Summary
Etiketleme tarafından superecliptic pHluorin membran reseptörlerinin ekstraselüler domain ve görüntüleme kültürlü fare nöronları bu füzyon reseptörleri, biz doğrudan plazma membran reseptörlerinin bireysel veziküler ekleme olayları oluşturulabiliyor. Bu teknik, plazma membran reseptör ekleme düzenleyen moleküler mekanizmalarının aydınlatılmasına vesile olacaktır.
Abstract
Plazma membranı (PM) ve hücre içi bölmeleri arasındaki reseptör ticareti düzenleyen mekanizmaların daha iyi anlaşılması, mükemmel uzaysal ve zamansal çözünürlükle deneysel bir yaklaşım gerektirir. Dahası, böyle bir yaklaşım, aynı zamanda hücre içi bölmelerde olanlardan ÖS lokalize reseptörler ayırt etmek yeteneğine sahip olmalıdır. Her bir vesikül reseptörlerinin sadece küçük bir bölümü taşıyan beri En önemlisi, tek bir vesikül reseptörleri tespit olağanüstü saptama hassasiyet gerektirir. Ve hücrelerin kimyasal sabitleme gerektirir immunolabeled yüzey reseptörleri, floresan mikroskop incelemesi ve bu nedenle yeterli zamansal çözünürlük 1-6 yoksun; reseptör ticareti incelemek için standart yaklaşımlar gerekli mekansal ve zamansal çözünürlükleri de yoksun biyokimyasal algılama, ardından yüzey biyotinilasyon içerir. Bu sınırlamaları aşmak için, biz ve diğerleri geliştirdi ve yeni bir stra istihdam var7-17 mükemmel uzaysal ve zamansal çözünürlükle PM içine reseptörlerinin dinamik ekleme görselleştirme sağlayan tegy olduğunu. Yaklaşım reseptörlerinin N-terminal hücre dışı etki alanına bir pH-duyarlı GFP, superecliptic pHluorin 18, bir etiketleme içerir. Superecliptic pHluorin asidik pH nötr pH ve floresan olmayan (pH <6.0) Flüoresan olmanın kendine has bir özelliği vardır. Bu nedenle, etiketli reseptör olmayan floresan zaman hücre içi veziküller ticareti ya da endozomal bölmelere bir asidik lümen içinde ve bunlar PM dış yüzeyi üzerinde, hücre dışı nötr pH ortamına maruz yalnızca kolaylıkla görselleştirilebilir hale gelir. Bizim stratejimiz dolayısıyla bize intraselüler kaçakçılığı veziküller içinde olanlardan PM yüzey reseptörleri ayırt etmenizi sağlar. Yeterli uzamsal ve zamansal çözünürlükleri, hem de reseptör dinamik çalışma ticareti için gerekli olan duyarlılık elde etmek için, kullanılan yansıtmak iç toplamBizi optik görüntüleme (~ 170 nm) iyi uzaysal çözünürlüğü elde etmek için etkin iyon floresan mikroskobu (TIRFM), video-oranı mikroskobu (30 kare / sn) ve duyarlılık zamansal çözünürlük tek GFP floresan tespit etmek molekülü. Görüntüleme By TIRFM altında reseptörleri, biz doğrudan bireysel reseptör ekleme olayların kültürü nöronlarında PM içine görselleştirmek başardık pHluorin etiketli. Bu görüntüleme yaklaşımı potansiyel superecliptic pHluorin ile etiketlenmiş edilebilir bir hücre dışı alanı ile herhangi bir zar proteini için uygulanabilir, ve farklı zar proteinleri (reseptörler, iyon kanalları, vs) yerleştirilmesi için yöneten kilit mekanizmasının detaylı bir teşrih izin verecektir PM.
Protocol
1. Nöronal Kültür İklimlendirme için Fare Glia Kültür hazırlanması
- T75 şişeler kolajen çözeltisi (GKD 2 O Purecol arasında 1:03 seyreltme) ile kaplanır. Şişeleri dik ayarlanır ve bir doku kültürü kaputu gecede kurumaya bırakılır.
- Diseksiyon tamponu (aCSF: 119 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM MgCI2, 30 mM glukoz, 25 mM HEPES, kalsiyum olmadan pH 7.4) ve glia ortamı (DMEM% 10 FBS, 10 birim / ml penisilin, 10 ile desteklenmiş ug / ml streptomisin, ve Glutamax) ° C Kullanım için hazır olana kadar hazırlanmış ve 4 depolanır.
- Glia kültür gününde, glia medya fare beyin teşrih önce 37 ° C su banyosu içinde en az 30 dakika için ısıtılır. Embriyonik veya yenidoğan farelerin hızla dekapitasyon tarafından ötenazi uygulanır. Serebral kortekste bir diseksiyon mikroskobu altında diseke edilir.
- Dissected beyin dokuları 37 ° papain çözeltisi (100 mi, papain ve 2 ml disseksiyon tampon içinde 20 ul% 1 DNase I) 'de sindirilir ° C for 20 dk.
- Papain sindirimi takiben beyin dokuları 10 ml önceden ısıtılmış glia ortamı ile çalkalanır. Taze glia ortamı (2 ml), sonra sindirilmiş beyin dokusu ilave edilir ve dokular bir ateş cilalı Pastör pipeti ile cam tritüre edilir.
- Taze glia ortamı (8 ml) ayrışmış dokulara ilave edilir. A 70 mikron hücre-süzgeç ayrışmış doku süspansiyonu filtrelemek için kullanılır. Hücreler daha sonra T75 matara (genellikle 2-3 embriyolar yapabilirsiniz tohumun T75 balonuna) içine ekilmiş ve 37 ° C hücre kültürü inkübatör yerleştirilir.
- Ertesi gün, T75 şişelerinden alınmış ortamı aspire edilir. Şişeler, 10 ml PBS ile durulanır. Taze glia ortamı (10-15 ml) daha sonra her bir balona ilave edilir.
- 10-12 gün içinde, T75 şişeler glia confluent olmalıdır. Glial hücreler, PBS ile yıkanır, ve% 0.05 tripsin, 5 ml T75 her bir şişeye ilave edilir.
- 5 dakika 37 ° C de tripsin inkübasyondan sonra, glial hücreler her T75 şişesi ayrılmış ve glial hücreler ikiye ayrılırFarklı kollajen kaplı T75 matara.
- Kültür uçlar (Millipore PICM03050) 6-well plate, kolajen ile kaplanmadan, ve bir gece boyunca hava-kurutma yerleştirerek hazırlanır. Glia ortamı (2 ml her biri) her bir kültür elemanı altına yerleştirilir.
- Konfluent T75 flasks Glia tripsinize ve (6 plaka başına bir T75 şişesi, 2 ml her ekleme) kültürü ekler üzerine numaralı seribaşı. Bunlar, glia kültür ekleri durum nöronal kültürler için kullanılır.
2. Nöronal Kültür
- Nöronal kültürü için cam lameller% 70 en az gecede HNO 3 iliklerine tarafından temizlenir. Lameller sonra GKD 2 O en az 3 kez suyla yıkandı, ve (> 200 ° C) bir karışımı, bir Isotemp fırın içinde kurutulmuştur.
- Temizlenmiş lamelleri 6-kuyu plakası, çukur başına bir lamel yerleştirilir. Lameller poli-L-Lizin çözeltisi (100 mM borik asit, 2 mi,% 0.1, pH = 8.5) 37 ° C inkübatör içinde gece boyunca kaplanmıştır.
- poli-L-Lizin çözeltisi lamelleri kaldırılır ve lamelleri otoklavlanmış GKD 2 O ile 3 kez yıkanır Lameller sonra bir 37 içinde inkübe edilir (Neurobasal% 5 ısı ile inaktive edilmiş at serumu, 10 birim / ml penisilin, 10 ug / ml streptomisin ile takviye Glutamax kaplama ortam içinde gece boyunca ° C inkübatör; kaplama ortam ilave edilir% 2 B27 eki gününde) kullanılır.
- B-27 ile bir sonraki gün, ortam kaplama çıkarılır ve taze kaplama ortam, 2 ml bir cam lamel olan her bir oyuğa ilave edilir.
- Hamile farelere (E15-18) CO 2 ile ötenazi, ve embriyonik fare dekapitasyon tarafından ötenazi uygulanır. Hipokampus ve striatum beyin dokusundan elde parçalara ayrıldı ve sırasıyla hipokampal nöronlar, orta ya da striatal nöronların dikenli kültür için buz gibi soğuk tampon disseksiyon, birlikte 15 ml konik bir tüp içine yerleştirilir.
- Adımlar 1.4) ve 1.5) 'deki gibi parçalanmış, beyin dokuları, papain ile ayrılmış bulunmaktadır.
- Fdisosiyasyon ollowing, her nöron süspansiyon hücrelerinin sayısını hemasitometre ile sayılır. Nöronlar, daha sonra bir 6-plaka başına 0.4 x da 10 6 hücre bir yoğunlukta her bir lamel üzerine ekildi ve bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde gece boyunca kültürlenmiştir (nöronlar DIV 0 dır).
- Klima nöronal kültürler için glia kültür ekleri hazırlamak için, glia medya glia kültürü ekler çıkarılır ve taze ortam kaplama (insert altında ekleme ve 2 ml 2 ml) ilave edilir.
- Ertesi gün (DIV 1), nöronlar ile lamelleri glia kültürü ekler, her iyi bir lamel altına yerleştirilir.
- Bunlar transfeksiyon deneyleri ve görüntüleme için hazır olana kadar Nöronlar, taze önceden ısıtılmış beslenme ortamı (B-27) ile her 3-4 günde yarım hacim ile beslenir.
3. Transfeksiyon
- Nöronal transfeksiyon lipofektamin 2000 kullanılarak yapılır. Her nöron kültürü için (lamel başına bir kültürü), 2 ulLipofektamin 2000 ve DNA 1 ug kullanılır. Herhangi bir ek ile taze Neurobasal orta lipofektamin ve DNA sulandırmak için kullanılır.
- DNA ve lipofektamin karıştırıldıktan sonra, oda sıcaklığında 20 dakika süreyle kuluçkaya bırakıldı.
- Her ekleme içeriden her glia kültür elemanı alttan medyanın 1 ml ve 1 ml Kaydet ve konik tüp medya aktarın. 37 kaydedilen orta ve inkübe ° C. besleme medya aynı hacimde + B27 ekle Bu ortam, aşağıdaki transfeksiyon nöronal kültürü için kullanılmıştır.
- 20 dk lipofektamin / DNA inkübasyon sonrasında, kültür glia uçlar 6 oyuklu plakalar arasında geçici kaldırılır. 200 ul lipofektamin / DNA karışım nöronları ile her bir lamel eklenir. Glia kültürü ekler sonra nöronlar üzerinde, her bir kuyucuğa döndürülür. Kültür uçların membranı altında kabarcıklarının üretilmesi kaçınılmalıdır. Nöronlar, 2-4 saat süre ile 37 ° C 'de lipofektamin / DNA karışımı ile inkübe edilir.
- Inci sonrae 2-4 saat inkübasyon dönemi, glia ekler tekrar kaldırılır. Lipofektamin / DNA karışımı ile kültür ortamı her kuyuya kaldırılır. Adım 3.3) içinde kaydedilmiş medya nöronlar (2 ml kuyu başına) ilave edilir. Glia kültürü ekler her bir kuyucuğa iade edilir ve her bir ucunun glia ortam çıkarılır, ve adım 3.3), ortam, 2 ml her ekleme içine ilave edilir.
- Nöronlar TIRF görüntüleme önce transfekte edilmiş cDNA ifade bu nöronlar üzerinde gerçekleştirilir izin vermek için ek 24-72 saat için kültürlenmiştir.
4. TIRF Görüntüleme
- Yapay serebrospinal akışkan (aCSF: 119 mM NaCI, 2.5 mM KCI, 30 mM glukoz, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 25 mM HEPES, pH = 7.4), canlı-görüntüleme deneyleri için kullanılacaktır. Bizim TIRF görüntüleme sistemi uyarılması için 100 mW Mavi lazer ile özel set-up ve Elektron çarpımı Şarj bir dedektör için Aygıt (EMCCD) kamera Coupled.
- Görüntüleme deneyleri öncesinde aCSF 37 & d uyarılırörneğin; en az 30 dakika süreyle C su banyosu. Canlı görüntüleme için ısıtma elemanı mikroskop sahne üzerine yerleştirilir ve ısıtma elemanı, lazer, kamera ve görüntü deneylerin başlamasından önce en azından 30 dakika için ısındı.
- Transfekte nöronlar olan bir lamel canlı görüntüleme odasının içine monte edilir. Odasına monte edildikten sonra önceden ısıtılmış aCSF odasına yerleştirilir; bu aşamada mümkün olduğu kadar çabuk tamamlanması gerekmektedir.
- Odanın mikroskop sahnede ısıtma elemanı yerleştirildikten sonra, transfekte nöronlar görsel epi-floresan görüntüleme modu altında tanımlanır.
- Transfekte sağlıklı nöron (Şekil 1 ve 2 ye bakınız) tespit edildikten sonra plazma membranı üzerinde pHluorin-reseptör çok yüksek floresans seviyelerini zaman olduğu gibi, genellikle, plazma membranı üzerinde önceden mevcut olan pHluorin floresan ortadan kaldırmak için foto-ağartıcı 1 dakika gerçekleştirmek TIRF görüntüleme ilk başlatıldığında, hangi bireysel ins görselleştirme müdahaleertion olaylar.
- Photobleach ardından EMCCD kamera elektron çoğaltıcı kazancı ayarını maksimum ayarlanır ve kayıt 10 Hz'de 1 dakika süreyle yapılır.
- Her kayıt 600 görüntüleri içerecektir. Bireysel ekleme olaylar ImageJ kullanarak kayıt oynatırken ile tanımlanır. Bireysel ekleme olaylar elle ImageJ kullanılarak analiz edilmektedir.
5. Temsilcisi Sonuçlar
Tutarlı nöronal kültürü başarılı canlı görüntüleme deneyleri için anahtardır. Şekil 1 fare hipokampal nöronlar 18 div DIV 11 bizim protokolü kullanılarak kültüre gösterir. Bu nöronlar kapsamlı süreçler gelişmiş ve ettiğinizi görüntülerden dendritik süreçleri dendritik dikenler, bu nöronların kültüründe sağlıklı olduğuna dair göstergeler ile yoğun kaplıdır açıktır. Bizim kültür protokolü de beyin nöron diğer tipleri de kullanılabilir. Örneğin, son zamanlarda kültür için bu protokolü kullanılırkültürlü fare striatal orta dikenli nöronlar 9 dopamin D2 reseptör (DRD2) ekleme incelemek üzere bir çalışma striatal orta dikenli nöronlar. Şekil 2 fare striatal orta dikenli nöronlar DIV 8 bizim protokolü kullanılarak kültüre gösterir. Biz de başarıyla nöron bu tip superecliptic pHluorin-etiketli DRD2s arasında TIRF görüntüleme gerçekleştirdik. Şekil 3 ifadesini gösterir pHluorin-etiketli bu nöron içinde pH DRD2 ekleme bir orta dikenli nöron ve görselleştirme DRD2 (pH-DRD2).
Arabirim kültür yöntemi kullanılarak Şekil 1. Fare hipokampal kültürü. DIV: In vitro gün, kültür gün DIV 0 olduğu kabul edilir. Görüntüleri bakıldığında, açıktır ki DIV 11 ve DIV 15 arasındaki kültür bu tip olgun hipokampal nöronlar. DIV 11 ve 13 yaşındayken, nöronal dendritler filipodia ve olgunlaşmamış dikenlerle kaplıdır. DIV 15 ve At18, nöronal dendritler, büyük dikenler daha olgun nöronların bir göstergesi kaplıdır. Sol panel: Düşük büyütme farklı yaşlarda fare hipokampal nöronlar görüntüleri. Sağ panel: yüksek büyütmeli görüntü (sol panel nöronal dendritler üzerinde yakınlaştırma) farklı yaşlarda dendritik dikenler nöronal dendritik süreçleri.
Arabirimi kültürü yöntemi kullanılarak Şekil 2. Fare striatal orta dikenli nöron kültürü. Görüntülerdeki Nöronlar DIV 8 altındadır.
Şekil 3,. Süper ekliptik pHluorin-etiketli dopamin D2 reseptörü (pH-DRD2) ile transfekte edilmiş bir fare striatal orta dikenli nöron. Soldaki görüntü bir time-lapse kayıt maksimum intensite projeksiyon (600 fotoğraf, görüntü başına 100 msn) 'dir. Beyaz ok uçları pH-D bireysel vesiküler ekleme belirtmekRD2. Bu görüntü xy boyut ekleme bilgilerini korur, ama zaman bilgilerini kaybeder. Sağdaki Resim xyt yığını y-ekseni etrafında 90 derece döndürülür ve her x ekseni hattında maksimum piksel tek bir y ekseni piksel yansıtılıyor olduğu, yt maksimum intensite projeksiyon gösterir. Bu görüntü yt ekseni boyunca ekleme bilgilerini korur, ama x-ekseni bilgileri kaybeder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bilinmeyen nedenlerden ötürü, fare nöronları zaman sıçan nöronlar daha kültürünün daha zordur. Bizim tecrübelerimize göre, nöronlar ve glia karışık kültürü birincil kültürlü fare nöronları için iyi çalışır. Nöronal somata ve TIRF mikroskopi ulaşamayacağımız dendritik süreçleri diyorum, glia hücreleri üstüne büyürler kültürü nöronlar ve bunların süreçleri bu tür Ancak, böyle bir karma kültür, TIRF görüntüleme deneyler için uygun değildir. Bu nedenle, lamel az glia ile daha düşük bir yoğunlukta kültür nöronal TIRF görüntüleme için idealdir. Bir kültür çanak alt glia ile tohumlanan, ve nöronların bir lamel üzerine ekildi ve kültür tabağına ters yerleştirdiğiniz 20; Biz ilk Banker yöntemi 19 test. Lamel ve glia katman lamel balmumu, üç küçük damlalar ile ayrılır. Bu yöntem, küçük boyutlu lamelleri (örneğin 15 mm veya 18 mm lamelleri gibi) için iyi çalışır, ama biz 25 mm eş kullanımı test edildiğindeverslips, lamelleri merkezine yakın nöronlar lamel kenarlarına yakın olanlar gibi sağlıklı değildi.
Nöron sağlığında bu farkın nedenini bize net değil iken, biz lamel alanının merkezine besinlerin sınırlı difüzyon nedeniyle olabilir ki gerekçeli. Kültür ucun membran lamelleri üzerine nöronlara besin serbest difüzyon sağlar gibi Bu nedenle, bu makalede anlatılan arabirimi kültürü yöntemi döndü. Yukarı bakacak nöronlar ile 25 mm lamelleri üzerine Biz numaralı seribaşı nöronlar. Biz bir kültür insert glia ekildi ve lamel üstüne glia besleyiciye yerleştirme yerleştirilir. Biz arabirimi kültürü yöntemi düşük yoğunluklu fare nöronal kültür için 25-mm lamelleri kullanırken test ettik diğer yöntemlere göre daha üstün olduğu belirlenmiştir ve TIRF görüntüleme için verimleri tutarlı sonuçlar. W transfekte nöronlarla reseptör ekleme özellikleri (frekans, genlik), kontrol grubu ölçmek içinITH yabani-tip pHluorin etiketlenmiş reseptörleri zaman dahil edilmelidir. Bu kontrol grubu da nöronal kültürü için bir kalite kontrol olarak hizmet vermektedir.
Bizim TIRFM sistemi manuel bir Zeiss mikroskobu AxioObserver (Carl Zeiss MicroImaging, Inc Thornwood, NY) göre yapılmıştır. Uyarma lazer Newport 488nm-100mW Mavi Lazer Sistemi (Newport Corporation, Irvine, CA) 'dir. Bir lazer KineFLEX-P-2-S-488-640-0.7-FCP-P2 optik fiber (Nokta kaynağı, Mitchell Point, Hamble, İngiltere) üzerinden bir Zeiss TIRF sürgü bağlanmıştır. Bir Z488RDC dikroik ayna (Chroma Technology Corporation, Falls, VT Bellows) bir Zeiss α-planı 100X objektif lens (NA = 1.46, Carl Zeiss) üzerine gelen lazer yansıtmak için kullanılmıştır. Bir ET525/50 emisyon filtre (Chroma Technology Corporation) GFP flöresanı tespiti için kullanılmıştır. Bir Evolve EMCCD kamera (Fotometrik, Tucson, AZ) detektör olarak kullanılmıştır. Bir 2.5X röle objektif mikroskop kamera portu ve kam arasındaki takıldıdönemi (100X NA = 1.46 objektif kullanırken piksel başına 0.064 mikron) optimal uzaysal çözünürlüğü elde etmek için. Kamera görüntüleme deneyler sırasında -80 ° C 'de muhafaza edilmiştir. VMM-D3 denetleyicisi (Vincent Associates, Rochester, NY) tarafından kontrol edilen bir Uniblitz LS6 deklanşör lazer kafası ve fiber başlatıcısı arasındaki entegre edildi. Veri μManager yazılımı (kullanılarak elde edildi http://www.micro manager.org / ).
Bütün deneyler görüntüleme CaCl2 2 mM aCSF çözelti içinde 37 ° C de yapıldı. Bu aCSF çözelti oda sıcaklığında, pH = 7.4 'e ayarlanır. 37. ısıtıldı ° C, bu aCSF pH'ı kültür nöronlar için optimum 7.2 olur. Satın alma sırasında lazer güç fotoğraf ağartıcı ve veri toplama için hem de maksimum ayarlanır. Kamera pozlama 100 msn olarak belirlendi ve alma hızı saniyede 10 görüntü (10 Hz) idi. EMCCD kazancı kuruldut maksimum. Kayıtlar ImageJ yazılım (Rasband, WS, NIH, kullanılarak analiz edildi http://rsb.info.nih.gov/ij/ , 1997-2012) ve ekleme olaylar kayıtlı ve manuel analiz edildi. Birim yüzey alanı başına dakika başına toplam etkinlik ekleme frekans olarak alınmış ve% 100 olarak kontrol grubu için normalize edildi. Yt işlenmiş görüntüleri y-ekseni boyunca orijinal xyt yığını 90 ° çevirerek ImageJ yılında oluşturulan ve her x hattının maksimum yoğunluğu ImageJ, maksimum intensite projeksiyon algoritması kullanılarak y ekseni tek bir piksel üzerine yansıtılan edildi.
9; Yerleştirme olaylar genelde plazma membranı 7 reseptör difüzyon temsil eden bir çürüyen fazı takip floresan punta (hızlı yükselen faz), aniden ortaya şeklinde izlenmektedir. Yavaş yükselen faz veya belirgin bir çürüme evresi olmayanlara floresan punta arasında görünümü (ani büBu olayların büyük olasılıkla daha az asidik lümen (örneğin endoplazmik retikulum gelenler gibi) sahip intraselüler veziküllerin ticareti temsil gibi Arance), veri analizi hariç tutulur. Önceden yüzey reseptörü popülasyonlarının Photobleach da plazma membranı üzerinde önceden mevcut olan yüzey reseptörü kümelenme katkı en aza indirecektir. Bugüne kadar, tüm veri ImageJ kullanarak manuel analiz edilmektedir. Otomatik olay algılama ve veri analizi için bilgisayar algoritmaları Gelecekteki Gelişimi plazma membran reseptör ekleme incelenmesi için bu görüntüleme yönteminin uyarlanması ve uygulanmasını kolaylaştırmak için önemli olacaktır.
PHluorin-etiketli reseptör bireysel olaylara vesiküler ekleme görselleştirmek için, birkaç önemli parametreler dikkate alınması gerekir. Birincisi, lazer uyarma tek veziküllerden floresans tespit etkinleştirmek için yeterince güçlü olması gerekiyor. Bizim özel tasarlanmış bir sistem, biz 10 kullanılır Bizim uyarma kaynağı olarak 0-mW 488 nm lazer. İkincisi, görüntüleme sistemi dedektör gerçek zamanlı, dinamik reseptör ekleme veri elde etmek için hassasiyet ve hız hem de sahip olması gerekir. Bu nedenlerden dolayı, bizim sistem içinde bir EMCCD kullanır. Güçlü bir uyarım lazer ve EMCCD dedektör kombinasyonu bizim görüntüleme sistemi tek GFP molekülü algılama yeteneği sunar. Özel tasarlanmış TIRF sisteminin Bizim seçim mevcut sınırlı kaynakların maksimum performans elde dayanmaktadır. Yeterli lazer uyarma gücüne sahip herhangi bir ticari TIRF sistemi dikkati çekiyor (100-mW 488 nm lazer bizim amacımız için yeterli olduğunu ve çoğu ticari platformlarda hazır) ve EMCCD kamera aynı zamanda görüntüleme için uygun olmalıdır çalışmaları. Dolayısıyla, nöronlar için böyle görüntüleme çalışmalarının uyum TIRFM sistemin performansı ile sınırlıdır, ancak nöronal kültür ve nöronal kültürlerin tutarlılık kalitesini tarafından.
ove_content ">, Üçüncü gelen ilk floresans nedeniyle plazma membran reseptörleri TIRF modu altında photobleach genellikle tek bir vezikül gelen floresans tespiti için gerekli pHluorin etiketli. Biz normalde maksimum TIRF görüntüleme modunu kullanarak 1 dakika photobleach gerçekleştirmek mevcut Bir nöron görsel olarak tanımlanır kez lazer gücü, hangi önceden mevcut yüzey pHluorin floresans çoğunluğu ortadan kaldırılması ile sonuçlanır. Yüksek lazer uyarma gücü de lazer hasar ve fototoksisite olasılığını artırır akılda tutmak da önemlidir. Deneyimlerimiz , uyarma kaynağı tek veziküllerde reseptörleri görselleştirmek için yeterli lazer gücünü sağlarken, veri toplama süresi içinde nöronlar fark zarar tanıtmak için görünmüyor gibi 488-mW lazer 100-mW kullanarak. ilave önemli bir husustur ki farklılıklar Her kesede reseptör tipleri ve numaraları da lazer uyarma ihtiyacı etkileyecektir.Örneğin, daha önce 50 mW uyarma lazer 7 kullanılarak plazma membranına glutamat reseptör GluA1 subunit ekleme düzenlenmesi incelemek başardık. Biz bu çalışmada incelenen her vezikül benzer yöntemleri 12 kullanılarak başka bir grup tarafından yapılan tahmine benzer 56 ± 6 GluA1 molekülleri içerdiğini tahmin ediyoruz. DRD2 bizim yeni bir çalışmada, her vezikül 30 ± 1 molekülleri içerdiğini tahmin, ve 100 mW lazer bu çalışma için yeterli oldu. Bununla birlikte, canlı hücreleri, sadece birkaç reseptör molekülü (örneğin, 5-10) yeterli bir sinyal elde etmek için 100 mW daha yüksek bir lazer enerji gerektirebilir içeren bir vesikül incelenmesi de arka plan gürültüsünün yüksek düzeyde nöronlarda plazma zarı reseptörü yerleştirme görselleştirme için gürültü oranı. Duyarlılık ve uyarma gücü doğru dengeyi bulmak, başarılı bir çalışmanın planlanması için önemlidir.I TIRFM kullanılması,mage superecliptic pHluorin etiketlenmiş reseptörleri nöron reseptörleri 7-17 birkaç farklı türde uygulanmıştır. Ancak, mevcut yöntemin etiketlendi reseptörlerinin bir GFP molekülü ve aşırı ekspresyonu ile etiketleme reseptörleri dayanıyor akılda tutmak çok önemlidir. Bir membran proteini domeyni bir GFP molekülün bağlanması proteinin işlevini bozabilir ve bu nedenle bu etiketleme stratejisi önemli ölçüde soruşturma altında 9 proteinin işlevini bozabilir olmadığını doğrulamak için kritik olabilir. Ayrıca, bir aşırı ekspresyona reseptör olabilir veya endojen reseptörlerinin ticareti yöneten düzenleyici mekanizmaların tabi olmayabilir. Bağımsız yöntemleri bu nedenle görüntüleme aşırı ekspresyona pHluorin etiketlenmiş reseptörleri elde edilen sonuçlar doğrulamak için gereklidir. Örneğin, GluA1 bizim çalışmalarda ekleme 7, yüzey ekspresyonu ve endojen GluA1 reseptörlerinin sinaptik kaçakçılığı valide edildi uStandart immun / biyokimyasal yöntemlerle veya elektrofizyolojik yaklaşımlar şarkı. Özetle, bizim görüntüleme yaklaşımı, membran proteini kaçakçılığı için diğer standart yöntemleri ile birlikte, nöronların diğer membran proteinleri plazma membranı ekleme konusunda detaylı moleküler ve hücresel mekanizmaları diseksiyon vesile olması muhtemeldir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu eser Jackson Laboratory başlangıç fonları tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| purified bovine collagen solution (Purecol) | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO, by Life Technologies | 14185-045 | |
| penicillin-streptomycin (Pen Strep) | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| sodium pyruvate | GIBCO, by Life Technologies | 11360-070 | |
| DMEM High Glucose | GIBCO, by Life Technologies | 10313-021 | |
| fetal bovine serum (FBS) | |||
| GlutaMAX | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| papain | Worthington Biochemical Corp. | LS003126 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase I) | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.05% trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
| poly-l-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636-1G | |
| boric acid | Fisher Scientific | BP 168-500 | |
| Neurobasal Medium | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| heat inactive horse serum | GIBCO, by Life Technologies | 26050-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 019 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Culture Insert | EMD Millipore | PICM03050 |
References
- Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking. Neuron. 73, 482-496 (2012).
- Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic. Curr. Opin. Neurobiol. , (2012).
- Makuch, L., Volk, L., Anggono, V., Johnson, R. C., Yu, Y., Duning, K., Kremerskothen, J., Xia, J., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA. Neuron. 71, 1022-1029 (2011).
- Thomas, G. M., Lin, D. T., Nuriya, M., Huganir, R. L. Rapid and bi-directional regulation of AMPA receptor phosphorylation and trafficking by JNK. EMBO J. 27, 361-372 (2008).
- Lin, D. T., Huganir, R. L. PICK1 and phosphorylation of the glutamate receptor 2 (GluR2) AMPA receptor subunit regulates GluR2 recycling after NMDA receptor-induced internalization. J. Neurosci. 27, 13903-13908 (2007).
- Hayashi, T., Rumbaugh, G., Huganir, R. L. Differential regulation of AMPA receptor subunit trafficking by palmitoylation of two distinct sites. Neuron. 47, 709-723 (2005).
- Lin, D. T., Makino, Y., Sharma, K., Hayashi, T., Neve, R., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor extrasynaptic insertion by 4.1N, phosphorylation. 12, 879-887 (2009).
- Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 11080-11085 (2010).
- Li, Y., Roy, B. D., Wang, W., Zhang, L., Zhang, L. F., Sampson, S. B., Yang, Y. P., Lin, D. T. Identification of Two Functionally Distinct Endosomal Recycling Pathways for Dopamine D2 Receptor. Journal of Neuroscience. , (2012).
- Yu, Y. J., Dhavan, R., Chevalier, M. W., Yudowski, G. A., von Zastrow, M. Rapid delivery of internalized signaling receptors to the somatodendritic surface by sequence-specific local insertion. J. Neurosci. 30, 11703-11714 (2010).
- Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Distinct modes of regulated receptor insertion to the somatodendritic plasma membrane. Nat. Neurosci. 9, 622-627 (2006).
- Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., Leonoudakis, D., Panicker, S., Thorn, K. S., Beattie, E. C., von Zastrow, M. Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors. J. Neurosci. 27, 11112-11121 (2007).
- Ashby, M. C., De La Rue, S. A., Ralph, G. S., Uney, J., Collingridge, G. L., Henley, J. M. Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs. J. Neurosci. 24 (AMPARs), 5172-5176 (2004).
- Kopec, C. D., Real, E., Kessels, H. W., Malinow, R. GluR1 links structural and functional plasticity at excitatory synapses. J. Neurosci. 27, 13706-13718 (2007).
- Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64, 381-390 (2009).
- Makino, H., Malinow, R. Compartmentalized versus global synaptic plasticity on dendrites controlled by experience. Neuron. 72, 1001-1011 (2011).
- Wang, Z., Edwards, J. G., Riley, N., Provance, D. W., Karcher, R., Li, X. D., Davison, I. G., Ikebe, M., Mercer, J. A., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity. Cell. 135, 535-548 (2008).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).
