوارزميات الحاسوب للكشف عن الحدث الآلي وتحليل البيانات من المهم لتسهيل التكيف وتطبيق هذه الطريقة لفحص التصوير الإدراج مستقبلات للغشاء البلازما.

من أجل تصور الأحداث الفردية الإدراج حويصلي من pHluorin التي تحمل علامات المستقبلات، معلمات هامة عديدة يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار. أولا، يجب أن الإثارة ليزر تكون قوية بما يكفي لتمكين الكشف عن مضان من الحويصلات واحد. في نظام مصمم خصيصا لدينا، وكنا من 10 0-488 ميغاواط نانومتر ليزر كمصدر الإثارة لدينا. ثانيا، كاشف للنظام التصوير يحتاج إلى كلا من الحساسية وسرعة الحصول على البيانات من الوقت الحقيقي، الإدراج مستقبلات الحيوية. لهذه الأسباب، ونحن استخدام EMCCD في نظامنا. مزيج من الإثارة ليزر قوية وكاشف واحد EMCCD يقدم كشف جزيء القدرة GFP في نظام التصوير لدينا. ويستند اختيارنا للنظام TIRF مصمم خصيصا على تحقيق أقصى قدر من الأداء من الموارد المتاحة محدودة. تجدر الإشارة إلى أن أي نظام TIRF المتاحة تجاريا بما يكفي من الإثارة ليزر الطاقة (100 ميغاواط 488 نانومتر ليزر يكفي لأغراضنا، ومتوفرة بسهولة على معظم المنصات التجارية) وكاميرا EMCCD ينبغي أن تكون أيضا مناسبة للتصوير مثل هذه الدراسات. لذلك، لا يقتصر التكيف من الدراسات مثل التصوير بواسطة الخلايا العصبية لأداء النظام TIRFM، ولكن من نوعية الثقافة الخلايا العصبية والخلايا العصبية الاتساق بين الثقافات

ove_content "> ثالثا، نظرا لمضان الأولي من القائمة pHluorin الموسومة مستقبلات غشاء البلازما، photobleach تحت وضع TIRF هو عادة ضرورية للكشف عن مضان من حويصلة واحدة. ونحن أداء عادة 1-photobleach دقيقة باستخدام وضع التصوير في أقصى TIRF قوة الليزر مرة واحدة يتم تحديد بصريا الخلايا العصبيه، مما يؤدي إلى القضاء على معظم القائمة من قبل سطح pHluorin مضان. ومن المهم أيضا أن نأخذ في الاعتبار أن ارتفاع القوة الإثارة الليزر يزيد أيضا من احتمال حدوث تلف الليزر والضيائية. في تجربتنا ، وذلك باستخدام 100-488 ميغاواط ميغاواط الليزر كمصدر الإثارة لا يبدو أن أعرض لأضرار ملحوظة الخلايا العصبية داخل البيانات اقتناء الفترة، في الوقت الذي توفر ما يكفي من قوة الليزر لتصور المستقبلات في الحويصلات واحد. وهناك اعتبار آخر مهم هو أن الاختلافات في وأنواع وأعداد من المستقبلات في كل حويصلة تؤثر أيضا على شرط الإثارة الليزر.على سبيل المثال، كنا في السابق قادرة على تنظيم دراسة الغلوتامات الإدراج مستقبلات الوحيدات GluA1 إلى غشاء البلازما باستخدام الإثارة ميغاواط الليزر 50-7. نقدر أن كل حويصلة درست في هذه الدراسة الواردة 56 ± 6 GluA1 الجزيئات، على غرار التقدير التي قدمتها مجموعة أخرى باستخدام أساليب مماثلة 12. في دراستنا الأخيرة من DRD2، قدرنا أن كل حويصلة الواردة 30 ± 1 الجزيئات، والليزر 100-ميغاواط كان كافيا لتلك الدراسة. ومع ذلك، بسبب ارتفاع مستوى الضوضاء في الخلفية في الخلايا الحية، ودراسة الجزيئات حويصلة تحتوي على مستقبلات عدة فقط (على سبيل المثال، 5-10) قد تتطلب قوة الليزر أعلى من 100 ميغاواط من أجل تحقيق ما يكفي من الإشارات إلى نسبة الضوضاء لرؤية الإدراج إلى مستقبلات غشاء البلازما في الخلايا العصبية. العثور على التوازن الصحيح للقوة والإثارة حساسية المهم للتخطيط لدراسة ناجحة.

استخدام TIRFM إلى طوقد تم تطبيق بركه superecliptic المستقبلات pHluorin الموسومة لعدة أنواع مختلفة من الخلايا العصبية مستقبلات 7-17. ومع ذلك، فمن المهم جدا أن نضع في اعتبارنا أن الطريقة الحالية لدينا تعتمد على مستقبلات علامات مع جزيء GFP وoverexpression من المستقبلات المفتاحية. قد ربط جزيء GFP إلى المجال خارج الخلية من البروتين غشاء تتدخل في وظيفة البروتين، وبالتالي فمن الحرجة للتحقق من أن هذه الاستراتيجية لا تتدخل بشكل كبير العلامات مع وظيفة البروتين قيد التحقيق 9. وعلاوة على ذلك، قد مستقبلات overexpressed أو لا تكون خاضعة لآليات تنظيمية التي تحكم الاتجار المستقبلات الذاتية. ولذلك هناك حاجة إلى طرق مستقلة للتحقق من صحة النتائج التي تم الحصول عليها من المستقبلات التصوير pHluorin الموسومة overexpressed. على سبيل المثال، في دراساتنا من GluA1 تم التحقق من صحة الإدراج 7، والاتجار التعبير سطح متشابك من المستقبلات الذاتية ش GluA1الغناء المناعية القياسية / أساليب الكيمياء الحيوية أو النهج الكهربية. وخلاصة القول، نهجنا التصوير، إلى جانب غيرها من الطرق القياسية للاتجار البروتين الغشاء، ومن المرجح أن تكون مفيدة في تشريح مفصل آليات الجزيئية والخلوية التي تحكم البلازما الإدراج غشاء من البروتينات الغشائية الأخرى في الخلايا العصبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

ويدعم هذا العمل من جانب صناديق بدء التشغيل من مختبر جاكسون.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
purified bovine collagen solution (Purecol) Advanced Biomatrix 5005-B
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) GIBCO, by Life Technologies 14185-045
penicillin-streptomycin (Pen Strep) GIBCO, by Life Technologies 15140-122
sodium pyruvate GIBCO, by Life Technologies 11360-070
DMEM High Glucose GIBCO, by Life Technologies 10313-021
fetal bovine serum (FBS)
GlutaMAX GIBCO, by Life Technologies 35050-061
papain Worthington Biochemical Corp. LS003126
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase I) Sigma-Aldrich DN25-10MG
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) GIBCO, by Life Technologies 14190-144
0.05% trypsin GIBCO, by Life Technologies 25300-054
poly-l-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P2636-1G
boric acid Fisher Scientific BP 168-500
Neurobasal Medium GIBCO, by Life Technologies 21103-049
B-27 Serum-Free Supplement GIBCO, by Life Technologies 17504-044
heat inactive horse serum GIBCO, by Life Technologies 26050-070
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668 019
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Culture Insert EMD Millipore PICM03050

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking. Neuron. 73, 482-496 (2012).
  2. Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic. Curr. Opin. Neurobiol. , (2012).
  3. Makuch, L., Volk, L., Anggono, V., Johnson, R. C., Yu, Y., Duning, K., Kremerskothen, J., Xia, J., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA. Neuron. 71, 1022-1029 (2011).
  4. Thomas, G. M., Lin, D. T., Nuriya, M., Huganir, R. L. Rapid and bi-directional regulation of AMPA receptor phosphorylation and trafficking by JNK. EMBO J. 27, 361-372 (2008).
  5. Lin, D. T., Huganir, R. L. PICK1 and phosphorylation of the glutamate receptor 2 (GluR2) AMPA receptor subunit regulates GluR2 recycling after NMDA receptor-induced internalization. J. Neurosci. 27, 13903-13908 (2007).
  6. Hayashi, T., Rumbaugh, G., Huganir, R. L. Differential regulation of AMPA receptor subunit trafficking by palmitoylation of two distinct sites. Neuron. 47, 709-723 (2005).
  7. Lin, D. T., Makino, Y., Sharma, K., Hayashi, T., Neve, R., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor extrasynaptic insertion by 4.1N, phosphorylation. 12, 879-887 (2009).
  8. Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 11080-11085 (2010).
  9. Li, Y., Roy, B. D., Wang, W., Zhang, L., Zhang, L. F., Sampson, S. B., Yang, Y. P., Lin, D. T. Identification of Two Functionally Distinct Endosomal Recycling Pathways for Dopamine D2 Receptor. Journal of Neuroscience. , (2012).
  10. Yu, Y. J., Dhavan, R., Chevalier, M. W., Yudowski, G. A., von Zastrow, M. Rapid delivery of internalized signaling receptors to the somatodendritic surface by sequence-specific local insertion. J. Neurosci. 30, 11703-11714 (2010).
  11. Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Distinct modes of regulated receptor insertion to the somatodendritic plasma membrane. Nat. Neurosci. 9, 622-627 (2006).
  12. Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., Leonoudakis, D., Panicker, S., Thorn, K. S., Beattie, E. C., von Zastrow, M. Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors. J. Neurosci. 27, 11112-11121 (2007).
  13. Ashby, M. C., De La Rue, S. A., Ralph, G. S., Uney, J., Collingridge, G. L., Henley, J. M. Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs. J. Neurosci. 24 (AMPARs), 5172-5176 (2004).
  14. Kopec, C. D., Real, E., Kessels, H. W., Malinow, R. GluR1 links structural and functional plasticity at excitatory synapses. J. Neurosci. 27, 13706-13718 (2007).
  15. Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64, 381-390 (2009).
  16. Makino, H., Malinow, R. Compartmentalized versus global synaptic plasticity on dendrites controlled by experience. Neuron. 72, 1001-1011 (2011).
  17. Wang, Z., Edwards, J. G., Riley, N., Provance, D. W., Karcher, R., Li, X. D., Davison, I. G., Ikebe, M., Mercer, J. A., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity. Cell. 135, 535-548 (2008).
  18. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  19. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  20. Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).

Tags

علم الأعصاب، العدد 69، البيولوجيا الخلوية، الهندسة الحيوية، والطب، والابتدائي الخلايا العصبية مثقف الماوس، pHluorin superecliptic، مستقبلات، والبلازما غشاء الإدراج، المجموع المجهري مضان التأمل الداخلي، الخلايا العصبية، والفئران، pHlourin الموسومة، والبلازما غشاء
التصوير pHluorin الموسومة الإدراج مستقبلات غشاء البلازما إلى الخلايا العصبية في الابتدائية الماوس مثقف
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Y., Roy, B. D., Wang, W., Zhang, … More

Li, Y., Roy, B. D., Wang, W., Zhang, L., Sampson, S. B., Lin, D. T. Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons. J. Vis. Exp. (69), e4450, doi:10.3791/4450 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter