Summary
직접 intrahippocampal microinjection에 의해 hippocampally에 의존 공간 작업 기억의 변조는 함께하고 다음
Abstract
포도당 대사는 2 deoxyglucose 및 기능 자기 공명 영상과 같은 방법의 기초를 형성, 지역 신경 활동에 유용한 표시입니다. 그러나, 동물 모델에서 이러한 방법 중 하나를 사용하십시오 마취가 필요하며 따라서 모두 뇌의 상태를 변경하고 행동 조치를 방지 할 수 있습니다. 다른 방법은 깨어 억제 동물 포도당, 젖산, 관련 metabolites의 뇌 세포 외액 농도의 연속 측정을 할 생체 microdialysis에서의 사용이다. 특정 뇌 영역 및 / 또는 급성 약리 조작에 의존하도록 설계 작업과 결합 할 때이 기술은 특히 유용합니다, 예를 들어, 공간 작업 기억 과제 (자연 교대) 동안 hippocampal 측정은 젖산의 세포 포도당과 상승에서 수영을 표시 강화 작용의 1,2, 그리고 intrahippocampal 인슐린 행정의 암시는 메모리를 향상시키고 hippocampal 글리콜을 증가 모두ysis 3. 이러한 인슐린과 같은 물질 metabolites를 측정하는 데 사용되는 동일한 microdialysis 프로브를 통해 해마에 전달 될 수 있습니다. hippocampal 함수의 조치로 자연 교대의 사용은 작업 성능과 신진 대사를 모두 변경할 수있는 모든있는 스트레스 동기 부여 (예 : footshock), 규제, 또는 보상 (예 : 식품)에서 모든 혼란을 방지하도록 설계되어,이 작업은 또한을 제공합니다 치료의 특이 현상 효과에 대한 제어를 허용하는 모터 활동 측정합니다. 결합,이 방법은 행동을 규제 neurochemical과 신진 대사 변수의 직접 측정을 허용합니다.
Protocol
1. 수술 준비
- 처리. 동물 (마취에 대한 예를 들어 가장 많이 쥐 또는 마우스, 행동 테스트와 microdialysis 및 조합에 대한 방법은 크게 필요로하는 필수 종의 특정 적응과 일반 하나입니다 있지만은) 적어도 10 분 / 일의 최소 처리됩니다 수술하기 전에 이틀 이요. 광범위한 처리가 가능한 혼란 2,4,5을 피하고 테스트시 강세 상태에서 동물을 떠날 표시되었습니다. 우리는 예를 들어 종으로이 프로토콜을 통해 쥐를 사용합니다. 이것은 가장 시설 수의사 및 직원 건강 관리와 상담에 맨손을 사용하여 달성 될 수있다 : 처리가 예 : 라텍스 또는 니트릴 장갑에서 모피를 당기는으로 인한 스트레스없이 수행되어야합니다. 이 불가능할 경우, 부드러운면 장갑은 쥐 '모피 당겨 방지하기 위해 장벽 장갑 위에 착용해야합니다.
- 멸균 필드 준비. 전에 수술을 시작 surgic에야외 공간은 쥐의 체온을 유지하기 위해 사용되는 가열 패드를 덮고, stereotaxic 장치 및 장치에 걸쳐 배치 무균 드레이프 주위에 준비를 살균 필드를 준비가되어 있습니다. 정확한 온도 조절과 순환 온수 패드는 동물의 과열 방지하는 데 사용됩니다.
- 마취 유도. isoflurane vaporizer는 isoflurane의 최적 수준을 포함 확인하고 유도 챔버에 연결되어 있습니다. 연결은 폐쇄 루프 확인을 위해 선택되어 있는지 확인하십시오. 공기 처리 진공 시스템은 작동 할 확인합니다. Isoflurane 기화가 켜져과 동물은 산소 혼합의 5 % isoflurane을 사용하여 유도 챔버에 배치됩니다, isoflurane 5 % 100 % 산소 스트림에 추가하고 유도 챔버에 전달하게된다.
- 장치에 위치. 동물 earbars와 치아 바를 사용하여 stereotaxic 장치에 고정되어 있습니다. 올바른 earbar 게재 위치 고정되어 머리 결과와 earbars 따라 평평하게 놓인 귀. 동물빠르게 확보하고 코는 목적 설계 마취 nosecone에 삽입되며, 기화 isoflurane의 전달은 유도 챔버에서 nosecone로가는 산소 스트림에 isoflurane 2~3%를 제공하기 위해 조정 nosecone과 마취 믹스로 전환됩니다.
- 마취의 확인. 수술 마취 비행기는 발과 눈에 공기의 퍼프에 하드 핀치를 제공함으로써 확인,도 어떤 반응을 일으킬 것입니다. 이 시험은 수술 마취 비행기의 유지 보수를 확인하기 위해 수술 전역에 약 15 분 간격으로 반복됩니다. 머리 살균 필드를 입력하기 전에 절개 사이트에서 제거됩니다.
2. 외과
- 동물 초기 치료. 안과 연고는 건조를 방지하기 위해 각 안구에 적용됩니다. 한 ML 멸균 생리는 수술하는 동안 탈수를 방지하기 위해 SC를 제공하고 있으며, 몸은 무균 드레이프로 덮여 있습니다. Betadine은 두피에 적용하고, 센터에서 채취된다아웃 면봉으로, 70 %의 에탄올이 유사 채취하고 있으며, 두 보라고 단계가 적절한 절개 사이트를 보장하기 위해 두 번 더 반복된다. betadine 및 알코올에 대한 피부 접촉 시간은 절개하기 전에 적어도 3 분이어야합니다. 마취는 수술을 통해 유지하고 정기적으로 체크되어, carprofen 5g / kg)의 단일 SC 분사는 진통제를 시작하는 주어되며, 무균 기술이 사용됩니다. 진통제는 주사에서 모든 스트레스를 최소화하기 위해 마취의 유도에 따라 제공됩니다.
- 절개와 두개골 준비. 3-4cm 컷은 두개골의 중심부에 sagitally로 구성되어 있습니다. bupivicaine의 1:1 혼합 : 에피네프린은 또한 진통제를 제공하고 출혈을 최소화하기 위해 붙이기도 적용됩니다. 두피는 수술 클립, 멸균 면봉은 두개골에서 놓인의 세포막을 제거하는 데 사용됩니다를 사용하여 절개 멀리 개최됩니다. 드릴링을위한 좌표가 기준 포인트로 bregma를 사용하여 측정되며, 멸균 드릴 비트 (또는, 또는, 휴대용 소작 데비 사용 표시CE) 및 시추 시작하기 전에 정확성을 다시 확인했다. 관심 (예를 들어 여기에 해마)의 특정 뇌 영역의 좌표는 뇌지도 책을 사용하여 결정됩니다. hippocampal microdialysis를 들어, 우리는 bregma에 뒤 5.6 mm, 5.0 측면, 그리고 경질에서 3.0 복부에 드릴 사이트를 사용합니다.
- 시추. 세 구멍은 경질 및 기본 멤브레인에 외상을 최소화하거나 결석하는 등 최소한의 힘을 적용하는주의 촬영되고있는 두개골을 통해 교련 있습니다. 하나의 구멍이 캐뉼라 삽입 측정 사이트이며, 나머지 둘은 머리 나사의 삽입에 편리로 자리 매김하고 있습니다. 목적 사이즈 나사 (예 1.17 mm 셀프 태핑 나사, 정밀 과학 도구) 뇌를 아래에 영향을주지 않고이 구멍에 삽입되며, 이후 치과 시멘트 응용 프로그램에 대한 앵커 지점으로 사용됩니다.
- 캐뉼라 위치와 폐쇄. 캐뉼라는 구멍 교련의 사이트로 다시 확정 삽입 좌표,에서 위치그리고 천천히 대상 깊이로 낮아합니다. 일단 제대로 위치, 캐뉼라는 치과 시멘트와 장소에 고정된다. 필요한 경우, 하나의 무균 수술 봉합은 상처를 종료하는 데 사용됩니다. 탐침은 명백을 유지하기 위해 캐뉼라 삽입됩니다. 이 프로토콜에서 우리는 CMA12 프로브 및 가이드 캐뉼라 (CMA / Microdialysis)을 사용합니다.
- 급성 후 수술 치료. 3 ML 멸균 생리가 수화를 계속 SC 주어집니다, carprofen 5g / kg의 단일 SC 분사)도 진통제를 시작합니다 주어집니다. 그들은이 완전히 마취에서 회복 될 때까지 동물은 장치에서 삭제하고 따뜻하게 복구 방에 배치, 깨끗한 새장에서, 그리고 모니터링됩니다. 전체 복구 반사 및 일반 운동을 righting의 복원에 의해 평가된다. 동물 그런 다음 자신의 홈 케이지와 일반 지주 방으로 돌아갑니다.
- 단기 후속 중요하다. 수술을받은 동물 케이지는 수술 날짜가 표시됩니다. 동물은 적어도 thr 최소 하루에 한 번 모니터링EE 일 수술에 따라, 그리고 수술 다음 두 일의 각 다음 날에 하나 carprofen 씹기 편한 정제 (2 밀리그램)를 제공. 동물 carprofen를 소비하지 않는 경우, injectable carprofen는 적절한 진통제을 보장하기 위해 제공 될 수 있습니다. 동물의 전반적인 건강과 기관 동물 케어 지침에 따라하고 필요한 경우 동물 보호 직원 또는 수의사의 도움이나 조언을 요구하는 상처 부위 (감염, 빨갛게 등)의 상태를 모두 모니터링 할 수 있습니다. 중요한 것은, 실험에 적합한 핸들링과 acclimation이 반드시 필요하다는 점을 참고 : 실험에 의해 처리하면 신경질 나 스트레스의 흔적은 남아 없을 때까지 동물은 캐뉼라의 조작을 포함하여 광범위하게 취급해야합니다.
- 후속 동물 보호 및 치료. 동물 승인 된 프로토콜과 특정 실험 집단에 따라 적절한 검사와 안락사 절차를 따를 것이다.
3. Microdialysis (MD)
- Perfus준비를 먹었다. 인공 세포 외액 (aECF)이 153.5 밀리미터 오세영, 4.3 MM K, 0.41 MM MG, 0.71 MM CA, 139.4 MM 망할 CIA, 1.25 MM 포도당, 산도 7.4 6 버퍼로 구성되어 있습니다 참고 정확한 유체의 조성이 필수적입니다 :. 부정확 한 내용이나 사용 이러한 벨소리의 또는 microdialysis에 대한 PBS와 같은 다른, 덜 생리적 체액의 현저하게 잘못된 결과 6 될 것이다. 특히, 우리가 hippocampal ECF 6 2004 년 세부 연구에서 보여 주었다으로 세포 외액 (ECF)의 이온 조성, CSF의 동일한되지 않습니다. 테스트 당일에 소 혈청 알부민은 (BSA) 2 %의 중량 / 체중 추가하고 완전히 용해되어야한다,이는 준수의 튜브에 인슐린과 같은 펩티드의 손실을 줄일 수 있으며, 또한 유체 손실의 위험 (ultrafiltration)를 감소 프로브 막에서. 준비 후, perfusate는 0.2 μm 필터를 통해 필터링해야합니다.
- 이러한 인슐린 등의 치료는 브래지어에 전달하는 경우관심 (여기 해마)의 영역에서, 적절한 약물 농도로 준비된 aECF의 나누어지는를 사용하여이 치료를 준비합니다. 인슐린의 경우, 역 microdialysis를 통해 전달 400 nm의 농도 (66.7 μU / μl)을 hippocampal 신진 대사 및인지 기능 7에 영향을 보여왔다. 인슐린의 결과 조직 농도가 여기 측정하고 알 수없는 남아되지 않습니다.
- MD 프로브 및 라인을 설정합니다. 신선한 microdialysis 프로브 및 회선 테스트하기 전에 하루를 준비합니다. "유입"과 "유출"에 대한 두 개의 별도 행을 만듭니다. FEP 튜브의 두 1m 길이 조각을 연결하고 줄 사이에 최소한의 죽은 공간이되도록 PE50 튜브를 사용하십시오. 멸균 - 필터링, deionized H 2 0 (2 0 DH)로 가득 1 ML 해밀턴 주사기로 유입 관을 연결 한 다음 프로브에 연결합니다.
- Microdialysis의 회전. 측정하면서 무료로 동물의 움직임을 허용하려면, 내가에 액체 회전을 연결nflow과 유출 라인을 추가 FEP 관을 사용하여 펌프를 닫습니다. 샘플 컬렉션의 타이밍 (아래)를 고려에 계정에이 회전과 튜브의 내부 볼륨을 챙기는 것을 잊지 마세요.
- MD 펌프를 설정합니다. MD 펌프를 켜고과 2 0 프로브에 유출 관을 종료 DH가 나타날 때까지 1.5 μl / 분에서 실행합니다. 펌프가 꺼져있는 동안 그런 다음, 유출 관 및 샘플 수집 튜브 사이의 다른 선을 연결합니다. 튜브를 통하여 5 ML을 실행하고 하루 아침에 무균 DH 2 0를 포함하는 병에 프로브를 배치, 프로브 팁은 항상 축축 남아 있는지 확인합니다.
- 사전 프로빙 테스트 대상입니다. 테스트하기 전에 24 시간은 쥐의 머리에서 더미 탐침을 제거하고 10 분 동안 MD 프로브를합니다 (샘플링에 대해,이 목적으로 만 사용) 삽입합니다. 그런 다음 더미 탐침을 대체하고 케이지에 다시 쥐를 넣어. 이 절차는 8 테스트의 날에 우리의 손에는 반응 gliosis의 영향을 최소화하도록 설계되어,이 좋은 resul를 제공합니다TS 다른 기술에서 데이터와 일치 hippocampal 활성화 2,5,7,9를 반영하는 것으로, 다른 사람들은 또한 좋은 방법입니다 측정, 이전 24 시간에 장소에 프로브를 떠나는 비슷한 접근 방식을 사용한 경우에 손상 프로브는 하루 아침에 방지 할 수 있습니다.
- 프로브 평균. microdialysis의 날, 필터링 aECF와 해밀턴 주사기와 섬광 약병을 입력 1 시간에 평형까지 펌프. 필요한 경우, 주사기 펌프에 준비 처리 (예를 들어, 인슐린 aECF)과 장소와 두 번째 해밀턴 주사기를 작성하십시오.
- 프로브 삽입. 평균이 완료되면 더미 탐침을 제거하고 부드럽게 캐뉼라를 통해 쥐의 뇌에 equilibrated MD 프로브를 삽입합니다. 쥐의 홈 침구의 일부를 포함하는 투명한 플라스틱 상자에 쥐를 놓습니다. 중력이 microdi을 유지하는 방식으로 우리를 외부 튜브에 물이 가득 1.6 ML의 microcentrifuge 튜브를 첨부 : 튜브가 균형을 맞출해야합니다alysis 라인 unkinked하지만 긴장 없습니다. 탐사선이 2 시간에 쥐에 평형 보자. 이 기간의 시작에서 perfusate의 흐름을 확인 차단 해제 :이 방법은 가장 쉽게 정의 기간 동안 perfusate 유출를 수집하고 예상 볼륨이 시스템을 종료되었는지 확인하기 위해 샘플을 무게에 의해 이루어집니다. 수율은 <90 예상 볼륨의 % 및 제거 및 재 삽입 한 후 자체 해결되지 않는가 교체해야하는 모든 프로브 (프로브 팁에서 그렇지 않으면 부종이 발생합니다.) 흐름이 지속적으로 낮거나 결석을하게되면 누수에 대한 모든 연결을 확인하고, 막힘이 분리 될 수 있는지 여부를 확인 단계에서 튜브를 분리하는 실패. 문제가 확인되지 않은 경우 프로브를 교체하고, 문제가 해결되지 않는 경우, 새로운 프로브 및 제 3.3 대사와 함께 새로이 시작해야 할 수 있습니다. 두 시간 평균 기간은 프로브 주위에 봉인 및 프로브 삽입의 급성 효과를 방지 할 수있는 혈액 뇌 장벽을 할 수 있습니다.
- 샘플을 수집. 확인이 공동샘플 투석 (뇌에서) 및 수집 (관에) 사이 rrelation이 정확하게 계산됩니다. 예를 들어, 회전 및 프로브 사이의 FEP 튜브 2 미터의를 사용하여 프로브 및 30 μl를 수집 사이의 총 볼륨이 있으며, 따라서 그것은 프로브, 튜브, 커넥터 통과 1.5 μl / 샘플에 대한 분 유속으로 20 분 소요 및 수집에 대한 튜브의 끝 부분에 도달 할 스위블. 수집 샘플 귀하의 assays에 필요한 농도가하기에 충분한 볼륨을 수집하도록합니다. 여기, 우리는 각 그룹 관 dialysate의 7.5 μl를 수집하므로 5 분 샘플 용기를 사용합니다.
- 기본 샘플. 평균이 완료되면, 샘플 수집을 시작합니다. 쥐가 측정의 안정 기준을 설정하는 홈 챔버에 휴식하는 동안 적어도 세 샘플을 수집
- 치료 타이밍. 이전 실험 치료 개시에 필요한 시간을 계산하는데주의를 기울여야 : 투석 사이의 시간 지연이와 마찬가지로 기억및 샘플 컬렉션은, perfusate 주사기를두고 있으며 동물의 해마에 도착 사이의 지연 (보통 동일)가 있습니다. 따라서, 주사기와 프로브 사이에 30 μl 볼륨과의 설정에, 당신이 해마에 도착 시작 치료를하고자하기 전에 포함하는 치료 - perfusate 20 분에 주사기를 변경합니다.
- 주사기를 변경합니다. 원하는하지만 필요하지 않을 경우 액체 스위치를 사용할 수 있습니다 : 적절한 시간에, 간단히 제어 perfusate의 주사기에서 유입 라인을 분리하고 빠르게 치료 - perfusate 주사기에 연결합니다. 이 perfusate 흐름에 큰 방해를 피하기 위해 더 이상 5 초를해서는 안됩니다. 치료 시간 제한 전달이 원하는 경우 원하는 용량가 전달 된 후에이 과정이 반대해야합니다. 또는 치료 (그림 2 참조) 샘플링 기간 동안 계속 사용할 수 있습니다. 기포가의 전환시 라인에 도입되어서는 안됩니다주사기, 그들은 투석 막에 축적 및 프로브의 효율성을 줄일 수 있습니다.
- 행동 테스트. 행동 작업을 수행하는 경우 (아래 4 항 참조) 그 절차를 수행하십시오. 참고 해마에 치료의 전달과 조정이 중요하다고. 예를 들어, 인슐린 전달 전에부터 테스트를 10-10 분 발생 시간이 초과해야합니다. 따라서, 인슐린 함유 perfusate에 스위치가 동작 테스트하기 전에 30 분 (perfusate 20 분 선 추가로 10 분을 통해 앞서 테스트 원하는 배달 시간을 통과하는)가 발생한다.
- 샘플 수집 완료. 원하는 샘플을 수집 한 후, 부드럽게 다시 투석 및 샘플 수집 사이의 계정 시간 지연에 취할 기억, 동물의 머리에서 프로브를 제거합니다. 원래 케이지에 동물을 반환하고 동물이 살해 뇌가 올바른지 확인하기 위해 제거 될 때까지 건강이나 행동에서 후 실험 변경 세심히 관찰프로브 배치. 희생이 즉시 발생하지 않을 경우, 외국 자료의 도입을 방지하기 위해 캐뉼라에 더미 탐침를 반환합니다.
- 분석. 분석 방법론은 관심 analyte (들)에 따라 달라질 수 있습니다. 투석 샘플링 프로브 막에서 전체 analyte의 평균을 허용하지 않기 때문에, 샘플 농도가 제로 넷 - 자속 방법 11,12을 사용하여 ECF 농도를 제공 수정해야합니다.
4. 행동 테스트
- 미로에 게재. (적어도 세 시료를 투석을 완료했지만, 여전히 수집되는 유출 관에있을 수 있습니다 후 예) 기본 샘플 후, 부드럽게 행동 테스트 장치에 쥐를 이동합니다. 모든 해당 작업을 사용할 수 있습니다, 그림 1의 데이터는 4 팔 플러스 모양의 미로를 사용하고 공간 작업 기억을 측정하기위한 한 방법입니다 자연 교대를 측정 수집되었습니다 쥐가 처음 CEN에 배치됩니다자유롭게 9,13 여행 미로의 적이과 허용됩니다. 어떤 행동 테스트가 사용될 수 있기 때문에이 프로토콜의 초점이 여기 예제 (다른 곳에서 9,14,15 설명되어있는)로하지만, 간단한에서 사용하는 특정 작업에없는, 동물 (시대의 미로를 탐험하도록 허용 회색 그림 1 상자)과 팔의 메모리를 유지하기 위해 hippocampally 종속적 인 프로세스를 사용하여 최근 방문한되었습니다.
- 테스트 기간 동안 투석 튜브의 움직임. 이 둘 쥐의 움직임을 방해하지 않고 동물의 앞에 이동하고 혼란 할 수되고, 자유롭게 이동되도록 튜브를 잡아. 장소에 남아 있어야하며 당신은 쥐의 행동에 영향을주지 않도록 자신의 움직임을 최소화합니다.
- 계속 샘플 모음입니다. 기준시로, 모든 5 분 새 컬렉션 관에 유출 관을 이동합니다.
- 교대 테스트. 동물이 자유롭게 20 분의 미로를 탐험 할 수 있습니다. 사용 중 팔 항목의 순서와 타이밍을 기록비디오 녹화 이상 작업 성능 분석 9,15에 손으로.
5. 포스트 테스트
- 최종 샘플 모음입니다. 테스트 후, 미로와 챔버를 제어 할 반환에서 부드럽게 쥐를 제거합니다. 작업 성능에서 회복 기간을 충당하기 위해 최소한 네 샘플에 대한 microdialysis 샘플 컬렉션을 계속합니다.
- 프로브 제거. 모든 샘플이 수집 된 후, 부드럽게 스토리지 유리 병에 동물의 머리와 곳에서 프로브를 삭제하는 행위는 홈 케이지에 동물을 반환합니다.
- 프로브 저장. 홈 케이지에 동물을 반환하고 나머지 dialysate의 수집을 완료 한 후, DH 2 0과 DH 2 0로 가득하고 parafilm으로 덮여 섬광 병에 점포 철저하게 프로브를 씻어. 미생물의 성장을 방지하기 위해 DH 2 0에서 1:10,000 Kathon의 솔루션을 포함하는 주사기로 전환하여 튜브를 플러시. 사람들이 좋은 흐름을 유지하고있는 한 프로브는 한, 다시 사용할 수 있습니다막에 아무런 손상,주의이있는이 정기적으로 열 사용 초과 할 수 없습니다.
- 조직학. 동물을 죽이고, 뇌를 제거합니다. 그라 이오 스탯에 조각과 올바른 프로브 위치를 확인하는 표준 조직 학적 기술 (예를 들면 cresyl 보라색의 착색)을 사용합니다.
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Representative Results
쥐가 수술에서 빠르게 회복하고 마취의 30 분 다음에 정지에서, 경고 운동성 및 활성해야합니다. 수술이 정상적으로 수행되고 최소한의 치과 시멘트가 사용되는 경우 캐뉼라 캡의 영향을 최소화해야합니다. 감염의 흔적이 수술 모니터링 중에 발견, 또는 쥐가 실험을 종료 즉시 고통 또는 불편의 흔적을 보여주는 어떠한 방법에 경우,이 매우 드문해야합니다. 이전 테스트에 처리하는 동안, 동물은 경고 자유롭게 운동성, 친절하고 호기심이 있어야합니다. 잘 처리 동물 수술, 후 수술 회복, 또는 실험의 존재에서 남아 본질적으로 더 관찰 스트레스를주지 않습니다, 이것은 플라즈마 스트레스 호르몬의 측정에 의해 필요한 경우 확인 (에피네프린, glucocorticoids) 및 / 또는 포도당 2,4 될 수 있습니다 5.
뇌 ECF 포도당은 범위 0.5에 일반적 - 1.5 MM, 뇌 지역에 따라 변화, 높은 값 비록당뇨병 동물에서 볼 수 있습니다, 해마에 기준 포도당 농도는 1.25 MM 6,12의 가까운 순서에 있습니다. 모든 외인성 치료의 부재에서, ECF 포도당에서 수영 (그리고, 일반적으로, ECF 락트산의 상승)은 해당 작업 (예를 들어 그림 1 참조) 중재에 참여 뇌 영역에서 작업 수행 동안 볼 수 있어야합니다이 반영 증가 신진 대사 활동이인지 부하 9,14,16에 의해 유도. 비슷한 변경 사항은 특정 치료로 인슐린의 급성 투여 후 perfusate 7 (그림 2)에 추가로 예를 들어 본적이 지역의 신진 대사를 증가하는 증거로 이동 될 수 있습니다.
일반적으로 잘 처리 동물은 고통의 흔적과 함께하고 microdialysis 관의 인식의 흔적이없는 행동 테스트를 수행해야합니다 : 과도한 정리, 부동, 고통의 표시 또는 표시 프로브를 제거 할 수있는 동물의 시도의 흔적을프로브 사이트 주변 가능성이 충분 처리 및 / 또는 감염이, 그리고 그 실험을 종료 할 표시로주의해야한다.
인슐린 관리를받는 동물들은 높은 hippocampal 신진 대사 외에 뚜렷이 향상된 공간 메모리 7 표시합니다. 제어, 치료 동물 7,9,14 % 65 사이의 75 4 팔 미로의 평균 교대 성능이 있어야합니다.
그림 1. hippocampal ECF 포도당 (9 적응)에서 작업 - 관련 수영. 회색 상자가 자연 교대 (SA)에 미로 테스트 기간입니다. 자주색 선이없는 미로 테스트 (하지만 그렇지 않으면 동일하게 처리 한 사람)와 동물의 hippocampal 포도당을 보여줍니다. 레드 라인은 4 팔 SA 작업을 수행 동물의 측정이다; 오렌지 라인을 쉽게 수행 동물의 측정을 보여줍니다3 팔 SA의 버전입니다.
그림 2. perfusate에 포함 (7에서 적응)를 통해 인슐린을 투여 한 후 hippocampal 포도당과 젖산의 수선. 인슐린은 화살표로 표시된 지점에서 해마에 도달하고 이후 지속적으로 관리합니다. 동물없이 행동 조작과 함께 자신의 집 케이지에서 테스트되었습니다.
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Discussion
microdialysis에 사용 된 모든 솔루션은 0.2 μm 필터를 사용하여 즉시 사용 전에 필터링해야합니다. 가이드 캐뉼라로 프로브의 삽입 후, 그 흐름이 unimpeded입니다 및 샘플 수집이 발생 확인 관찰합니다. 흐름이 삽입 한 후 중지하면, 가능성이 가장 높은 원인은 삽입에 충분한 치료로 인한 프로브 막에 손상이며, 새로운 프로브 대체해야합니다.
위에서 언급으로,이 방법에 장점이 깨어 자유롭게 움직일 동물 행동 및 neurochemical 모두 조치를 허용, 혼란이 없다는 것입니다 :이 활용하기 전에 테스트에 다양한 핸들링은 동물이 기간 동안 스트레스가없는 것을 위해 필수적입니다 측정. 평균 기간은 일반적으로 안정적으로 신진 대사 기준을 제공하기에 충분하지만, 동물에 걸쳐 균일 한 혈당 수준을 보장하기 위해 필요한 경우 식품은 테스트 전에 1-2 시간이 삭제 될 수 있습니다.
일전자 샘플링 기법 등 MD의 두 가장 중요한 한계는 (i) 제한 analyte의 크기와 튜브의 접착에 의한 analyte의 손실에 대해 (II) 가능성이 있습니다. 전자는 큰 분자 무게 컷오프와 MD 프로브의 사용에 의해 어느 정도 완화 할 수 있습니다. 일반 상업 프로브는 최대의 분자가 아마 50 KD 상대적으로 unimpeded을 통과 할 할 수 있도록, 100 KD까지의 단절을 허용하지만, 가능한 프로브 팁에서 ultrafiltration을 통해 모든 샘플 손실을 최소화하는 것이 좋습니다 낮은 컷오프 멤브레인을 사용하지 않습니다. 튜브에 대상 분자의 접착은 주로 튜브를 FEP 및 따라서 analyte 복구 및 측정 정확도를 모두 줄이기 위해 준수하는 경향이됩니다 대부분의 펩타이드 측정의 경우에 문제입니다. :이 문제는은 (i) perfusate를 사용하는 어떤 2% 소 혈청 알부민이 차단 에이전트 역할을, 추가, 및 (ii) 반환 튜브의 길이를 최소화하여 된 튜브의 내부를 미리 치료하여 최소화 할 수 있습니다 경우 NE이 특히 행동 테스트하는 동안, 동물을 방해하지 않으면 서 수집 튜브를 스위칭에 추가 도전을 포즈하지만 eded, 경량 수집 약병은 가까이 프로브의 유출에 부착 할 수 있습니다. 기술의 장점은 샘플 세포 파편이나 효소 등 대형 분자의 무료 형태로 얻을 수 있다는 것입니다, 그리고 HPLC에 주입을 통해 일반적으로 직접 분석에 적합한, MS 또는 기타 분석 기기는 더 정화를위한 필요없이 그대로 - ,이 또한 많은 경우에 각 샘플에서 여러 analytes (예 : 그림 2에 표시된 포도당과 젖산 측정 등)의 분석을 할 수 있습니다.
약리 치료를 제공하는 역 microdialysis의 사용에 대한 유사은 여러 소스에서 사용할 수 듀얼 microinjection - microdialysis 프로브를 사용하는 것입니다. 그러나, 사출 포트의 구멍은 일반적으로 매우 좁고 차단하는 경향이 있으며, 정확하게하기가 어려울 수 있습니다타이밍 및 / 또는 치료 제공의 볼륨을 제어합니다. 이 대안은 따라서 만 perfusate에 포함을 통해 제공 의무가 없습니다 트리트먼트를 사용하는 것이 좋습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH / NIDDK (ECM에 DK077106)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
The majority of reagents are standard laboratory grade and can be obtained from a supplier of choice. Similarly, equipment such as syringe pumps and tubing can be used from any of several manufacturers. Specific items used here for which details are important include: |
|||
| CMA 12 microdialysis probes | CMA/ Microdialysis | CMA-12-XXX | These are available in various membrane lengths and cutoffs, indicated by specific codes in the 'XXX.' |
| Human insulin (Humulin) | Eli Lilly | N/a | |
| Liquid swivel | Instech | 375/D/22QM | This specific swivel has very low torque and internal volume, as well as a nonreactive quartz lining. |
References
- McNay, E. C., Fries, T. M., Gold, P. E. Decreases in rat extracellular hippocampal glucose concentration associated with cognitive demand during a spatial task. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (6), 2881 (2000).
- McNay, E. C., Gold, P. E. Age-related differences in hippocampal extracellular fluid glucose concentration during behavioral testing and following systemic glucose administration. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 56 (2), 66 (2001).
- McNay, E. C., McCarty, R. C., Gold, P. E. Fluctuations in brain glucose concentration during behavioral testing: dissociations between brain areas and between brain and blood. Neurobiol. Learn. Mem. 75 (3), 325 (2001).
- McNay, E. C., Gold, P. E. Extracellular glucose concentrations in the rat hippocampus measured by zero-net-flux: effects of microdialysis flow rate. 72 (2), 785 (1999).
- McNay, E. C., Sherwin, R. S. Effect of recurrent hypoglycemia on spatial cognition and cognitive metabolism in normal and diabetic rats. Diabetes. 53 (2), 418 (2004).
- McNay, E. C., et al. Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance. Neurobiology of Learning and Memory. 93 (4), 546 (2010).
- McNay, E. C., McCarty, R. C., Gold, P. E. Fluctuations in brain glucose concentration during behavioral testing: dissociations between brain areas and between brain and blood. Neurobiology of Learning & Memory. 75 (3), 325 (2001).
- McNay, E. C., Williamson, A., McCrimmon, R. J., Sherwin, R. S. Cognitive and neural hippocampal effects of long-term moderate recurrent hypoglycemia. Diabetes. 55 (4), 1088 (2006).
- McNay, E. C., Sherwin, R. S. From artificial cerebro-spinal fluid (aCSF) to artificial extracellular fluid (aECF): microdialysis perfusate composition effects on in vivo brain ECF glucose measurements. Journal of Neuroscience Methods. 132 (1), 35 (2004).
- McNay, E. C., et al. Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance. Neurobiology of Learning and Memory. 93 (4), 546 (2010).
- Benveniste, H., Drejer, J., Schousboe, A., Diemer, N. H. Regional cerebral glucose phosphorylation and blood flow after insertion of a microdialysis fiber through the dorsal hippocampus in the rat. Journal of Neurochemistry. 49 (3), 729 (1987).
- Benveniste, H., Diemer, N. H. Cellular reactions to implantation of a microdialysis tube in the rat hippocampus. Acta Neuropathologica. 74 (3), 234 (1987).
- McNay, E. C., Fries, T. M., Gold, P. E. Decreases in rat extracellular hippocampal glucose concentration associated with cognitive demand during a spatial task. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2881 (2000).
- McNay, E. C., et al. Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance. Neurobiol. Learn Mem. 93 (4), 546 (2010).
- Lonnroth, P., Jansson, P. -A., Smith, U. A microdialysis method allowing characterization of intercellular water space in humans. American Journal of Physiology. 1987, E228 (1987).
- McNay, E. C., Gold, P. E. Extracellular glucose concentrations in the rat hippocampus measured by zero-net-flux: effects of microdialysis flow rate. 72 (2), 785 (1999).
- Lalonde, R. obert The neurobiological basis of spontaneous alternation. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 26 (1), 91 (2002).
- Richman, C., Dember, W., Kim, P. Spontaneous alternation behavior in animals: A review. Current Psychology. 5 (4), 358 (1986).
- McNay, E. C., Canal, C. E., Sherwin, R. S., Gold, P. E. Modulation of memory with septal injections of morphine and glucose: effects on extracellular glucose levels in the hippocampus. Physiol. Behav. 87 (2), 298 (2006).
- McNay, E. C., Gold, P. E. Memory modulation across neural systems: intra-amygdala glucose reverses deficits caused by intraseptal morphine on a spatial task but not on an aversive task. Journal of Neuroscience. 18 (10), 3853 (1998).
- Rex, A., Bert, B., Fink, H., Voigt, J. P. Stimulus-dependent changes of extracellular glucose in the rat hippocampus determined by in vivo microdialysis. Physiol. Behav. 98 (4), 467 (2009).
